專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水溶性富勒烯及其制備應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是ー種水溶性富勒烯及其制備應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
作為碳元素的第三種同素異形體富勒烯家族的發(fā)現(xiàn)，是上世紀(jì)自然科學(xué)發(fā)展史最重要的突破之一。Kroto等三人也因?yàn)樗麄冊(cè)诟焕障┭芯恐虚_(kāi)創(chuàng)性的工作而榮獲1996年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。富勒烯(又稱(chēng)C6tl)以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)倍受人們重視，近十年來(lái)，幾乎全世界所有著名大學(xué)和研究所的科學(xué)家都進(jìn)行了與富勒烯有關(guān)的研究。它已成為當(dāng)今物理、化學(xué)、材料及生命科學(xué)研究者共同關(guān)心的課題。富勒烯分子的重要科學(xué)意義，被美國(guó)《Science》雜志評(píng)為1991年的“明星分子”。在納米材料中，包括富勒烯、碳納米管在內(nèi)的碳納米材料 一直是近年來(lái)國(guó)際科學(xué)的前沿領(lǐng)域之一。富勒烯是由60個(gè)碳原子組成的球形分子，包含12個(gè)五元環(huán)和20個(gè)六元環(huán)，直徑為O. 71nm。近年來(lái)，富勒烯在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究相當(dāng)引人矚目，研究發(fā)現(xiàn)富勒烯具有多種特殊的生物學(xué)效應(yīng)(I)可抑制多種酶的活性，包括HIV蛋白酶以及逆轉(zhuǎn)錄酶；(2)對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性；(3)具有神經(jīng)保護(hù)劑的作用；(4)還具有在可見(jiàn)光照射下產(chǎn)生氧自由基、切割DNA的作用。富勒烯作為ー種優(yōu)良的光敏劑表現(xiàn)在其在可見(jiàn)光照射的情況下可以產(chǎn)生活性氧，活性氧包括單線態(tài)氧、超氧負(fù)離子等。富勒烯光照下產(chǎn)生活性氧為高度反應(yīng)性的，并且可以表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，比如裂解細(xì)胞中的DNA，抑制細(xì)胞的有絲分裂以及生長(zhǎng)，還可以抑制細(xì)胞蛋白水解酶的活性。由此推斷，富勒烯可以用于腫瘤的治療。為此利用富勒烯作為光敏劑開(kāi)展光動(dòng)カ療法，即使其在腫瘤組織中蓄積，利用光照產(chǎn)生活性氧來(lái)選擇性的破壞腫瘤組織。目前，光動(dòng)カ療法在腫瘤治療中起到一定的輔助作用，為了更有效的治療腫瘤，可以使富勒烯作為光動(dòng)力治療的光敏劑的同吋，作為抗腫瘤藥物的載體。發(fā)揮光動(dòng)力治療和化學(xué)藥物治療相結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，更好的起到抗腫瘤作用。但由于富勒烯的碳籠結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)親脂性，使其在水等極性溶劑中的溶解度非常有限，限制了其在生物體系中的研究和應(yīng)用。為此，迫切需要設(shè)計(jì)并合成出水溶性好、光敏活性高、毒性小、生物相容性好、適合作為藥物載體的富勒烯衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供ー種水溶性富勒烯及其制備方法，可有效解決現(xiàn)有富勒烯可溶性差，光敏活性低，生物相容性差的問(wèn)題。本發(fā)明的技術(shù)方案是在富勒烯分子上通過(guò)化學(xué)鍵連接有水溶性聚合物聚こ烯亞胺水溶性富勒烯，所述的聚こ烯亞胺和富勒烯的重量比為O. 08-0. 12:1，所述的富勒烯為C60富勒烯，得到水溶性富勒烯；
所述的水溶性富勒烯的制備方法，由以下步驟實(shí)現(xiàn)
(I)將氨化試劑20ml和氫氧化鈉I. Og加入到60ml的水和無(wú)水こ醇的混合溶劑中，其中水和無(wú)水こ醇的體積比為1:5，攪拌均勻后逐滴加入到50ml的富勒烯甲苯溶液中，在400r/min的轉(zhuǎn)速下，30°C溫度下，攪拌7天使其反應(yīng)充分，除去上層的甲苯層溶液、水和無(wú)水こ醇混合溶液，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑甲醇抽濾洗滌15次后，40°C下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；所述的富勒烯甲苯溶液是由富勒烯姆Img加入甲苯Iml混勻制得；
(2)將步驟(I)所得的氨基富勒烯50mg與氮丙啶1ml、濃鹽酸10 μ I在ニ氯甲烷20ml中混合均勻，在40°C，轉(zhuǎn)速400r/min下攪拌回流48h，使其充分反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑ニ氯甲烷抽濾洗滌20次，40°C下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚こ烯亞胺聚合物，即水溶性富勒烯；
所述的濃鹽酸體積濃度為37-38% ； 所述的氨化試劑為こニ胺、1，3-丙ニ胺、1，6-己ニ胺中的ー種。本發(fā)明制備的水溶性富勒烯不會(huì)對(duì)富勒烯本身的特性進(jìn)行破壞，水分散性強(qiáng)，對(duì)生物體的毒性低，物理及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備方法簡(jiǎn)單，制備的條件容易滿(mǎn)足，原料來(lái)源豐富，成本低，并可作為光敏劑和藥物載體制備治療癌癥的藥物。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I
(1)將こニ胺20ml和氫氧化鈉I.Og加入到60ml水和無(wú)水こ醇的混合溶劑中，其中水和無(wú)水こ醇的體積比為1:5，攪拌均勻后逐滴加入到50ml重量體積比為lmg/ml的富勒烯甲苯溶液中，在400r/min的轉(zhuǎn)速下，30°C溫度下，攪拌7天使其反應(yīng)充分，除去上層的甲苯層溶液、水和無(wú)水こ醇混合溶液，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑甲醇抽濾洗滌15次后，40°C下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；
(2)將步驟(I)所得的氨基富勒烯50mg與氮丙啶Iml、濃鹽酸10μ I在ニ氯甲烷20ml中混合均勻，在40°C，轉(zhuǎn)速400r/min下攪拌回流48h，使其充分反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑ニ氯甲烷抽濾洗滌20次，40°C下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚こ烯亞胺聚合物，即水溶性富勒烯。實(shí)施例2
(1)將1，3-丙ニ胺20ml和氫氧化鈉I.Og加入到60ml水和無(wú)水こ醇的混合溶劑中，其中水和無(wú)水こ醇的體積比為1: 5，攪拌均勻后逐滴加入到50ml重量體積比為lmg/ml的富勒烯甲苯溶液中，30°C，400r/min下攪拌7d使其反應(yīng)充分。除去上層的甲苯層溶液、水和無(wú)水こ醇混合溶液，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑甲醇抽濾洗滌15次后，40°C下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；
(2)將步驟(I)所得的氨基富勒烯50mg與氮丙啶Iml、濃鹽酸10μ I在ニ氯甲烷20ml中混合均勻，在40°C，轉(zhuǎn)速400r/min下攪拌回流48h，使其充分反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑ニ氯甲烷抽濾洗滌20次，40°C下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚こ烯亞胺聚合物，即水溶性富勒烯。實(shí)施例3
(I)將1，6-己ニ胺20ml和氫氧化鈉I. Og加入到60ml水和無(wú)水こ醇的混合溶劑中，其中水和無(wú)水こ醇的體積比為1: 5，攪拌均勻后逐滴加入到50ml重量體積比為lmg/ml的富勒烯甲苯溶液中，30°C，400r/min下攪拌7d使其反應(yīng)充分。除去上層的甲苯層溶液、水和無(wú)水こ醇混合溶液，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑甲醇抽濾洗滌15次后，40°C下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；
(2)將步驟(I)所得的氨基富勒烯50mg與氮丙啶Iml、濃鹽酸10 μ I在ニ氯甲烷20ml中混合均勻，在40°C，轉(zhuǎn)速400r/min下攪拌回流48h，使其充分反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑ニ氯甲烷抽濾洗滌20次，40°C下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚こ烯亞胺聚合物，即水溶性富勒烯。本發(fā)明的第一個(gè)目的就是提供一種新型的水溶性富勒烯一富勒烯聚こ烯亞胺聚合物。本發(fā)明的第二個(gè)目的就是提供上述富勒烯聚こ烯亞胺聚合物的制備方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的就是提供上述富勒烯聚こ烯亞胺聚合物作為光敏劑在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的就是提供上述富勒烯聚こ烯亞胺聚合物作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
ー種富勒烯聚こ烯亞胺聚合物，它是在原始的富勒烯經(jīng)過(guò)純化處理的基礎(chǔ)上，與氨化試劑反應(yīng)，將富勒烯表面連接上反應(yīng)活性較強(qiáng)的氨基后，再與氮丙啶反應(yīng)，在質(zhì)子化氫離子的存在下，氮丙啶不斷的在氨基上進(jìn)行接枝，最終在富勒烯表面形成聚こ烯亞胺(PEI)樹(shù)枝狀聚合物。該富勒烯聚こ烯亞胺聚合物中，聚こ烯亞胺和富勒烯的質(zhì)量含量比為
O.08-0. 12:1。本發(fā)明的第二個(gè)目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
ー種富勒烯聚こ烯亞胺聚合物的制備方法，它包括以下步驟
I)將氨化試劑和氫氧化鈉加入混合溶劑A中，攪拌均勻后逐滴加入富勒烯的B溶液，充分?jǐn)嚢枋狗磻?yīng)充分。除去上層的有機(jī)溶劑B層溶液，蒸除混合溶劑A，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑C洗凈后，抽真空干燥，得到表面帶有氨基的富勒烯。2)將上述帶有氨基的富勒烯、氮丙啶和濃鹽酸在有機(jī)溶劑D中混合均勻，攪拌使其充分反應(yīng)，經(jīng)有機(jī)溶劑E洗浄后，真空干燥，得到表面接枝形成聚こ烯亞胺的富勒烯聚こ烯亞胺衍生物。上述步驟I中富勒烯為50mg ;氫氧化鈉為Ig ;氨化試劑為20ml ;混合溶劑A為60ml ;有機(jī)溶劑B為50ml ;有機(jī)溶劑C為500ml ;攪拌條件為400r/min，30_50°C，時(shí)間為l-7d ;真空干燥的條件為在20-60°C真空干燥24-56h。上述步驟I中的氨化試劑為こニ胺、1，3-丙ニ胺、1，6-己ニ胺中的ー種 上述步驟I中混合溶劑A由水和無(wú)水こ醇組成，其中水和無(wú)水こ醇的比例為1:5。上述步驟I中有機(jī)溶劑B為甲苯、苯、四氫呋喃中的ー種，或?yàn)槿我獾幕旌衔?。上述步驟I中有機(jī)溶劑C為無(wú)水こ醇。上述步驟2中含氨基的富勒烯為50mg ;氮丙啶為Iml ;濃鹽酸為IOul，有機(jī)溶劑D為20ml ;有機(jī)溶劑E為500ml ;攪拌條件為400r/min，40_60°C下回流，攪拌48h ;有機(jī)溶劑E洗凈的條件為加入有機(jī)溶劑E 50-100ml，超聲O. 5_lh，再通過(guò)O. 45um的尼龍微孔濾膜抽濾，并用20ml溶劑E潤(rùn)洗濾餅；將濾餅轉(zhuǎn)入500ml的燒杯中，加入溶劑E 50_100ml，超聲O.5-lh后再通過(guò)O. 45 μ m的尼龍微孔濾膜抽濾，并用20ml溶劑E潤(rùn)洗濾餅，如此重復(fù)操作5-10次；真空干燥的條件是在20-60°C真空干燥24-72h。上述步驟2中有機(jī)溶劑D為ニ氯甲烷。上述步驟2中有機(jī)溶劑E為ニ氯甲烷。本發(fā)明的第三個(gè)目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
富勒烯聚こ烯亞胺聚合物作為光敏劑在腫瘤治療中的應(yīng)用分為體外和體內(nèi)兩部分
O將制得的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物溶于水中制成溶液，加入到癌細(xì)胞A中進(jìn)行培 養(yǎng)，給藥后3h后用光源B光照，光照30-120min，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定癌細(xì)胞A的存活率。2)將制得的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物溶于水中制成溶液，靜脈注射到荷瘤小鼠C體內(nèi)，給藥后3h后用光源D光照，光照時(shí)間為30-120min，測(cè)量荷瘤小鼠C的腫瘤體積大小。上述步驟I中的癌細(xì)胞A為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巣癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的ー種。上述步驟I中的光源B為400-800nm波長(zhǎng)的寬波長(zhǎng)光源或者激光中的ー種。優(yōu)選532nm激光。上述步驟2中的荷瘤小鼠C為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的ー種。上述步驟2中的光源D為400-800nm波長(zhǎng)的寬波長(zhǎng)光源或者激光中的ー種。優(yōu)選532nm激光。本發(fā)明的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物作為光敏劑來(lái)進(jìn)行光動(dòng)カ治療體內(nèi)深度腫瘤時(shí)，這些光源不能夠穿透照射時(shí)，可以通過(guò)適用與所述部位的方法來(lái)改善外部光源照射的穿透力進(jìn)行腫瘤的治療。本發(fā)明的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物作為光敏劑可以制成任意的藥物制劑劑型，作為光敏劑應(yīng)用在光動(dòng)カ治療腫瘤的藥物中。比如注射劑、注射用無(wú)菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物可以加入各種制劑的添加剤，比如生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為靜脈注射、肌肉注射、瘤內(nèi)注射和皮下注射、透皮給藥、體內(nèi)植入方式等。本發(fā)明的第四個(gè)目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
富勒烯聚こ烯亞胺聚合物作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤治療中的應(yīng)用，分為以下幾個(gè)步
驟
I)將制得的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物和抗腫瘤藥物A通過(guò)方式B進(jìn)行結(jié)合。2)將裝載藥物的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞C和體內(nèi)的抗腫瘤D的評(píng)價(jià)。上述步驟I中的抗腫瘤藥物A為難溶性抗腫瘤藥物、水溶性藥物和核酸藥物，比如多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、寡義反核苷酸、小干擾RNA和酶類(lèi)藥物中的ー種或幾種。上述步驟I中的方式B為超聲、攪拌、探超和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)中的ー種或幾種。上述步驟2中的腫瘤細(xì)胞C為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的ー種。上述步驟2中的腫瘤D為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巣癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的ー種。 本發(fā)明的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以更多的分布在腫瘤組織中，與正常組織相比，它可以長(zhǎng)期的高濃度的保留在腫瘤組織中，這樣當(dāng)采用適當(dāng)?shù)氖侄问褂霉庠催M(jìn)行照射時(shí)能夠在腫瘤組織中產(chǎn)生更多的活性氧，并且可以使其裝載的藥物在腫瘤部位濃度提高。但也會(huì)分布在正常的組織器官中，為了避免產(chǎn)生的活性氧對(duì)正常組織產(chǎn)生損傷，可以通過(guò)ー些手段來(lái)加以改善，比如可以在富勒烯聚こ烯亞胺聚合物上裝載ー些具有靶向性質(zhì)的靶頭，也可以使用抗體等手段介導(dǎo)，可以使用臨床手段比如說(shuō)內(nèi)窺鏡的方式來(lái)直接輸送載藥系統(tǒng)到達(dá)靶組織，聚焦光照面積等方式。本發(fā)明的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以制成任意的藥物制劑劑型，比如注射劑、注射用無(wú)菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的富勒烯聚こ烯亞胺聚合物可以加入各種制劑的添加剤，比如生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為靜脈注射、肌肉注射、瘤內(nèi)注射和皮下注射
坐寸ο本發(fā)明作為光敏劑和藥物載體在制備治療腫瘤的藥物，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，均取得了良好的試驗(yàn)結(jié)果，相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下
實(shí)驗(yàn)I
通過(guò)光照射水溶性富勒烯，測(cè)定其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，在體外測(cè)定其抗腫瘤活性。將PC3前列腺癌細(xì)胞(由上海細(xì)胞庫(kù)提供)用作待考察的癌細(xì)胞。將PC3細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%，青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5%CO2,每2 3天傳代一次。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ I,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至6 X IO3個(gè)/孔，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 V孵育24 h，至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(12. 5、25、50、100 μ g/ml)的水溶性富勒烯聚こ烯亞胺，設(shè)置復(fù)孔為4 6個(gè)。光照組放置在400W可見(jiàn)光中60min，保持光照過(guò)程中溫度在37°C，光照結(jié)束后用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，對(duì)于不光照組而言，則直接用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，終止培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預(yù)冷的10% TCA 200 μ 1,4で放置I h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置10min，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用150 μ I 10 mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在515 nm處測(cè)定每孔的OD值。存活率的計(jì)算公式存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均為扣除空白對(duì)照組后的值。經(jīng)證實(shí)當(dāng)用光照射60min,水溶性富勒烯聚こ烯亞胺的加入直接影響了 PC3細(xì)胞的増殖。實(shí)驗(yàn)2
光照射時(shí)，水溶性富勒烯聚こ烯亞胺的體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)定。取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射O. 3 ml，小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2 X 106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7 d后，取其中24只腫瘤體積> 100 mm3昆明小鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只。具體分組如下(I)對(duì)照組(NS組)生理鹽水；(2)生理鹽水激光組；(3)水溶性富勒烯聚こ烯亞胺組；(4)水溶性富勒烯聚こ烯亞胺激光組。4組均采用靜脈給藥的方式，其中光照組使用的光源為532nm綠相光源，功率為300mW，給藥 3h后激光照射腫瘤部位，一次照射時(shí)間為lOmin。每2 d給藥一次，毎次注射生理鹽水或者2mg/ml的水溶性富勒烯聚こ烯亞胺100 μ 1，共給藥7次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2 d稱(chēng)其體重并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠肉瘤的長(zhǎng)徑(A)與短徑(B)，計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)給藥水溶性富勒烯聚こ烯亞胺合并激光照射時(shí)，小鼠的腫瘤體積的增加得到了明顯的抑制。實(shí)驗(yàn)3
水溶性富勒烯聚こ烯亞胺作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤治療中的應(yīng)用。取水溶性富勒烯聚こ烯亞胺IOmg和多西紫杉醇(由北京怡和生物科技有限公司提供)20mg，加入超純水2mL，混合均勻后，探頭超聲(工作3s，間隔6s，工作12次，功率為400W)，將探超完成的樣品進(jìn)行離心(4000rpm，15min)除去大顆粒。得到了以水溶性富勒烯為載體的抗腫瘤藥物多西紫杉醇給藥系統(tǒng)。通過(guò)40倍(體積比)こ醇提取出給藥系統(tǒng)中包封的多西紫杉醇，紫外分光光度計(jì)測(cè)定為載體包封的多西紫杉醇的含量，載藥量為2. I mg/
mLo已經(jīng)證實(shí)，水溶性富勒烯聚こ烯亞胺可以吸附抗腫瘤藥物多西紫杉醇，提高了多西紫杉醇在水中的溶解度，可以作為抗腫瘤藥物的載體使用。實(shí)驗(yàn)4
水溶性富勒烯聚こ烯亞胺多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的粒子大小和表面帶電量的確定 使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定，折射率設(shè)置為I. 590，吸收系數(shù)設(shè)置為
O.010，溫度設(shè)置為25で，測(cè)量模式設(shè)置為自動(dòng)，以Z平均統(tǒng)計(jì)值作為測(cè)定結(jié)果。每ー水平縮合體均配制3份，每份測(cè)量一次，取三次測(cè)量值的平均值作為測(cè)量結(jié)果。介電常數(shù)設(shè)置為79，黏度系數(shù)設(shè)置為O. 8872，溫度設(shè)置為25で，測(cè)量模式設(shè)置為自動(dòng)。每一水平縮合體均配制3份，每份測(cè)量一次，取三次測(cè)量值的平均值作為測(cè)量結(jié)果。實(shí)驗(yàn)5
水溶性富勒烯聚こ烯亞胺多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性 將PC3前列腺癌細(xì)胞(由上海細(xì)胞庫(kù)提供)用作待考察的癌細(xì)胞。將PC3細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%，青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5% CO2,每2 3天傳代一次。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ ，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至6 X IO3個(gè)/孔，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。置于5% CO2, 37で孵育24 h，至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(0、0.5、1、2、4、6、8μ8/πι1)的實(shí)例4中的水溶性富勒烯聚こ烯亞胺多西紫杉醇，不加入實(shí)例4中的水溶性富勒烯聚こ烯亞胺多西紫杉醇為對(duì)照組，設(shè)置復(fù)孔為4 6個(gè)。光照組放置在400W可見(jiàn)光中60min，保持光照過(guò)程中溫度在37 V，光照結(jié)束后用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，對(duì)于不光照組而言，則直接用鋁箔包裹細(xì)胞板置于C02培養(yǎng)箱中孵育24 h，終止培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預(yù)冷的10% TCA 200 μ 1,4で放置I h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置10min，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用150 μ I 10 mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在515 nm處測(cè)定每孔的OD值。抑制率的計(jì)算公式抑制率=I-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均為扣除空白對(duì)照組后的值。 已經(jīng)證實(shí)，水溶性富勒烯作為藥物載體時(shí)能裝載藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，更好的發(fā)揮出抗腫瘤藥物的療效，而且結(jié)合光照后，能夠更明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的増殖。實(shí)驗(yàn)6
水溶性富勒烯多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性
取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射
0.3 ml,小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7 d后,取其中24只腫瘤體積>100 mm3昆明小鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只。具體分組如下(I)對(duì)照組(NS組)生理鹽水；(2)多西紫杉醇注射液組；(3)水溶性富勒烯聚こ烯亞胺多西紫杉醇；(4)水溶性富勒烯聚こ烯亞胺多西紫杉醇光照組。多西紫杉醇注射液組、水溶性富勒烯聚こ烯亞胺多西紫杉醇和水溶性富勒烯聚こ烯亞胺多西紫杉醇光照組的多西紫杉醇給藥劑量相等，都為25. 125mg/kg。4組均采用靜脈給藥的方式，其中光照組使用的光源為532nm綠相光源，功率為300mW，給藥3h后激光照射腫瘤部位，一次照射時(shí)間為lOmin。每2 d給藥ー次，共給藥7次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2 d稱(chēng)其體重并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠肉瘤的長(zhǎng)徑(A)與短徑(B)，計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)給藥水溶性富勒烯多西紫杉醇時(shí)，小鼠的腫瘤體積的增加比起多西紫杉醇注射液得到了明顯的抑制。合并激光照射時(shí)，小鼠的腫瘤體積的增加得到了更加明顯的抑制。在做上述實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，還采用其他光源以及抗腫瘤藥物做了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)，均取得了相同和相類(lèi)似的結(jié)果。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出的有益技術(shù)效果
I)本發(fā)明的新的水溶性富勒烯不會(huì)對(duì)富勒烯本身的特性進(jìn)行破壞，水分散性強(qiáng)，對(duì)生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備的條件容易滿(mǎn)足，原料來(lái)源豐富，成本低。2)本發(fā)明提供的水溶性富勒烯可以作為抗腫瘤光動(dòng)カ治療的ー種良好的光敏劑，光照時(shí)能夠發(fā)揮抗腫瘤的活性，而不光照時(shí)則副作用很小，可以根據(jù)光的聚焦等手段來(lái)選擇性的殺傷腫瘤組織和細(xì)胞。測(cè)試表明無(wú)論是體外還是體內(nèi)在光照的情況下都可以很好的抑制腫瘤細(xì)胞以及組織的發(fā)生和發(fā)展，而在不光照的情況下本發(fā)明提供的新的水溶性富勒烯對(duì)正常細(xì)胞以及組織毒副作用很小。3)本發(fā)明提供的水溶性富勒烯可以作為ー種良好的抗腫瘤藥物的載體，有著極小 的毒性，較強(qiáng)的水溶性，生物相容性好，比表面積大，化學(xué)惰性高，具有緩釋性和靶向性，結(jié)合光照還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性。測(cè)試結(jié)果表明，本發(fā)明提供的水溶性富勒烯作為抗腫瘤藥物的載體時(shí)，粒徑均勻，能夠提高水不溶性抗腫瘤藥物的水溶性，能夠起到一定的緩釋作用，而且還能夠更多的到達(dá)腫瘤組織中起到靶向給藥的作用，結(jié)合光照還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性。
權(quán)利要求
1.ー種水溶性富勒烯，其特征在于，在富勒烯分子上通過(guò)化學(xué)鍵連接有水溶性聚合物聚こ烯亞胺，所述的聚こ烯亞胺和富勒烯的重量比為O. 08-0. 12:1，所述的富勒烯為C6tl富勒烯。
2.權(quán)利要求I所述的水溶性富勒烯的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn) Cl)將氨化試劑20ml和氫氧化鈉I. Og加入到60ml的水和無(wú)水こ醇的混合溶劑中，其中水和無(wú)水こ醇的體積比為1:5，攪拌均勻后逐滴加入到50ml的富勒烯甲苯溶液中，在400r/min的轉(zhuǎn)速30°C下，攪拌7天，使其反應(yīng)充分，除去上層的甲苯層溶液、水和無(wú)水こ醇混合溶液，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑甲醇抽濾洗滌15次后，40°C下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯；所述的富勒烯甲苯溶液是由富勒烯姆Img加入甲苯Iml混勻制得； (2)將步驟(I)所得的氨基富勒烯50mg與氮丙啶1ml、濃鹽酸10 μ I在ニ氯甲烷20ml中混合均勻，在40°C，轉(zhuǎn)速400r/min下攪拌回流48h，使其充分反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑ニ氯甲烷抽濾洗滌20次，40°C下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚こ烯亞胺聚合物，即水溶性富勒烯； 所述的濃鹽酸體積濃度為37-38% ； 所述的氨化試劑為こニ胺、1，3-丙ニ胺、1，6-己ニ胺中的ー種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性富勒烯的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)將こニ胺20ml和氫氧化鈉I.Og加入到60ml的水和無(wú)水こ醇的混合溶劑中，其中水和無(wú)水こ醇的體積比為1: 5，攪拌均勻后逐滴加入到50ml重量體積比為lmg/ml的富勒烯甲苯溶液中，在400r/min的轉(zhuǎn)速下，30°C溫度下，攪拌7天使其反應(yīng)充分，除去上層的甲苯層溶液、水和無(wú)水こ醇混合溶液，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑甲醇抽濾洗滌15次后，40°C下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯； (2)將步驟(I)所得的氨基富勒烯50mg與氮丙啶Iml、濃鹽酸10μ I在ニ氯甲烷20ml中混合均勻，在40°C，轉(zhuǎn)速400r/min下攪拌回流48h，使其充分反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑ニ氯甲烷抽濾洗滌20次，40°C下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚こ烯亞胺聚合物，即水溶性富勒烯。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性富勒烯的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)將1，3-丙ニ胺20ml和氫氧化鈉I.Og加入到60ml的水和無(wú)水こ醇的混合溶劑中，其中水和無(wú)水こ醇的體積比為1:5，攪拌均勻后逐滴加入到50ml重量體積比為lmg/ml的富勒烯甲苯溶液中，30°C，400r/min下攪拌7d使其反應(yīng)充分；除去上層的甲苯層溶液、水和無(wú)水こ醇混合溶液，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑甲醇抽濾洗滌15次后，40°C下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯； (2)將步驟(I)所得的氨基富勒烯50mg與氮丙啶Iml、濃鹽酸10μ I在ニ氯甲烷20ml中混合均勻，在40°C，轉(zhuǎn)速400r/min下攪拌回流48h，使其充分反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑ニ氯甲烷抽濾洗滌20次，40°C下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚こ烯亞胺聚合物，即水溶性富勒烯。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性富勒烯的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn) (I)將1，6-己ニ胺20ml和氫氧化鈉I. Og加入到60ml的水和無(wú)水こ醇的混合溶劑中，其中水和無(wú)水こ醇的體積比為1: 5，攪拌均勻后逐滴加入到50ml重量體積比為lmg/ml的富勒烯甲苯溶液中，30°C，400r/min下攪拌7d使其反應(yīng)充分；除去上層的甲苯層溶液、水和無(wú)水こ醇混合溶液，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑甲醇抽濾洗滌15次后，40°C下抽真空干燥24h，得到氨基富勒烯； (2)將步驟(I)所得的氨基富勒烯50mg與氮丙啶Iml、濃鹽酸10 μ I在ニ氯甲烷20ml中混合均勻，在40°C，轉(zhuǎn)速400r/min下攪拌回流48h，使其充分反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑ニ氯甲烷抽濾洗滌20次，40°C下抽真空干燥48h，得到富勒烯聚こ烯亞胺聚合物，即水溶性富勒烯。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水溶性富勒烯，其特征在于，所述的水溶性富勒烯以納米聚集物的形式存在，粒徑為30-300nm。
7.權(quán)利要求I所述的水溶性富勒烯作為光敏劑在光動(dòng)カ治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I所述的水溶性富勒烯作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述的水溶性富勒烯在于與抗腫瘤藥物結(jié)合作為抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的抗腫瘤藥物為難溶性抗腫瘤藥物、水溶性藥物和核酸藥物的多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、寡義反核苷酸、小干擾RNA和酶類(lèi)藥物的ー種或幾種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的水溶性富勒烯，其特征在于，所述的結(jié)合為超聲、攪拌、探超和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)中的ー種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水溶性富勒烯及其制備方法，可有效解決現(xiàn)有富勒烯可溶性差，光敏活性低，生物相容性差的問(wèn)題，解決的技術(shù)方案是在富勒烯分子上通過(guò)化學(xué)鍵連接有水溶性聚合物聚乙烯亞胺水溶性富勒烯，所述的聚乙烯亞胺和富勒烯的重量比為0.08-0.12∶1；所述的水溶性富勒烯的制備方法為將富勒烯與氨化試劑反應(yīng)，得到氨基富勒烯，再與氮丙啶反應(yīng)，在質(zhì)子化氫離子的存在下，氮丙啶不斷的在氨基上進(jìn)行接枝，最終得到富勒烯聚乙烯亞胺聚合物，即水溶性富勒烯，本發(fā)明制備的水溶性富勒烯不會(huì)對(duì)富勒烯本身的特性進(jìn)行破壞，水分散性強(qiáng)，毒性低，穩(wěn)定性良好，制備方法簡(jiǎn)單，成本低，并可作為光敏劑和藥物載體制備治療癌癥的藥物。
文檔編號(hào)C08G83/00GK102675655SQ20121018063
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者史進(jìn)進(jìn), 張振中, 張紅嶺, 張超峰, 王真真, 王蕾, 陳成群 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)