本發(fā)明涉及一種干酪乳桿菌來源的l-乳酸脫氫酶及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

苯乳酸(phenyllactateacid，pla)，系統(tǒng)名為2-羥基-3-苯基丙酸，是一種高值有機(jī)酸，其具有兩種對(duì)映異構(gòu)體：l-pla和d-pla。pla的分子式為c9h10o3，相對(duì)分子質(zhì)量為166.17，其性質(zhì)穩(wěn)定，熔點(diǎn)為121～125℃；pla在水中溶解度較好，并且其在水溶液中有較好的熱穩(wěn)定性。l-pla和d-pla都具有廣譜抑菌效果，可作為天然抑菌劑，替代化學(xué)合成的防腐劑，而且可經(jīng)聚合反應(yīng)合成聚苯乳酸新型高分子材料，替代聚乳酸高分子材料。因此，苯乳酸在化工、制藥、生物、材料和食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

pla可由多種微生物代謝產(chǎn)生，是菌體在代謝途徑中一個(gè)副產(chǎn)物，如大多數(shù)的乳酸菌如植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)等，也有一些真菌如白地霉(geotrichumcandidum)，熒光維克酵母(wickerhamiafluorescens)tk1可產(chǎn)pla，但現(xiàn)有的野生菌株自產(chǎn)pla的濃度很低。目前，pla可以通過化學(xué)和生物的方法合成，但由于化學(xué)方法苛刻的反應(yīng)條件、復(fù)雜的技術(shù)路線、副產(chǎn)物多不易分離，尤其對(duì)環(huán)境造成污染等缺點(diǎn)，生物合成法因其高效性，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，近年來受到廣大研究者的青睞。

已有研究表明，微生物中多種l-乳酸脫氫酶可不對(duì)稱還原苯丙酮酸生成l-pla，但是不同l-ldh不對(duì)稱還原苯丙酮酸的能力存在明顯差異，如賈江花等克隆表達(dá)了來源于植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)中的l1-ldh和l2-ldh基因，重組l1-ldh對(duì)苯丙酮酸的比活力為71.06u/mg，而重組l2-ldh對(duì)苯丙酮酸的比活力僅為0.06u/mg，并未測(cè)定其對(duì)映體純度。王穎等克隆了來源于bacillusmegateriumz2013513的ldhl基因并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，測(cè)得粗酶液對(duì)苯丙酮酸的酶活力為3.4u/mg。在37℃、200r/min條件下，25g/l(干重)重組菌經(jīng)60min將70.32mmol/l苯丙酮酸全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成50.59mmol/ll-pla，eep為96.89％，底物摩爾轉(zhuǎn)化率僅為71.94％。因此，利用分子生物學(xué)手段不斷挖掘出性狀優(yōu)良的l-ldh，對(duì)于獲得高純度，高產(chǎn)量的l-pla具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種來源于干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)的l-乳酸脫氫酶，lcldh1，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有苯丙酮酸還原活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述l-乳酸脫氫酶的基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主，表達(dá)seqidno.1所示的l-乳酸脫氫酶基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌以pet-22b(+)為載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主為e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供構(gòu)建所述基因工程菌的方法，是將seqidno.1所示基因與載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述載體為pet-22b(+)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主為e.colibl21(de3)。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供生產(chǎn)所述乳酸脫氫酶的方法，是將所述基因工程菌接種至lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600＝0.6～0.8，加入終濃度為0.3～0.5mmol/l的iptg誘導(dǎo)6～10h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)是在18～22℃進(jìn)行誘導(dǎo)。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供所述l-乳酸脫氫酶的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是以苯丙酮酸為底物，加入所述l-乳酸脫氫酶，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)l-苯乳酸。

在本發(fā)明的一種實(shí)施實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是向每1mmol/l苯丙酮酸中加入3mg含所述乳酸脫氫酶的重組濕菌體，于30～37℃200～220rpm條件下反應(yīng)30～120min。

本發(fā)明的有益效果：來源于干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)的l-乳酸脫氫酶基因序列克隆，l-乳酸脫氫酶工程菌的構(gòu)建以及重組l-乳酸脫氫酶的異源表達(dá)和活性測(cè)定的方法。本發(fā)明構(gòu)建的重組菌株e.coli/lcldh1在反應(yīng)80min后可不對(duì)稱還原10mmol/l苯丙酮酸生成8.59mmol/l的l-苯乳酸，產(chǎn)率為85.9％，對(duì)映體過量值(eep)>99％。純化的lcldh1對(duì)苯丙酮酸的比活性為294.2u/mg。

附圖說明

圖1為重組lcldh1的sds-page分析；其中，m:proteinmarker；1:e.coli/pet22b全細(xì)胞(對(duì)照菌)；2:e.coli/lcldh1全細(xì)胞；3純化后的lcldh1。

具體實(shí)施方式

lcldh1的活性測(cè)定：總反應(yīng)體系，包括50mmol/l乙酸鈉緩沖液(ph5.0)，0.2mmol/lnadh，8mmol/l苯丙酮酸，對(duì)照組中不含nadh，其他成分相同?；靹蚝笥?0℃保溫5min，加入適量的酶液。檢測(cè)nadh在340nm處吸收值的變化。酶活力單位(u)定義為：在上述條件下，每分鐘催化氧化1μmolnadh所需要的酶量。同時(shí)，采用bradford方法測(cè)定蛋白含量。

底物和產(chǎn)物的檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)束后，取一定量的轉(zhuǎn)化液加入甲醇終止反應(yīng)，進(jìn)行反相hplc分析：色譜柱為prontosilc18(150mm×4.6mm×0.25μm)，流動(dòng)相成分：0.05％三氟乙酸/水(a)和0.05％三氟乙酸/甲醇(b)混合液。梯度洗脫程序?yàn)椋?～15min20％～65％b；15～16min65％～100％b；16～19min保持100％b；紫外光檢測(cè)器，柱溫：30℃；流速1ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，ppa的保留時(shí)間11.372min，pla的保留時(shí)間為12.858min。

另取一部分轉(zhuǎn)化液于1ml乙酸乙酯中進(jìn)行萃取，上層有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂干燥后過0.22μm有機(jī)濾膜采用正相hplc進(jìn)行手性分析，色譜柱為daicelod-h(250mm×4.6mm)，分析條件為：流動(dòng)相為正己烷/異丙醇/三氟乙酸(98:2:0.05，v/v)，流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫：30℃，d-pla和l-pla的保留時(shí)間分別為33.896min，35.806min。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算對(duì)映體過量值：eep＝[l-pla-d-pla/(l-pla+d-pla)]×100％。

實(shí)施例1lcldh1基因的克隆與表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)l.caseibl23的l-ldh(cap07851)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列設(shè)計(jì)如下引物：

lcldh1-f：5’-catatggtggcaagtattacggataa-3’，含ndei酶切位點(diǎn)。

lcldh1-r：5’-ctcgagctgacgagtttcgatgtcatt-3’，含xhoi酶切位點(diǎn)。

提取干酪乳桿菌的總dna，以lcldh1-f和lcldh1-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr條件為：94℃4min；94℃30s，51℃30s，72℃1min10s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。將pcr產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pucm-t載體連接(pucm-t-lcldh1)，轉(zhuǎn)化入e.colijm109中，經(jīng)菌液pcr鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到lcldh1核苷酸序列。將測(cè)序結(jié)果正確的pucm-t-lcldh1與pet-22b(+)質(zhì)粒均用ndei和xhoi進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在t4dna連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pet-22b(+)-lcldh1，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。

實(shí)施例2重組菌e.coli/lcldh1的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

將pet-22b(+)-lcldh1轉(zhuǎn)化入e.colibl21(de3)中，經(jīng)含有amp的抗性平板篩選后，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于2ml含amp的抗性lb液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm搖床振蕩培養(yǎng)14～16h。按2％的接種量轉(zhuǎn)接于30ml相同培養(yǎng)基中，37℃220rpm搖床振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(od600＝0.6～0.8)，加入iptg至終濃度為0.4mmol/l，20℃220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體并用磷酸鹽緩沖液(ph＝7.0)洗滌數(shù)次，用于sds-page分析。以僅含空pet-22b(+)的菌株為對(duì)照，結(jié)果見圖1，重組菌e.coli/lcldh1(即e.colibl21(de3)pet-22b(+)-lcldh1)在36.4kda處具有大小與目的酶相同的蛋白條帶，對(duì)照菌沒有條帶。利用液相色譜測(cè)定lcldh1轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成pla的產(chǎn)量及測(cè)定產(chǎn)物的對(duì)映選擇性。對(duì)照組分別用僅含空pet-22b(+)和無iptg誘導(dǎo)的工程菌在相同條件下培養(yǎng)。8000rpm，5min收集菌體。加入一定量的破碎液(20mmol/ltris-hcl，500mmol/lnacl)，超聲破碎后，4℃，12000rpm，10min離心取上清液即為粗酶液，經(jīng)測(cè)定，其酶活為93.99u/ml。經(jīng)ni-nta親和層析和凝膠過濾層析純化破碎液，測(cè)定純lcldh1的比活性。經(jīng)測(cè)定，純化后的酶液的比酶活為294.2u/mg。

實(shí)施例3重組菌全細(xì)胞催化苯丙酮酸生成l-pla

于1ml離心管中加入300μl菌懸液(30mg濕菌體)和250μl磷酸鈉緩沖液(ph7.0)，37℃保溫5min，再依次加入50μl葡萄糖(終濃度50mmol/l)和400μl苯丙酮酸(終濃度10mmol/l)，反應(yīng)1h后，取200μl反應(yīng)液加入800μl甲醇終止反應(yīng)，過0.22μm有機(jī)濾膜，進(jìn)行hplc分析；另取200μl反應(yīng)液，用1ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取，上層有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后過0.22μm有機(jī)濾膜，進(jìn)行對(duì)映選擇性分析。結(jié)果顯示，當(dāng)體系反應(yīng)40min后，l-pla的濃度為5.62mmol/l，產(chǎn)率為56.2％，eep>99％，當(dāng)反應(yīng)80min后，苯丙酮酸完全被消耗，產(chǎn)生8.59mmol/l的l-pla，產(chǎn)率為85.9％，eep>99％。

對(duì)照例1

具體實(shí)施方式同實(shí)施例2，區(qū)別在于，用僅含空pet-22b(+)和無iptg誘導(dǎo)的工程菌在相同條件下誘導(dǎo)表達(dá)，按照實(shí)施例3測(cè)得兩種工程菌催化苯丙酮酸，獲得l-pla的濃度僅為0.32mmol/l和0.46mmol/l。

對(duì)照例2

合成編碼genbank登錄號(hào)為kte98134.1l-乳酸脫氫酶的基因序列，將該基因命名為lcldh2，按照實(shí)施例1的策略克隆該基因和構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pet22b(+)-lcldh2，引物設(shè)計(jì)為：

lcldh2-f:5′–catatgatggcaagaacaattggt–3′下劃線部分為ndeⅰ酶切位點(diǎn)

lcldh2-r:5′–ctcgagcttcattttttcaaaggtatc–3′下劃線部分為xhoⅰ酶切位點(diǎn)。

根據(jù)實(shí)施例2的策略，將lcldh2在e.colibl21(de3)中進(jìn)行異源表達(dá)，得到重組菌e.coli/lcldh2。將重組菌按照實(shí)施例2的步驟進(jìn)行異源表達(dá)得到lcldh2，按照實(shí)施例3將e.coli/lcldh2菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共同反應(yīng)1h后進(jìn)行液相檢測(cè)，結(jié)果產(chǎn)生3.5mmol/ll-pla，產(chǎn)率僅為35％，粗酶液的酶活力為47.3u/mg。

對(duì)照例3

合成編碼genbank登錄號(hào)為cap07856.1的基因序列，將該基因命名為lcldh3，按照實(shí)施例1的策略克隆該基因和構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pet22b(+)-lcldh3。

lcldh3-f:5′–catatgatgcggaacaacggcaatat–3′下劃線部分為ndeⅰ酶切位點(diǎn)

lcldh3-r:5′–ctcgagagcttcttgagccttcttca–3′下劃線部分為xhoⅰ酶切位點(diǎn)。

根據(jù)實(shí)施例2的策略，將lcldh3在e.colibl21(de3)中進(jìn)行異源表達(dá)，得到重組菌e.coli/lcldh3。將重組菌按照實(shí)施例2的步驟進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)得到lcldh3，按照實(shí)施例3的步驟將e.coli/lcldh3菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共同反應(yīng)1h后進(jìn)行液相檢測(cè)，結(jié)果產(chǎn)生2.7mmol/ll-pla，產(chǎn)率為27％，粗酶液的酶活力為42.5u/mg。

對(duì)照例4

按照實(shí)施例1，將lcldh1連接至pet28a(+)載體上，獲得重組質(zhì)粒pet28a-lcldh1，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入bl21(de3)中，得到重組菌bl21/pet28a-lcldh1并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，按照實(shí)施例3將bl21/pet28a-lcldh1菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共同反應(yīng)1h后進(jìn)行液相檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生l-pla的濃度和lcldh1的對(duì)映選擇性相比于e.colibl21(de3)pet-22b(+)-lcldh1并沒有提高。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>江南大學(xué)

<120>一種干酪乳桿菌來源的l-乳酸脫氫酶及其應(yīng)用

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>978

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtggcaagtattacggataaggatcaccaaaaagttattctcgttggtgacggcgccgtt60

ggttcaagttatgcctacgcaatggttttgcaaggtatcgctcaggaaatcggaatcgtt120

gacattttcaaggacaagacaaagggtgacgcgattgacttgagcaacgcgctcccattc180

acaagtcctaagaagatttattcagctgaatacagcgatgctaaggatgctgatctggtt240

gttatcacagctggcgctcctcagaagcctggcgaaactcgtttggacttggttaacaag300

aacttgaagatcttgaagtccattgttgacccaatcgttgattccggctttaacggtatt360

ttcttagttgctgccaacccagttgacattttgacctatgcaacttggaaactttctggc420

ttcccgaagaaccgggttgttggttccggtacttcactggacaccgcccgcttccgtcag480

tccattgctgaaatggttaatgttgacgctcgttcggtccacgcttacatcatgggcgaa540

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gaatgggttaaggctcatccagaaatcaaggaagacaagcttgttaagatgtttgaagac660

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tccgtttacatggatggtcaatatggcttgaacgacatctacatcggtaccccagctgtg840

atcaaccgtaatggtatccagaacatcctggaaatcccattgaccgatcacgaagaagaa900

tccatgcagaaatctgcttctcaattgaagaaggctctgaccgatgctttcgctaagaat960

gacatcgaaactcgtcag978

<210>2

<211>326

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

valalaserilethrasplysasphisglnlysvalileleuvalgly

151015

aspglyalavalglysersertyralatyralametvalleuglngly

202530

ilealaglngluileglyilevalaspilephelysasplysthrlys

354045

glyaspalaileaspleuserasnalaleuprophethrserprolys

505560

lysiletyrseralaglutyrseraspalalysaspalaaspleuval

65707580

valilethralaglyalaproglnlysproglygluthrargleuasp

859095

leuvalasnlysasnleulysileleulysserilevalaspproile

100105110

valaspserglypheasnglyilepheleuvalalaalaasnproval

115120125

aspileleuthrtyralathrtrplysleuserglypheprolysasn

130135140

argvalvalglyserglythrserleuaspthralaargphearggln

145150155160

serilealaglumetvalasnvalaspalaargservalhisalatyr

165170175

ilemetglygluhisglyaspthrglupheprovaltrpserhisala

180185190

asnileglyglyvalthrilealaglutrpvallysalahisproglu

195200205

ilelysgluasplysleuvallysmetphegluaspvalargaspala

210215220

alatyrgluileilelysleulysglyalathrphetyrglyileala

225230235240

thralaleualaargileserlysalaileleuasnaspgluasnala

245250255

valleuproleuservaltyrmetaspglyglntyrglyleuasnasp

260265270

iletyrileglythrproalavalileasnargasnglyileglnasn

275280285

ileleugluileproleuthrasphisglugluglusermetglnlys

290295300

seralaserglnleulyslysalaleuthraspalaphealalysasn

305310315320

aspilegluthrarggln

325

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

catatggtggcaagtattacggataa26

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

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ctcgagctgacgagtttcgatgtcatt27

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<212>dna

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