本發(fā)明涉及一種RNA干擾（RNAi）制劑和所述RNAi制劑在治療個體乙型肝炎感染中的應(yīng)用，以及包含本發(fā)明的RNAi制劑的藥物組合物。

背景技術(shù)：
肝炎是“肝臟發(fā)炎”的泛稱，其具有多種原因。病毒原因是其中最常見的，并且可以由甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒引起。乙型肝炎病毒（HBV）尤其是一種嚴(yán)重并常見的肝臟傳染病，在世界范圍內(nèi)感染了數(shù)百萬人口。HBV是屬于嗜肝DNA病毒科的嗜肝性DNA病毒。該病毒基因組的全長大約是3.2kb，有四個開放閱讀框（ORF），包括：表面抗原（“S基因”）、核心抗原（“C基因”）、DNA聚合酶（“P基因”）和被稱為“X基因”的未確定功能的基因。目前現(xiàn)存人口中超過20億人已經(jīng)在他們生命的某些時候感染了HBV，其中大約3億5千萬人仍然是慢性感染狀態(tài)并且成為該病毒的攜帶者。HBV感染可以引起急性和慢性的乙型肝炎，并可能最終導(dǎo)致發(fā)展成慢性肝功能不全、肝硬化和肝細(xì)胞癌。此外，HBV攜帶者可以經(jīng)年傳播該疾病。HBV通過皮膚或腸胃外接觸感染的體液或血液而傳播。最常見的感染途徑是通過母親和其孩子間的垂直傳播以及在成人中通過性傳播或共用靜脈針或穿耳設(shè)備而傳播。但是，很多急性HBV感染的病例并沒有可追蹤的感染途徑。具有慢性HBV感染的人（“攜帶者”-全世界大約3.5～4億人）比非攜帶者有12～300×更高的發(fā)展肝細(xì)胞癌的風(fēng)險，并且全球范圍內(nèi)，HBV引發(fā)世界原發(fā)性肝癌的60～80%。每年，在超過4百萬的急性臨床病例中，有大約25%（即，全世界范圍內(nèi)一百萬人口）死于慢性活動型肝炎、肝硬化或HBV誘導(dǎo)的肝癌。因此，HBV被列為僅次于煙草的第二大已知的人類致癌物。盡管抗HBV疫苗已經(jīng)廣泛使用了幾十年，人群中HBV的患病率依然很高。在大多數(shù)的慢性感染的病患中，目前對慢性HBV感染的治療僅限于對病毒基因表達(dá)和復(fù)制的抑制作用。例如，拉米夫定抑制HBV在攜帶者中的復(fù)制，但是如果治療終止，效果將可逆。此外，長期拉米夫定治療的主要缺陷是病毒抗藥性的發(fā)展，通常在治療6個月后發(fā)展?？顾幮酝ǔＥcHBV聚合酶基因的高度保守的催化區(qū)域中的變異相關(guān)。出于這些原因，仍然需要新的治療制劑以治療HBV感染。本發(fā)明提供一種RNA干擾（RNAi）制劑以及該RNAi制劑在治療個體乙型肝炎感染中的應(yīng)用。RNAi途徑由酶Dicer起始，所述酶將雙鏈RNA（dsRNA）分子分解成約20～25個核苷酸的短片段（通常被稱為siRNA）。每個片段的雙鏈之一（已知被稱為指導(dǎo)鏈或活性鏈）然后通過結(jié)合argonaute蛋白家族的一個成員而與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）整合。在整合至RISC之后，所述指導(dǎo)鏈與它的目標(biāo)mRNA堿基配對，被認(rèn)為是通過抑制mRNA翻譯（通過停止翻譯機制）和/或誘導(dǎo)mRNA的分解而抑制目標(biāo)，從而阻礙它用作翻譯模板。盡管由Dicer產(chǎn)生的片段是雙鏈的，僅指導(dǎo)鏈指導(dǎo)基因沉默。另一條更通常被稱為過客鏈、攜帶鏈或*鏈的反指導(dǎo)鏈往往在RISC活化作用中降解(GregoryR,ChendrimadaT,CoochN,ShiekhattarR(2005)."HumanRISCcouplesmicroRNAbiogenesisandposttranscriptionalgenesilencing".Cell123(4):631-40)。RISC裝配被認(rèn)為是通過一種酶指導(dǎo)，所述酶選擇將dsRNA的Dicer產(chǎn)物中哪一條鏈置于RISC中。所述鏈通常是5’末端與其互補序列較不嚴(yán)謹(jǐn)配對的鏈，同樣表現(xiàn)出在5’位置對A的明顯偏向，而對U較少偏向，以促進(jìn)與一些argonaute蛋白的結(jié)合(SchwarzDS,HutvágnerG,DuT,XuZ,AroninN,ZamorePD(2003)."AsymmetryintheassemblyoftheRNAienzymecomplex".Cell115(2):FrankF,SonenbergN,Nagar(2010)“Structuralbasisfor5'-nucleotidebase-specificrecognitionofguideRNAbyhumanAGO2”.Nature.465(7299):818-22)。說明書中對任何現(xiàn)有技術(shù)的參考不是且不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是對以下內(nèi)容的確認(rèn)或任何形式的建議：該現(xiàn)有技術(shù)在澳大利亞或任何其它管轄區(qū)形成公知常識的一部分，或者該現(xiàn)有技術(shù)可以被合理地預(yù)期為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定、理解或認(rèn)為有關(guān)聯(lián)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以靶定乙型肝炎病毒（HBV）基因組中的特定序列以抑制該病毒。通過靶定一個或多個基因的特定區(qū)域，那些基因的表達(dá)被抑制，有效地“沉默”所述基因。這表現(xiàn)出靶定細(xì)胞中HBV表達(dá)，以治療HBV感染的新機會。在本發(fā)明的一個方面，提供了DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑（是RNA分子），以及表達(dá)盒或構(gòu)建體以在細(xì)胞中（包括體內(nèi)）表達(dá)所述制劑，用于抑制至少一個乙型肝炎病毒（HBV）基因表達(dá)，其中所述制劑包括一種效應(yīng)器序列（將在下文進(jìn)一步描述），所述效應(yīng)器序列的長度是至少17個核苷酸，與從靶區(qū)域轉(zhuǎn)錄的預(yù)測序列互補或基本上互補，所述靶區(qū)域選自SEQIDNO:1-19中任意一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸。在另一種實施方式中，所述靶區(qū)域是選自SEQIDNO:20-27中任意一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的序列。所述效應(yīng)器序列被引導(dǎo)至靶RNA序列的靶區(qū)域，其中所述靶序列是靶基因的轉(zhuǎn)錄本。因此，通過與包含所述靶區(qū)域的靶基因的轉(zhuǎn)錄本在序列上充分互補，所述效應(yīng)器序列而被引導(dǎo)至靶區(qū)域。具有包含所述效應(yīng)器序列的雙鏈部分的RNAi制劑，如ddRNAi制劑，可以因此由于包含所述靶區(qū)域的靶基因序列而“抑制靶基因序列的表達(dá)”。因此，在感染HBV的細(xì)胞中，由于所述效應(yīng)器的序列（下文定義為“效應(yīng)器”）與靶基因的預(yù)測mRNA靶序列的（至少）一個區(qū)域基本上互補，所述RNAi制劑能夠抑制靶基因序列的表達(dá)。這可以用以下短序列圖解：5’ATTGCG3’-基因的DNA靶序列5’AUUGCG3’-來自所述基因的轉(zhuǎn)錄的mRNA靶區(qū)域/序列3’UAACGC5’-效應(yīng)器序列-與預(yù)測的mRNA靶序列的一個區(qū)域基本互補。典型地，靶區(qū)域是基因的mRNA的一個區(qū)域，所述基因計劃中將被沉默或使其表達(dá)（在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平）降低。設(shè)計所述制劑使得它同樣包含效應(yīng)器互補序列，即，與所述效應(yīng)器序列基本互補的序列，使得它將易于退火從而形成雙鏈RNA片段——需要的互補度將在下文更具體解釋。此外，所述雙鏈片段的一個末端通常將通過環(huán)序列連接以形成“發(fā)夾”樣結(jié)構(gòu)。這也被認(rèn)為是“中斷的反向重復(fù)”結(jié)構(gòu)，因為編碼這樣的RNA序列的DNA包含所述靶基因的所述區(qū)域的反向重復(fù)，所述區(qū)域被轉(zhuǎn)錄成效應(yīng)器序列，被編碼所述環(huán)的填充序列或間隔子序列阻斷。在本發(fā)明的一些形式中，所述制劑具有多于一種效應(yīng)器序列。多種效應(yīng)器可以靶定HBV基因的同一區(qū)域，相同基因和/或不同HBV基因的不同（可能重疊）區(qū)域。RNAi制劑，如ddRNAi制劑，可以包含2種或3種不同的效應(yīng)器序列。如上文所解釋的，所述ddRNAi制劑包含對于每一條效應(yīng)器序列的效應(yīng)器互補序列，因此形成效應(yīng)器-效應(yīng)器互補序列對（即，第一效應(yīng)器-第一效應(yīng)器互補序列對，第二效應(yīng)器-第二效應(yīng)器互補序列對等）。這些對可以是（但不必須是）彼此相鄰，只要所述RNAi制劑可以折疊以使得每一對退火。多種其它的因素暗示了所述效應(yīng)器和效應(yīng)器互補序列沿著所述RNAi制劑的長度的一種或另一種順序。因此，本發(fā)明的實施方式包括一種或多種以下內(nèi)容：·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器互補序列和第一效應(yīng)器互補序列；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器序列，第三效應(yīng)器序列，第三效應(yīng)器互補序列，第二效應(yīng)器互補序列和第一效應(yīng)器互補序列；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第一效應(yīng)器互補序列，第二效應(yīng)器序列和第二效應(yīng)器互補序列；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第一效應(yīng)器互補序列，第二效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器互補序列，第三效應(yīng)器序列和第三效應(yīng)器互補序列；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器序列，2～100個非自身互補核苷酸的序列，第二效應(yīng)器互補序列和第一效應(yīng)器互補序列；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，2～100個非自身互補核苷酸的序列，第一效應(yīng)器互補序列，第二效應(yīng)器序列，2～100個非自身互補核苷酸的序列和第二效應(yīng)器互補序列。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的以及如附圖所例示的，所述制劑中，任何具體的效應(yīng)器序列都可以與其互補序列在位置上互換。在上文所述的每一實施方式的具體形式中，每一個效應(yīng)器序列的長度至少是17個核苷酸，并包括選自來自SEQIDNO:1-19或SEQIDNO:20-27的任何一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。所述效應(yīng)器序列可以全部是相同的，或者全部不同，或者是其組合，例如序列是SEQIDNO:1的至少10個連續(xù)核苷酸的2個效應(yīng)器序列和序列是SEQIDNO:4的至少10個連續(xù)核苷酸的1個效應(yīng)器序列。優(yōu)選地，所述效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:1-19或SEQIDNO:20-27的任何一條序列中的任何連續(xù)11、12、13、14、15或16個核苷酸；最優(yōu)選地，選自SEQIDNO:1-19或SEQIDNO:20-27的任何一條序列中的17個或更多個連續(xù)核苷酸。通常，所述效應(yīng)器互補序列的長度與其對應(yīng)的效應(yīng)器序列的長度相同或大致相同（即，±15%核苷酸長度）。在其它實施方式中，所述dsRNA由退火形成雙鏈體的2個分離的RNA鏈組成。ddRNAi制劑可以由插入至任何合適載體或ddRNAi構(gòu)建體的DNA表達(dá)盒表達(dá)。因此，本發(fā)明的多個方面提供一種ddRNAi表達(dá)盒，包括：·一條或多條啟動子序列；·一條或多條DNA序列，優(yōu)選地所述DNA序列是編碼SEQIDNO:1-19或SEQIDNO:20-27的任何一條序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸；·一條或多條DNA序列，所述DNA序列編碼一種或多種效應(yīng)器互補序列；·一條或多條終止子序列；以及可選地，·一條或多條編碼環(huán)序列的DNA序列；和·一條或多條增強子序列。在一些實施方式中，一個啟動子與多個效應(yīng)器編碼區(qū)域可操作地連接，使得所述啟動子可以驅(qū)動它們表達(dá)，而在其它實施方式中，每一個效應(yīng)器編碼區(qū)域與其本身的啟動子可操作地連接。在具有多個啟動子的構(gòu)建體中，這些啟動子可以是全部相同或不同。優(yōu)選的啟動子是U6和H1。同樣提供ddRNAi表達(dá)構(gòu)建體，ddRNAi表達(dá)盒插入至所述ddRNAi表達(dá)構(gòu)建體中用于表達(dá)。此外，當(dāng)所述構(gòu)建體的載體骨架與遞送系統(tǒng)相容時，所述ddRNAi表達(dá)構(gòu)建體同樣是遞送構(gòu)建體。本發(fā)明還提供siRNA制劑，包括一條長度至少是17個核苷酸的序列，所述序列選自SEQIDNO:1-19或SEQIDNO:20-27的任何一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸，以及一條與所述序列互補的序列，兩條序列形成雙鏈體并能夠抑制HBV基因的表達(dá)。本發(fā)明還提供治療個體中急性或慢性HBV感染的方法、減少個體中HBV病毒負(fù)荷的方法、降低個體中與HBV感染相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重度的方法和降低HBV的傳染性的方法，這些方法包括施用治療有效量的本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體、ddRNAi制劑或siRNA制劑，其中所述ddRNAi構(gòu)建體、ddRNAi制劑或siRNA制劑抑制一種乙型肝炎病毒（HBV）基因（優(yōu)選地，至少是HBV的聚合酶基因）中的一個或多個靶定序列的表達(dá)。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，包括本發(fā)明的ddRNAi制劑、ddRNAi表達(dá)盒、ddRNAi構(gòu)建體或siRNA制劑，以及一種藥物學(xué)可接受的載體或稀釋劑。附圖說明圖1A-F例示了本發(fā)明的一些ddRNAi制劑的結(jié)構(gòu)。圖2顯示了沿著HBV聚合酶基因所獲得的642個siRNA克隆的分布，其中短線表示個體的全部siRNA靶（EsT）克隆。圖3是siRNA表達(dá)盒（SEC）和它們的相對應(yīng)的合成siRNA對HBV聚合酶mRNA水平的RNAi功效的比較，以證實由HBV聚合酶表達(dá)3的SEC抑制獲得的初始篩選結(jié)果。圖4是用源自EsT庫的501個siRNA序列對HBV聚合酶抑制篩選的結(jié)果。圖5A是前100個最有效的siRNA序列（如在圖4中大規(guī)模篩選中所鑒定的）沿著HBV聚合酶基因的分布的圖示。圖5B圖示了任何給定的序列是如何繪制至HBV聚合酶基因。所顯示的是SEQIDNO:1-3所基于的區(qū)域。圖6是5個單獨的表達(dá)盒和由它們編碼的RNAi制劑以及由Dicer加工后的效應(yīng)器序列的示意圖。所述表達(dá)盒基于SEQIDNO:3、9、12、13和23。圖7是具有多個效應(yīng)器序列表達(dá)盒的示意圖，所述表達(dá)盒包括（a）多條效應(yīng)器序列，每條效應(yīng)器序列可操作地與獨立的啟動子和終止子序列連接，以表達(dá)以短發(fā)夾RNAi（shRNAi）制劑形式的單獨的RNAi制劑(圖7A)；或者（b）可操作地與一個啟動子連接的第一效應(yīng)器序列和可操作地與一個終止子連接的第三效應(yīng)器序列，以表達(dá)單一的多個莖環(huán)RNAi制劑。所述表達(dá)盒基于SEQIDNO:1、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6。圖8是多個效應(yīng)器序列表達(dá)盒的示意圖，所述表達(dá)盒基于SEQIDNOS:1、4和6，其產(chǎn)生單一的長發(fā)夾RNAi制劑。圖9例示了SEQIDNO:1～14和20～27在轉(zhuǎn)染至HepG22.2.15細(xì)胞之后的基因敲減功效。通過qRT-PCR分析聚合酶基因mRNA來測量敲減功效。siNC是負(fù)對照，是一種在HBV中沒有已知的靶序列的siRNA；正常的是在未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的聚合酶mRNA水平，標(biāo)準(zhǔn)化為1的水平。圖10A和B顯示了細(xì)胞中熒光素酶活性（+/-SD，n=4），所述細(xì)胞在表3和4中列出的條件下用不同量的化學(xué)合成的靶向pGL-23的siRNA23（A）或者shRNA23表達(dá)構(gòu)建體（B）轉(zhuǎn)染。在圖10A中，siNC既用作負(fù)對照，也用于調(diào)整加入至細(xì)胞中的siRNA的總量，以避免由不相等的轉(zhuǎn)染造成的可能的人造數(shù)據(jù)；siRNAGL3用作負(fù)對照，使得是siRNA靶定熒光素酶基因。在圖10B中，pUC57既用作正對照，也用于調(diào)整加入至細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA的總量，以避免由不相等的轉(zhuǎn)染造成的可能的人造數(shù)據(jù)。表達(dá)基于GL3siRNA的熒光素酶shRNA的質(zhì)粒用作正對照。具體實施方式定義如本文中所使用的，除非另有說明，術(shù)語“包含”及該術(shù)語的變化形式，如“包括”、“含有”、“組成”不意味著排除其它添加劑、組分、整數(shù)或步驟。術(shù)語“RNA干擾”或“RNAi”通常指由細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈RNA（dsRNA）分子啟動的RNA依賴的基因沉默過程。所述dsRNA減少了靶核酸序列的表達(dá)，所述靶核酸序列可能是DNA，它的RNA表達(dá)產(chǎn)物被減少，或者是RNA，所述dsRNA分子與所述RNA基本或完全同源?！半p鏈RNA”或“dsRNA”表示能夠抑制與其具有同源性的靶核酸序列的表達(dá)的雙鏈RNA分子。在一些實施方式中，所述dsRNA是發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中一個雙鏈體區(qū)域可選地通過至少一個核苷酸連接，并被稱為“發(fā)夾RNA”或“短發(fā)夾RNAi制劑”或“shRNA”。所述雙鏈體在效應(yīng)器序列和與所述效應(yīng)器序列互補的序列（在本文中被稱為“效應(yīng)器互補序列”）之間形成。通常，所述效應(yīng)器互補序列的長度與其相應(yīng)的效應(yīng)器序列的長度相同。如將在下文所解釋的，所述效應(yīng)器序列與靶核酸序列互補?！靶?yīng)器序列”是當(dāng)RISC復(fù)合體的一部分與HBV靶核苷酸序列結(jié)合時，從而靶定該序列用于被細(xì)胞破壞的核苷酸序列。它與在背景技術(shù)章節(jié)中討論的“指導(dǎo)”鏈類似。所述效應(yīng)器序列通過與靶區(qū)域的轉(zhuǎn)錄本在序列上互補或基本互補而“靶向于”所述靶區(qū)域，使得具有包含所述效應(yīng)器序列的雙鏈部分的RNA制劑抑制靶基因序列的表達(dá)。所述“效應(yīng)器互補序列”與在背景技術(shù)部分中討論的過客鏈類似，并與所述效應(yīng)器充分互補使得其與所述效應(yīng)器序列退火。可能地，所述效應(yīng)器互補序列將是與所述靶基因序列類似的序列，但不必要必須是。術(shù)語“RNAi制劑”指得到RNAi的dsRNA序列。該術(shù)語可以與“小干擾RNA”（siRNA制劑）和小發(fā)夾RNA（shRNAi或hpRNAi制劑）互換使用。所述RNAi制劑的雙鏈或雙鏈體區(qū)域的長度至少是17個堿基對，通常的范圍是17～30個堿基對?？梢栽诩?xì)胞外通過化學(xué)或酶學(xué)合成RNAi制劑，然后遞送至細(xì)胞，或者可以在細(xì)胞中通過合適的載體體內(nèi)表達(dá)（見，如美國專利6,573,099，WO2004/106517和WO99/49029，這些文獻(xiàn)通過引用的方式結(jié)合至本文）。術(shù)語“DNA指導(dǎo)的RNAi制劑”或“ddRNAi制劑”指轉(zhuǎn)錄自DNA表達(dá)盒（“ddRNAi表達(dá)盒”）的RNAi制劑。所述轉(zhuǎn)錄自表達(dá)盒的ddRNAi制劑可以轉(zhuǎn)錄為能夠自退火成具有通過至少2個核苷酸連接的雙鏈體區(qū)域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單一RNA，或者轉(zhuǎn)錄為具有多個shRNA域的單一RNA，或轉(zhuǎn)錄為多個轉(zhuǎn)錄本，每一個均能折疊為單一shRNA。所述ddRNAi表達(dá)盒能夠連接至被稱為ddRNAi載體或ddRNAi構(gòu)建體的載體中。所述載體可以提供確定所述ddRNAi表達(dá)盒體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄的序列。所述載體可以額外地作為ddRNAi表達(dá)盒的遞送媒介。例如，基于病毒的載體將產(chǎn)生用于ddRNAi表達(dá)盒表達(dá)以及與病毒遞送相容的ddRNAi構(gòu)建體。當(dāng)核酸已經(jīng)被引入至細(xì)胞中時，所述細(xì)胞已經(jīng)“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)導(dǎo)”或“轉(zhuǎn)染”外源或異源核酸或載體。所述轉(zhuǎn)化DNA可以或可以沒有整合（共價連接）至所述細(xì)胞的基因組中。關(guān)于真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是這樣的細(xì)胞：轉(zhuǎn)化DNA已經(jīng)整合至宿主細(xì)胞染色體中，或者保持在染色體外（游離的）使得轉(zhuǎn)化DNA在細(xì)胞復(fù)制過程中由子細(xì)胞遺傳。在非復(fù)制、分化的細(xì)胞中，所述轉(zhuǎn)化DNA可以持續(xù)作為游離基因。“基因表達(dá)”可以指轉(zhuǎn)錄或翻譯之一或二者。“表達(dá)的抑制”指在靶基因的蛋白質(zhì)和/或mRNA產(chǎn)物水平上不存在或可見的減少。所述抑制不需要是絕對的，但可以是足以用于作為施用本發(fā)明的RNAi或ddRNAi制劑或siRNA制劑或ddRNAi構(gòu)建體的可檢測的或可觀察的變化的部分抑制。可以通過測量靶核酸的mRNA和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平相對于缺少ddRNAi制劑或構(gòu)建體的細(xì)胞的減少量來測量抑制效果，可以少至1%、5%或10%，或者可以是絕對的，即100%抑制?？梢酝ㄟ^分析外在性質(zhì)（即，所述細(xì)胞或生物體的定量和/或定性的表型）而確定抑制效果，并且也可以包括在施用本發(fā)明的ddRNAi制劑或構(gòu)建體之后進(jìn)行病毒負(fù)荷評估而確定抑制效果。如在本文中所使用的，“定量的表型特征”指與宿主細(xì)胞中核酸的分子表達(dá)相關(guān)特征，并因此可以包括轉(zhuǎn)錄的或復(fù)制的RNA分子的數(shù)量、轉(zhuǎn)錄后修飾的RNA分子的數(shù)量、翻譯的肽或蛋白質(zhì)的數(shù)量或者這些肽或蛋白質(zhì)的活性。核酸的顯型表達(dá)（所述顯型是定性特征）的減少意思是，當(dāng)存在本發(fā)明的RNAi制劑時，所述顯型特征轉(zhuǎn)換至與不存在RNAi制劑的情況時相比不同的狀態(tài)。因此，核酸的顯型表達(dá)的減少可以被測量為（部分）該核酸的穩(wěn)定狀態(tài)水平的減少，（部分）該核酸的翻譯的減少或者轉(zhuǎn)錄的RNA或翻譯的多肽對真核細(xì)胞和生物體的作用的減少，并且將最終導(dǎo)致改變的表型特征。明顯地，目標(biāo)核酸的顯型表達(dá)的減少可能與可觀察的顯型變化共存或相應(yīng)。所述評估可以通過生化技術(shù)如Northern雜交、定量實時PCR實驗、基因表達(dá)實驗、抗體結(jié)合、ELISA、RIA、蛋白質(zhì)印跡或本領(lǐng)域已知的其它實驗和技術(shù)完成。“靶核酸”可以是RNA或DNA，它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是靶定的、編碼或非編碼的序列、外源或內(nèi)源的。在優(yōu)選的實施方式中，DNA病毒乙型肝炎病毒的聚合酶（P）基因被靶定用于抑制。因此，在該實施方式中，所述靶核酸至少是聚合酶基因的RNA轉(zhuǎn)錄本。用于靶的效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本互補或基本互補。“基本互補”的意思是序列可雜交或可退火。基本互補優(yōu)選地是與所述靶基因的某一部分大約85%互補。更優(yōu)選地，至少85～90%互補；以及最優(yōu)選地，至少95、96、97、98、99或100%互補。因此，基本互補包括100%互補，但100%互補在貫穿本說明書中同樣可以被指定為“互補的”或“是互補的”。與靶基因的某一區(qū)域互補或基本互補的序列具有在連續(xù)靶序列的序列互補度。通常，將對本發(fā)明的雙鏈RNA區(qū)域進(jìn)行誘變以產(chǎn)生單一或幾個核苷酸取代、缺失或添加。“治療組合物”或“藥物組合物”或“用于治療HBV感染的組合物”指包括ddRNAi制劑、ddRNAi表達(dá)盒、ddRNAi構(gòu)建體或siRNA制劑的組合物。表述“治療”或“處理”指治療學(xué)上的處理，其中將減慢（減輕）所述個體的不期望的生理變化或紊亂。出于本發(fā)明的目的，有益的或期望的臨床結(jié)果包括但不限于：無論可觀察的或不可觀察的，HBV感染癥狀的減輕、HBV的感染性減少、疾病程度的縮小、疾病狀態(tài)穩(wěn)定（即，不惡化）、疾病進(jìn)程的延遲或減慢、疾病狀態(tài)的改善或緩和，以及好轉(zhuǎn)（無論部分地或全部地）?！爸委煛币部梢员硎九c如果不接受治療所期望的存活期相比延長的存活期。治療可以不必要地導(dǎo)致HBV感染的完全清除，但是可以減少或最小化并發(fā)癥和感染的負(fù)作用以及感染的進(jìn)程。短語“治療有效量”表示本發(fā)明的化合物的量為：（i）治療具體疾病、狀況或失調(diào)，（ii）減弱、改善或消除具體疾病、狀況或失調(diào)的一種或多種癥狀，或者（iii）延遲本文所述的具體疾病、狀況或失調(diào)的一種或多種癥狀的發(fā)作。具體描述本發(fā)明提供一種新的RNAi制劑，所述RNAi制劑用于靶定感染的個體中HBV的應(yīng)用。HBV的治療的目標(biāo)是：i消除感染性以防止HBV從一個個體傳播和擴散至另一個個體；以及ii將感染的個體中的肝病的全部進(jìn)程最小化。ddRNAi制劑從DNA基礎(chǔ)的ddRNAi表達(dá)盒表達(dá)的RNAi制劑被稱為DNA-指導(dǎo)的RNAi制劑或者ddRNAi制劑。它們可以直接靶定基因活性并且具有最小程度的脫靶事件?！懊摪惺录敝负怂岫皇撬霭械谋磉_(dá)不被所述RNAi或ddRNAi制劑抑制。在HBV感染的情況中，這提供了處理未滿足的用于HBV的臨床治療要求的唯一機會。因此，在本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中一條或多條靶序列的表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑包括至少：一條長度是至少17個核苷酸的第一效應(yīng)器序列；和一條第一效應(yīng)器互補序列；其中，第一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。典型地，所述第一效應(yīng)器序列與第一效應(yīng)器互補序列形成雙鏈區(qū)域。本發(fā)明的ddRNAi制劑的序列與所述HBV基因的一個區(qū)域具有充分的互補性以介導(dǎo)靶特異RNAi?！盎净パa”的意思是所述序列可雜交或可退火，以及任一的：·所述第一效應(yīng)器序列的序列與所述靶序列的至少17個或更多個連續(xù)核苷酸有至少大約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90%的互補；更優(yōu)選地，與所述靶序列的17個或更多個連續(xù)核苷酸有至少大約90、91、92、92、94或者95%互補，以及甚至更優(yōu)選地，有至少大約95、96、97、98或者99%互補或絕對互補（即，100%）；或者，·所述效應(yīng)器序列有至少10個或更多個連續(xù)核苷酸能夠與所述靶100%互補，以及優(yōu)選地少于6個核苷酸不能與所述靶序列堿基配對。因此，所述第一效應(yīng)器序列可以有1、2、3、4或5個核苷酸序列將不與所述靶序列形成G-C/A-U堿基配對?？梢韵嘈?，這個水平的差異將不會負(fù)面影響所述ddRNAi制劑的能力以能夠抑制所述靶序列的表達(dá)。當(dāng)所述第一效應(yīng)器序列確實有1、2、3、4或5個核苷酸將不與所述靶序列形成G-C/A-U堿基配對時，優(yōu)選地，所述差異是在所述第一效應(yīng)器序列的最開始或最后5個核苷酸，而在所述效應(yīng)器序列的中心部分僅有1或2個核苷酸變化。所述ddRNAi制劑也可以包括由長度是17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸組成的第一效應(yīng)器序列，其中所述效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。因此，一種根據(jù)本發(fā)明的該實施方式的ddRNAi制劑的最大長度由效應(yīng)器序列的長度和數(shù)量決定，即，每一條效應(yīng)器序列并不包括在一條更長的序列中。如上所述，基本互補意味著所述序列是可雜交或可退火的。所述術(shù)語“雜交”和“退火”（以及語法上的等價物）在本說明書中關(guān)于核苷酸序列可交換使用并表示能夠基于它們的互補性形成沃森-克里克堿基配對的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述基本互補序列能夠在中度或高度嚴(yán)格條件下雜交：高度嚴(yán)格條件：0.1×SSPE（或者0.1×SSC），0.1%SDS，65℃；中度嚴(yán)格條件：0.2×SSPE（或者0.1×SSC），0.1%SDS，50℃。可選地，“基本互補”也可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為包括非沃森-克里克堿基配對，特別是在關(guān)于RNA序列的內(nèi)容中，例如一種被稱為“搖擺配對”，它可以在RNA的鳥苷和尿嘧啶殘基之間形成?！盎パa”在本文中以它通常的方式被使用，以表示沃森-克里克堿基配對，而“非互補”用于表示非沃森-克里克堿基配對，即使這樣的非互補序列可以形成搖擺配對或其它相互作用。在本發(fā)明的上下文中，提及“非配對”序列特別表示序列之間沒有形成沃森-克里克堿基配對的序列。所述第一效應(yīng)器序列的長度至少是17個核苷酸，優(yōu)選地17至50個核苷酸，以及最優(yōu)選地17至30個核苷酸。長度可以是17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30個核苷酸。當(dāng)所述第一效應(yīng)器序列長于17個核苷酸時，優(yōu)選地，所述第一效應(yīng)器序列的至少17個連續(xù)核苷酸形成具有互補鏈的雙鏈區(qū)。本發(fā)明的ddRNAi制劑抑制HBV核酸序列的表達(dá)。優(yōu)選地，所述HBV靶基因是作為聚合酶（P）基因被表達(dá)的核酸序列。因此，在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的ddRNAi制劑抑制乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶基因中一條或多條靶序列的表達(dá)。所述HBV基因組具有重疊的開放閱讀框。就這點而言，靶定所述聚合酶基因的特定序列同樣也是靶定重疊基因中的相同序列。因此，本發(fā)明的制劑能夠靶定具有單一的效應(yīng)器序列的多個基因。但是在每一種優(yōu)選的實施方式中，至少靶定所述聚合酶基因。在具體實施方式中，所述第一效應(yīng)器序列選自下面所列出的SEQIDNO:1～19或SEQIDNO:20～27的ddRNAiHBV聚合酶效應(yīng)器序列的任意一條序列中的任何10個或更多個、以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。出于簡明考慮，所述SEQIDNO將被共同地指定為SEQIDNO:1～27。表1：RNAi效應(yīng)器序列SEQIDRNAi效應(yīng)器序列aHBV靶位點bnt基因目標(biāo)c1GAUUGACGAUAAGGGAGA109-12618pol2UUGAAGUCCCAAUCUGGAU2935-295319pol3GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC1139-116123pol4UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGAGUUAUC1335-136329pol5UCCUGAUGUGAUGUUCUCCAUGU155-17723pol&HBsAg6AAGGCCUCCGUGCGGUGGGG3019-303820pol7GGUAUUGUUUACACAGAAAGGC1116-113722pol8GAUGUGUUCUUGUGGCAAG908-92619pol9GGGAAAGCCCUACGAACCACU698-71821pol&HBsAg10GUGGAGACAGCGGGGUAGGC3128-314720pol11GAGGACAACAGAGUUAUC1335-135218pol12GCCCACUCCCAUAGGAAUUUUCC631-65323pol&HBsAg13GGAUCUUGCAGAGUUUGG18-3518pol14CGUUGCCGGGCAACGGGGUA1146-116520pol15GCAAUUUCCGUCCGAAGGUUUGG575-59723pol&HBsAg16GUUGGAGGACAGGAGGUUGG340-35920pol&HBsAg17GUUGGAGGACAGGAGGUUGGUG338-35922pol&HBsAg18GAAGUGCACACGGUCCGGCAGA1568-158922pol&X19CAAGAUGCUGUACAGACUUGGC762-78322pol&HBsAg20GGGAGAGGACAACAGAGUUAUC1335-135622pol21CGGGAGAGGACAACAGAGUUAU1336-135722pol22GCGGGAGAGGACAACAGAGUUA1337-135822pol23UGCGGGAGAGGACAACAGAGUU1338-135922pol24UUGCGGGAGAGGACAACAGAGU1339-136022pol25UUUGCGGGAGAGGACAACAGAG1340-136122pol26AUUUGCGGGAGAGGACAACAGA1341-136222pol27UAUUUGCGGGAGAGGACAACAG1342-136322pola基于根據(jù)GenbankIDU95551的HBV基因組的靶的效應(yīng)器序列的序列。bHBV基因組內(nèi)的靶位點，基于U95551的序列；效應(yīng)器序列是這些位點的反向互補序列。c靶定的ORF：pol對應(yīng)聚合酶；HBsAg對應(yīng)HBV表面抗原；以及X對應(yīng)X蛋白。如在背景技術(shù)部分所解釋的，dsRNA的兩條鏈都有成為效應(yīng)器序列的潛質(zhì)。但是，有證據(jù)表明一條序列的特殊性質(zhì)可以促使一條鏈進(jìn)入RISC并且破壞另一條鏈。有證明表明，所述RISC復(fù)合體的蛋白Argonaut2（AGO2）對具有5’A的序列有偏好，而對5’U的偏好程度較少。此外，由于一種“感受”整個RNA雙鏈體中的熱力學(xué)穩(wěn)定性且偏好從所述雙鏈體的較不穩(wěn)定末端合并序列的機制，在5’區(qū)域具有較高的AU含量的RNA序列似乎更易于被置于RISC復(fù)合體內(nèi)。這些序列偏好在優(yōu)選的實施方式中得以反映，但不是必須的。例如，在本發(fā)明的該方面的一種實施方式中，提供了一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中一種或多種靶序列的表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑至少包括：一條為GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQIDNO:1)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第一效應(yīng)器序列；以及一條第一效應(yīng)器互補序列。所述第一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。優(yōu)選地，所述第一效應(yīng)器序列是GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQIDNO:1)中的至少17個或更多個連續(xù)核苷酸。當(dāng)所述第一效應(yīng)器與SEQIDNO:1相比具有1、2、3、4或5個不同的核苷酸時，所述差異優(yōu)選地存在于最初和/或最后5個核苷酸；并且至少中心的10個核苷酸與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。在可選的實施方式中，所述ddRNAi制劑包括一條第一效應(yīng)器序列，所述第一效應(yīng)器序列是以下序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQID:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26和SEQIDNO:27。在具體優(yōu)選的實施方式中，所述ddRNAi制劑包括一條第一效應(yīng)器序列，所述第一效應(yīng)器序列是能夠抑制靶基因區(qū)域至少70%表達(dá)的序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，在該實施方式中，所述第一效應(yīng)器選自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。所述第一效應(yīng)器序列可以包括選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸的序列，或者可選地，每一效應(yīng)器序列可以是具有1、2、3、4或5個核苷酸變異的SEQIDNO:1～27變異體。在另一種實施方式中，每一效應(yīng)器序列可以由22個核苷酸組成，其中的17、18、19、20、21或全部22個核苷酸是來自于選自SEQIDNO:1～27的一條序列的連續(xù)核苷酸。多靶定ddRNAi制劑在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述ddRNAi制劑包括兩種或更多種能夠靶定HBV基因組中的多于一種靶序列的效應(yīng)器序列。所述多種靶序列可以是在所述HBV基因的同一區(qū)域中。例如，一個在不同種類之間的序列中具有天然變異的17～30個核苷酸的區(qū)域，或者已經(jīng)賦予抗藥性的單核苷酸多態(tài)性?？蛇x地，所述靶序列可以位于一個靶基因的不同區(qū)域中。為提供更高的特異性，所述ddRNAi制劑包括以下內(nèi)容（無特殊順序）：·一條長度是至少17個核苷酸的第一效應(yīng)器序列；·一條長度是至少17個核苷酸的第二效應(yīng)器序列；·一條第一效應(yīng)器互補序列；和·一條第二效應(yīng)器互補序列。所述多靶定ddRNAi制劑的第一和第二效應(yīng)器序列與它們各自的效應(yīng)器互補序列形成雙鏈區(qū)域。優(yōu)選地，所述第一和第二效應(yīng)器序列的長度是17～30個核苷酸。更優(yōu)選地，所述第一和第二效應(yīng)器序列均選自上述表1中列出的任何一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸，或者是與上述表1中列出的那些序列有1、2、3、4或5個核苷酸差異的序列。在一種實施方式中，所述第一效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:1～27的任何一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸，以及所述第二效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:1～27任何一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。所述第一和第二效應(yīng)器序列可以是相同序列，或者可選地可以是不相同序列。所述第一和第二效應(yīng)器序列的每一個可以包括一條序列，所述序列選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸，或者可選地，每一效應(yīng)器序列也可以是具有1、2、3、4或5個核苷酸變異的SEQIDNO:1～27變異體。在另一種實施方式中，每一效應(yīng)器序列可以由22個核苷酸組成，其中的17、18、19、20、21或全部22個核苷酸是來自選自SEQIDNO:1～27的一條序列的連續(xù)核苷酸。當(dāng)有兩種或更多種效應(yīng)器序列時，它們可以代表上述3種類型的組合。在具體優(yōu)選的實施方式中，所述第一和第二效應(yīng)器序列包括能夠抑制靶基因區(qū)域至少70%表達(dá)的序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，在該實施方式中，每一效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。具有多種效應(yīng)器序列的ddRNAi制劑的應(yīng)用具有限制逃避突變株的出現(xiàn)和靶定逃避突變株的優(yōu)勢，所述逃避突變株是目前許多抗病毒治療的一個問題。本發(fā)明的一個方面用含有RNAi序列的ddRNAi制劑中和出現(xiàn)的逃避突變株，所述RNAi序列基于所述靶基因的基因序列以及另外地出現(xiàn)以抵抗RNAi治療的點突變的序列。相似地，具有多種效應(yīng)器序列的ddRNAi制劑具有能夠靶定在不同病毒基因型或準(zhǔn)種中發(fā)現(xiàn)的一定范圍的序列的優(yōu)勢，以及與單一效應(yīng)器序列相對的由多種效應(yīng)器序列實現(xiàn)的累加或協(xié)同效應(yīng)的優(yōu)勢。但是，如上所提及的，當(dāng)所述靶序列在兩種或更多種基因中相同時，單一效應(yīng)器序列能夠?qū)崿F(xiàn)多種靶定。HBV包含多種重疊的閱讀框，使得靶定重疊區(qū)域中的一個序列將抑制包含所述序列的兩種基因的表達(dá)。長發(fā)夾形式當(dāng)所述ddRNAi制劑包含多于一種效應(yīng)器序列時，所述ddRNAi制劑以單鏈RNA表達(dá)，基于所述效應(yīng)器序列和與所述效應(yīng)器序列互補的序列的順序，它將折疊以形成不同結(jié)構(gòu)。在一種實施方式中，提供了一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑至少包括（5’至3’方向）：一條長度是至少17個核苷酸的第一效應(yīng)器序列；一條長度是至少17個核苷酸的第二效應(yīng)器序列；一條第二效應(yīng)器互補序列；和一條第一效應(yīng)器互補序列，其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。這將導(dǎo)致一種具有如圖1A所示結(jié)構(gòu)的ddRNAi制劑。同樣可以參見WO2004/106517，所述內(nèi)容通過引用的方式結(jié)合至本文?？蛇x地，至少一種效應(yīng)器，以及優(yōu)選地兩種效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。優(yōu)選地，所述第一和第二效應(yīng)器序列均選自SEQIDNO:1～27中任何一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。例如，在一種實施方式中，提供了一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列的表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑至少包括（5’至3’方向）：一條為GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQIDNO:1)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第一效應(yīng)器序列；一條為UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQIDNO:2)或GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQIDNO:3)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第二效應(yīng)器序列；一條第二效應(yīng)器互補序列；和一條第一效應(yīng)器互補序列。每一效應(yīng)器序列與所述靶序列的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。可選地，至少一種效應(yīng)器，以及優(yōu)選地兩種效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。在具體優(yōu)選的實施方式中，所述第一和第二效應(yīng)器序列包括能夠抑制一個靶基因區(qū)域至少70%表達(dá)的序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，在該實施方式中，每一效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。在另一種實施方式中（其中所述ddRNAi制劑具有三種效應(yīng)器序列），提供了一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列的表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑至少包括（5’至3’方向）：一條為GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQIDNO:1)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第一效應(yīng)器序列；一條為UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQIDNO:2)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第二效應(yīng)器序列；一條為GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQIDNO:3)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第三效應(yīng)器序列；一條第三效應(yīng)器互補序列；一條第二效應(yīng)器互補序列；和一條第一效應(yīng)器互補序列。每一效應(yīng)器序列與所述靶序列的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。可選地，至少一種效應(yīng)器，以及可選地，三種中的兩種或者全部三種效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。在具體優(yōu)選的實施方式中，所述第一、第二和第三效應(yīng)器序列包括能夠抑制一個靶基因區(qū)域至少70%表達(dá)的序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，在該實施方式中，每一效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，如果一種單一的、長的發(fā)夾結(jié)構(gòu)是由所述效應(yīng)器序列與它的效應(yīng)器互補序列退火而形成dsRNA，那么所述效應(yīng)器和效應(yīng)器互補序列的順序可以變化。例如，在一種含有兩種效應(yīng)器序列的ddRNAi制劑中，所述序列可以下面例舉的5’至3’順序設(shè)置：·第一效應(yīng)器-第二效應(yīng)器-第二效應(yīng)器互補序列-第一效應(yīng)器互補序列；·第一效應(yīng)器-第二效應(yīng)器互補序列-第二效應(yīng)器-第一效應(yīng)器互補序列；·第一效應(yīng)器互補序列-第二效應(yīng)器互補序列-第二效應(yīng)器-第一效應(yīng)器；·第一效應(yīng)器互補序列-第二效應(yīng)器-第二效應(yīng)器互補序列-第一效應(yīng)器。在一種包含三種效應(yīng)器序列的ddRNAi制劑中，所述序列可以下面例舉的5’至3’順序設(shè)置：·第一效應(yīng)器-第二效應(yīng)器-第三效應(yīng)器-第三效應(yīng)器互補序列-第二效應(yīng)器互補序列-第一效應(yīng)器互補序列；·第一效應(yīng)器-第二效應(yīng)器互補序列-第三效應(yīng)器-第三效應(yīng)器互補序列-第二效應(yīng)器-第一效應(yīng)器互補序列；·第一效應(yīng)器-第二效應(yīng)器-第三效應(yīng)器互補序列-第三效應(yīng)器-第二效應(yīng)器互補序列-第一效應(yīng)器互補序列；·第一效應(yīng)器互補序列-第二效應(yīng)器互補序列-第三效應(yīng)器互補序列-第三效應(yīng)器-第二效應(yīng)器-第一效應(yīng)器互補序列；·第一效應(yīng)器互補序列-第二效應(yīng)器互補序列-第三效應(yīng)器-第三效應(yīng)器互補序列-第二效應(yīng)器-第一效應(yīng)器。在其它實施方式中，所述第一效應(yīng)器序列可以選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸；所述第二效應(yīng)器序列可以選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸；所述第三效應(yīng)器序列可以選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸；以及任何更多效應(yīng)器序列可以選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。可選地，每一效應(yīng)器序列可以是具有1、2、3、4或5個核苷酸變異的SEQIDNO:1～27變異體。優(yōu)選地，所述差異存在于最初和/或最后5個核苷酸，并且至少中心11～12個核苷酸與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。這樣的實施方式對于靶定HBV逃逸突變株以及不同的病毒基因型或準(zhǔn)種特別有用。所述第一、第二和第三效應(yīng)器序列的每一個可以包括一條序列，所述序列選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸，或者可選地，每一效應(yīng)器序列也可以是具有1、2、3、4或5個核苷酸變異的SEQIDNO:1～27變異體。在另一種實施方式中，每一效應(yīng)器序列可以由22個核苷酸組成，其中的17、18、19、20、21或全部22個核苷酸是來自選自SEQIDNO:1～27的一條序列的連續(xù)核苷酸。當(dāng)有多種效應(yīng)器序列時，它們可以代表上述3種類型的組合。多發(fā)夾形式在另一種實施方式中，提供了一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑至少包括（5’至3’方向）：一條長度是至少17個核苷酸的第一效應(yīng)器序列；一條第一效應(yīng)器互補序列；一條長度是至少17個核苷酸的第二效應(yīng)器序列；和一條第一效應(yīng)器互補序列，其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補?？蛇x地，至少一種效應(yīng)器序列、優(yōu)選地兩種效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。取決于所使用的表達(dá)ddRNAi制劑的表達(dá)盒的類型，這將導(dǎo)致具有在圖1B或C中顯示的結(jié)構(gòu)的ddRNAi制劑（詳見本說明書中后面內(nèi)容）。同樣可參見WO2005/087926和WO2006/084209，所述內(nèi)容通過引用的方式結(jié)合至本文。優(yōu)選地，所述第一和第二效應(yīng)器序列均選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。例如，在一種實施方式中，提供了一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列的表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑至少包括（5’至3’方向）：一條為GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQIDNO:1)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第一效應(yīng)器序列；一條第一效應(yīng)器互補序列；一條為UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQIDNO:2)或GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQIDNO:3)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第二效應(yīng)器序列；和一條第二效應(yīng)器互補序列。每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。可選地，至少一種效應(yīng)器序列、優(yōu)選地兩種效應(yīng)器序列均與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。在具體優(yōu)選的實施方式中，所述第一和第二效應(yīng)器序列包括能夠抑制一個靶基因區(qū)域至少70%表達(dá)的序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，在該實施方式中，每一效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。在一種所述ddRNAi制劑具有三種效應(yīng)器序列的實施方式中，提供了一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列的表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑至少包括（5’至3’方向）：一條為GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQIDNO:1)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第一效應(yīng)器序列；一條第一效應(yīng)器互補序列；一條為UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQIDNO:2)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第二效應(yīng)器序列；一條第二效應(yīng)器互補序列；一條為GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQIDNO:3)中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第三效應(yīng)器序列；和一條第三效應(yīng)器互補序列。每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。可選地，至少一種效應(yīng)器，以及可選地，三種中的兩種或者全部三種效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。在具體優(yōu)選的實施方式中，所述第一、第二和第三效應(yīng)器序列包括能夠抑制一個靶基因區(qū)域至少70%表達(dá)的序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，在該實施方式中，每一效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。在其它實施方式中，所述第一效應(yīng)器序列可以是選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸；所述第二效應(yīng)器序列可以是選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸；所述第三效應(yīng)器序列可以是選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸；以及任何更多效應(yīng)器序列可以是選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，每一效應(yīng)器序列至少是17個連續(xù)核苷酸。每一效應(yīng)器序列可以是具有1、2、3、4或5個核苷酸變異的SEQIDNO:1～27變異體。優(yōu)選地，所述差異存在于最初和/或最后5個核苷酸，并且至少中心10～12個核苷酸與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。這樣的實施方式對于靶定HBV逃逸突變株以及不同的病毒基因型或準(zhǔn)種特別有用。所述第一、第二和第三效應(yīng)器序列的每一個可以包括一條序列，所述序列選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸，或者可選地，每一效應(yīng)器序列也可以是具有1、2、3、4或5個核苷酸變異的SEQIDNO:1～27變異體。在另一種實施方式中，每一效應(yīng)器序列可以由22個核苷酸組成，其中的17、18、19、20、21或全部22個核苷酸是來自選自SEQIDNO:1～27的一條序列的連續(xù)核苷酸。當(dāng)有多種效應(yīng)器序列時，它們可以代表上述3種類型的組合。此外，在長發(fā)夾結(jié)構(gòu)或多發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，根據(jù)以下式子之一，所述ddRNAi制劑可以包括額外的效應(yīng)器序列和對應(yīng)的互補序列：長發(fā)夾：·[效應(yīng)器序列]1-10[效應(yīng)器互補序列]1-10多發(fā)夾：·[效應(yīng)器序列-效應(yīng)器互補序列]1-10優(yōu)選地，在長發(fā)夾式子中，效應(yīng)器序列的數(shù)量與效應(yīng)器互補序列的數(shù)量相同。典型地，有2、3、4或5種效應(yīng)器序列以及相應(yīng)地分別2、3、4或5種效應(yīng)器互補序列。當(dāng)所述ddRNAi制劑包含多于一種效應(yīng)器序列時，所述效應(yīng)器序列可以相同或不同。例如，如果ddRNAi制劑具有3種效應(yīng)器序列，其中2種效應(yīng)器序列可以具有相同序列，而1種具有不同序列?？蛇x地，全部3種效應(yīng)器序列可以不同。優(yōu)選地，所述效應(yīng)器序列是選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸，或者是具有1、2、3、4或5個核苷酸變異的SEQIDNO:1～27的序列的變異體。優(yōu)選地，所述差異存在于最初和/或最后5個核苷酸，并且至少中心10～12個核苷酸與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本100%互補。當(dāng)靶定一個靶序列的單一區(qū)域時，所述靶序列具有天然存在的變異體（如不同基因型或準(zhǔn)種）、逃逸突變株或單核苷酸多態(tài)性（SNP），優(yōu)選地，至少一種效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸，而其它效應(yīng)器序列是所述選擇的序列的變異體。例如，一條第一效應(yīng)器序列可以包括SEQIDNO:1的20個核苷酸；而第二效應(yīng)器序列因此可以是SEQIDNO:1的一個變異體。發(fā)夾結(jié)構(gòu)在上述的實施方式中，所述效應(yīng)器序列與它對應(yīng)的效應(yīng)器互補序列雜交以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在所述發(fā)夾的末端，兩個或更多個未結(jié)合的核苷酸形成“鉸鏈”或“環(huán)”。在一種實施方式中，所述未結(jié)合的核苷酸是所述效應(yīng)器序列和效應(yīng)器互補序列的一部分，使得所述至少17個核苷酸的效應(yīng)器序列的僅一部分將與它對應(yīng)的效應(yīng)器互補序列形成雙鏈體。例如，當(dāng)所述效應(yīng)器序列和它的互補序列的長度均是22個核苷酸時，其中的19個核苷酸可以堿基配對以形成雙鏈區(qū)域，留下一共6個核苷酸（每鏈3個）以在所述效應(yīng)器序列和它的效應(yīng)器互補序列之間形成單鏈環(huán)并連接所述效應(yīng)器序列和它的效應(yīng)器互補序列。在另一種實施方式中，所述ddRNAi可以包括一條額外序列，所述額外序列與其本身、所述靶序列、所述效應(yīng)器序列或與所述效應(yīng)器序列互補的序列都不互補。就這點而言，在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述ddRNAi制劑進(jìn)一步包括一條能夠形成環(huán)的2～100個未配對的核苷酸、優(yōu)選地2～10個未配對的核苷酸的序列。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述環(huán)包括核苷酸序列AA、UU、UUA、UUAG、UUACAA、CAAGAGA或N1AAN2，其中N1和N2是C、G、U和A中的任何一種，并且可以是相同的或不同的。取決于所述ddRNAi制劑的結(jié)構(gòu)，可以有一種或更多種環(huán)。當(dāng)ddRNAi制劑具有基于式子[效應(yīng)器序列]1-10[效應(yīng)器互補序列]1-10的長發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，如圖1D所例示的，在所述最后效應(yīng)器序列和最后效應(yīng)器序列的效應(yīng)器互補序列之間包含產(chǎn)生單環(huán)結(jié)構(gòu)的額外的非自身互補序列。在該實施方式中，因此，提供一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑至少包括（5’至3’方向）：一條長度是至少17個核苷酸的第一效應(yīng)器序列；一條長度是至少17個核苷酸的第二效應(yīng)器序列；一條2～100個非自身互補核苷酸的序列；一條第二效應(yīng)器互補序列；和一條第一效應(yīng)器互補序列，其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。當(dāng)所述ddRNAi制劑具有基于式子[效應(yīng)器序列-效應(yīng)器互補序列]1-10的多發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，如圖1E和F所例示的（取決于所使用的表達(dá)它的表達(dá)盒種類，見說明書后面的內(nèi)容），在每一效應(yīng)器序列和它的互補序列之間包含額外的非自身互補序列以產(chǎn)生環(huán)結(jié)構(gòu)。在該實施方式中，因此，提供一種用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列表達(dá)的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）制劑，所述ddRNAi制劑至少包括（5’至3’方向）：一條長度是至少17個核苷酸的第一效應(yīng)器序列；一條2～100個非自身互補核苷酸的序列；一條第一效應(yīng)器互補序列；一條長度是至少17個核苷酸的第二效應(yīng)器序列；一條2～100個非自身互補核苷酸的序列；和一條第二效應(yīng)器互補序列；其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。在該實施方式中有多于兩種效應(yīng)器和兩種效應(yīng)器互補序列以及因此的多于兩種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，形成每一環(huán)結(jié)構(gòu)的額外非自身互補序列的長度不需要相同。例如，一種環(huán)結(jié)構(gòu)可以有5個核苷酸，而另一種環(huán)結(jié)構(gòu)可以有9個核苷酸。雙鏈ddRNAi制劑本領(lǐng)域技術(shù)人員將可以意識到，沒有必要將整個ddRNAi制劑表達(dá)為一條序列。例如，在本發(fā)明的一種實施方式中，可以產(chǎn)生所述第一效應(yīng)器序列（例如，由一條DNA序列轉(zhuǎn)錄），然后可以產(chǎn)生所述第一效應(yīng)器互補序列（例如，由分開的DNA序列轉(zhuǎn)錄）。任選地，環(huán)序列可以連接至任一轉(zhuǎn)錄本或者所述環(huán)的一部分連接至一條轉(zhuǎn)錄本的3’末端和另一條轉(zhuǎn)錄本的5’末端。在細(xì)胞中，兩條轉(zhuǎn)錄本然后經(jīng)由在所述效應(yīng)器序列和它們的互補序列之間退火而雜交形成ddRNAi制劑。體外表達(dá)的ddRNAi制劑或化學(xué)合成的siRNA制劑盡管設(shè)想慢性HBV感染的有效治療將需要從ddRNAi構(gòu)建體（將在下文概述）在體內(nèi)表達(dá)的ddRNAi制劑，也可能有需要施用在體外表達(dá)的ddRNAi制劑或施用化學(xué)合成的siRNA的情況，由此不僅僅作為瞬時治療起作用。例如，急性HBV感染可以從使用siRNA的短期治療中收益，所述siRNA在細(xì)胞中不整合和復(fù)制。因此，本發(fā)明的ddRNAi制劑可以體外表達(dá)，然后遞送至靶細(xì)胞。可選地，siRNA可以化學(xué)合成，然后遞送至靶細(xì)胞。根據(jù)此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一種小干擾RNAi制劑（siRNA制劑），用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中一種或多種靶序列的表達(dá)，所述siRNA包括：一條長度是至少17個核苷酸的第一效應(yīng)器序列；和一條第一效應(yīng)器互補序列；其中所述效應(yīng)器序列與靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。與上面所述的ddRNAi制劑相似，所述siRNA制劑也可以包括用于多靶定的多于一種的效應(yīng)器序列。所述效應(yīng)器序列優(yōu)選地靶定所述HBV聚合酶基因，以及最優(yōu)選地，選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。在siRNA的設(shè)計中可以包含適當(dāng)?shù)撵`活性。典型地，siRNA由具有5’-磷酸和3’-羥基殘基的dsRNA分子組成，鏈長度可以在21～29個核苷酸間變化，并可選地可以被設(shè)計為包含2個核苷酸的3’突出。在一些實施方式中，每一鏈可以被合成為N19-27TT（其中TT可以是脫氧核糖核苷酸）?？梢曰谌缟纤龅腟EQIDNO:1～27的區(qū)域容易地設(shè)計siRNA并可以作為單一序列或以任何組合形式醫(yī)療使用。可選地，siRNA制劑可以由單一RNA分子組成，所述單一RNA分子包含與從ddRNAi表達(dá)盒表達(dá)序列相似或相同的效應(yīng)器和效應(yīng)器互補序列。這些序列可以基于SEQIDNO:1～27，并且可以作為單一序列或以任何組合形式醫(yī)療使用?？梢杂眠m當(dāng)保護(hù)的核苷亞磷酰胺和常規(guī)的合成物化學(xué)合成siRNA，所述siRNA因此可以商業(yè)上廣泛應(yīng)用并能夠根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法設(shè)計和合成。在優(yōu)選的實施方式中，所述siRNA具有SEQIDNO:1～27中的一條或多條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸。多種轉(zhuǎn)染試劑已經(jīng)被用于將siRNA遞送至不同的細(xì)胞系。通常使用Lipofectamine2000和Oligofectamine遞送siRNA。同樣已經(jīng)通過水動力轉(zhuǎn)染法遞送裸siRNA。其它遞送方法將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。ddRNAi制劑表達(dá)盒如上面所解釋的，從被插入至任何合適載體或ddRNAi構(gòu)建體的DNA表達(dá)盒表達(dá)ddRNAi制劑。ddRNAi表達(dá)盒包括（沒有特別順序）：·一條或多條啟動子序列；·一條或多條編碼一種或多種效應(yīng)器序列的DNA序列；·一條或多條編碼一種或多種效應(yīng)器互補序列的DNA序列；·一條或多條終止子序列；以及可選地，·一條或多條編碼環(huán)序列的DNA序列；·一條或多條增強子序列。在一種實施方式中，提供一種用于表達(dá)ddRNAi制劑的DNA指導(dǎo)的RNA干擾（ddRNAi）表達(dá)盒，其中所述ddRNAi制劑抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列的表達(dá)，所述ddRNAi表達(dá)盒包括（5’至3’方向）：一條啟動子序列；一條編碼第一效應(yīng)器序列的DNA序列；可選地，一條編碼能夠形成環(huán)的序列的序列；一條編碼第一效應(yīng)器互補序列的DNA序列；以及一條終止子序列。所述編碼第一效應(yīng)器序列的DNA序列優(yōu)選地是編碼SEQIDNO:1～27中的任意一條序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地17個或更多個連續(xù)核苷酸的DNA。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述第一效應(yīng)器序列包括能夠抑制一個靶基因區(qū)域至少70%表達(dá)的序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，在該實施方式中，所述第一效應(yīng)器序列選自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。可選地，如在上文關(guān)于ddRNAi制劑本身的內(nèi)容中所概述的，編碼所述效應(yīng)器序列的序列可以編碼與SEQIDNO:1～27有1、2、3、4或5個核苷酸變化的效應(yīng)器序列，而不影響所編碼的效應(yīng)器序列與所述靶序列堿基配對和抑制所述靶序列表達(dá)的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，編碼任意給出的RNA序列的DNA序列是與所述RNA序列相同，但將胸腺嘧啶（T）堿基替換為尿嘧啶（U）堿基的序列。編碼具有在長發(fā)夾結(jié)構(gòu)中多于一種效應(yīng)器序列的ddRNAi制劑的ddRNAi表達(dá)盒包括（5’至3’方向）：一條啟動子序列；一條編碼第一效應(yīng)器序列的DNA序列；一條編碼第二效應(yīng)器序列的DNA序列；可選地，一條編碼能夠形成環(huán)的序列的序列；一條編碼第二效應(yīng)器互補序列的DNA序列；一條編碼第一效應(yīng)器互補序列的DNA序列；以及一條終止子序列。優(yōu)選地，所述DNA序列編碼第一和第二效應(yīng)器序列，所述第一和第二效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，所述第一和第二效應(yīng)器序列選自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。可選地，所述DNA序列編碼效應(yīng)器序列，所述效應(yīng)器序列與SEQIDNO:1～27有1、2、3、4或5個核苷酸變化，但不影響所編碼的效應(yīng)器序列與所述靶序列堿基配對并抑制所述靶序列的表達(dá)的能力。當(dāng)所述ddRNAi制劑具有多于一種效應(yīng)器序列和基于式子[效應(yīng)器序列-效應(yīng)器互補序列]1-10的多發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，每一[效應(yīng)器序列-效應(yīng)器互補序列]對的表達(dá)可以由唯一的啟動子或可選地由分開的啟動子控制。當(dāng)預(yù)期采用分開的啟動子時，所述ddRNAi表達(dá)盒包括（5’至3’方向）：一條啟動子序列；一條編碼第一效應(yīng)器序列的DNA序列；一條編碼第一效應(yīng)器互補序列的DNA序列；可選地，一條終止子序列；一條啟動子序列；一條編碼第二效應(yīng)器序列的DNA序列；一條編碼第二效應(yīng)器互補序列的DNA序列；和一條終止子序列。當(dāng)預(yù)期采用唯一啟動子時，所述ddRNAi表達(dá)盒包括（5’至3’方向）：一條啟動子序列；一條編碼第一效應(yīng)器序列的DNA序列；一條編碼針對第一效應(yīng)器序列的效應(yīng)器互補序列的DNA序列；一條編碼第二效應(yīng)器序列的DNA序列；一條編碼針對第二效應(yīng)器序列的效應(yīng)器互補序列的DNA序列；和一條終止子序列。與上述實施方式相似，所述DNA序列優(yōu)選地編碼第一和第二效應(yīng)器序列，所述第一和第二效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸，或者編碼與SEQIDNO:1～27的序列有1、2、3、4或5個核苷酸變化的效應(yīng)器序列。優(yōu)選地，所述第一和第二效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23?？梢钥蛇x地參考所表達(dá)的ddRNAi制劑的總長度來描述所述ddRNAi表達(dá)盒，所表達(dá)的ddRNAi制劑是所述啟動子和終止子之間全長序列的產(chǎn)物。例如，當(dāng)單一效應(yīng)器ddRNAi中的效應(yīng)器序列的長度由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸組成時，所述ddRNAi表達(dá)盒中所述啟動子和終止子之間的長度將是34至60個核苷酸。這個長度可以進(jìn)一步包括2～100個核苷酸的“環(huán)”或“鉸鏈”序列，使得長度是36～160個核苷酸之間。對于具有多效應(yīng)器序列的ddRNAi制劑而言，當(dāng)每一效應(yīng)器序列由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸組成時，所述全長按比例地增加。設(shè)計本發(fā)明的ddRNAi表達(dá)盒的一種有用方式是假定Dicer在每22個核苷酸處剪切（也被稱為22nt相位），并以所述shRNA為基礎(chǔ)進(jìn)行加工。因此，編碼所述效應(yīng)器序列的DNA序列可以被設(shè)計為編碼SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸，以及合適的間隔子和用于合適的啟動子的其它序列要求。例如，SEQIDNO:1～27中列出的一些序列多于22個核苷酸，在這些情況中，僅一部分序列需要可操作地與啟動子連接。靶定mRNA不同位點的制劑適于shRNA構(gòu)建，因為它們可以避免mRNA的二級結(jié)構(gòu)的影響，并因此獨立地實施它們的功能。當(dāng)使用U6啟動子時，優(yōu)選地所述DNA序列可操作地與以鳥嘌呤（G）堿基起始的啟動子連接；當(dāng)使用H1啟動子時，優(yōu)選地所述DNA序列可操作地與以腺嘌呤（A）堿基起始的啟動子連接。因此，可以修飾所述效應(yīng)器編碼序列。對于SEQIDNO:1～27的一些序列而言，效應(yīng)器序列短于22nt。在這些情況下，優(yōu)選地包括與HBV靶位點鄰近的HBV序列。這可能提供效應(yīng)器序列與HBVmRNA之間最大的同源性并可能允許包括A或G殘基以使得從上述的U6或H1啟動子的有效轉(zhuǎn)錄起始。此外，對于具體的US轉(zhuǎn)錄，期望將所述效應(yīng)器序列置于所述環(huán)的3’位置以避免用于有效U6轉(zhuǎn)錄所必須的5’G。在一些情況中，可能期望避免在效應(yīng)器序列、效應(yīng)器互補序列或環(huán)序列中出現(xiàn)DNA序列TTTT，因為它們能夠在使用PolIII啟動子（如U6或H1）的表達(dá)構(gòu)建體中作為轉(zhuǎn)錄終止子。shRNA設(shè)計還應(yīng)當(dāng)考慮U6終止將在shRNA的3’末端添加UU。當(dāng)設(shè)計長發(fā)夾RNA時，有時候修飾精確選擇的效應(yīng)器序列（使用SEQIDNO:1～27的序列或與其鄰近的序列）是有益的以將Dicer加工的效應(yīng)器序列將包括5’U或A的可能性最大化，因此促進(jìn)融合至AGO2。是否控制每一[效應(yīng)器序列-效應(yīng)器互補序列]對的表達(dá)的選擇取決于多種因素?？梢允褂梦ㄒ粏幼右詫幼又g的干擾最小化。僅具有唯一啟動子的ddRNAi構(gòu)建體的尺寸也將更小，在一些對于所述構(gòu)建體的穩(wěn)定性的情況中（在生產(chǎn)過程中（如，在大腸桿菌中復(fù)制）和遞送過程中）這是重要的。此外，唯一啟動子的使用避免了啟動子之間任何同源重組的可能性。在需要一定程度調(diào)整每一效應(yīng)器序列或效應(yīng)器互補序列的表達(dá)的情況下，設(shè)計具有多個啟動子的ddRNAi構(gòu)建體是有利的，借此，每一[效應(yīng)器序列-效應(yīng)器互補序列]對的表達(dá)由分開的啟動子控制。在所述效應(yīng)器序列是不同序列的情況下，所述序列的性質(zhì)可能意味著一條序列被表達(dá)至更高的表達(dá)水平。當(dāng)期望保證每一效應(yīng)器序列的更相等的表達(dá)水平時，更高表達(dá)的效應(yīng)器序列可以與較弱的啟動子配對，反之亦然。此外，當(dāng)將被轉(zhuǎn)錄的任何一條序列的長度更短時，可以實現(xiàn)更高效的表達(dá)。當(dāng)使用多個啟動子時，優(yōu)選地不是所有的啟動子都相同以將它們之間任何同源重組的風(fēng)險最小化。在2個啟動子的情況下，優(yōu)選地，每一個不相同。在3個啟動子的情況下，至少2個以及可選地全部3個啟動子都彼此不相同。編碼所述效應(yīng)器序列的DNA序列優(yōu)選地可操作地連接至所述啟動子序列。當(dāng)一條序列被置于與另一條核苷酸序列功能上相關(guān)時，所述序列“可操作地連接”至另一條核苷酸序列。例如，如果一條編碼序列可操作地連接至啟動子序列，這通常意味著所述啟動子啟動所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄?？刹僮鞯剡B接意味著所述被連接的DNA序列通常是連續(xù)的，并且當(dāng)需要連接兩個蛋白編碼區(qū)域時，是連續(xù)的且位于閱讀框中。但是，由于增強子可能在當(dāng)與所述啟動子被幾千個堿基分開時起作用且內(nèi)含子序列可能是變化的長度，一些核苷酸序列可能是可操作地連接但是不連續(xù)?！皢幼印被颉皢幼有蛄小被颉皢幼釉蓖ǔＪ且环NDNA調(diào)節(jié)區(qū)域，所述DNA調(diào)節(jié)區(qū)域能夠在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶并引起多核苷酸或多肽編碼序列如mRNA或由任何類型的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的任何種類的RNA的轉(zhuǎn)錄。所述啟動子和終止子可以取自不同基因，但是通常彼此匹配；即，所述啟動子和終止子序列或元件取自它們天然存在的同一基因?？梢允褂梅肿蛹夹g(shù)修飾或不修飾啟動子，例如，通過調(diào)節(jié)元件（如增強子）的突變以獲得更高或更低的轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)涉及啟動子時，術(shù)語“組成型”表示所述啟動子能夠在存在或不存在特定刺激因素（如，熱擊、化學(xué)物質(zhì)、光等）時指導(dǎo)可操作地連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。通常，組成型啟動子能夠指導(dǎo)編碼序列基本上在任何細(xì)胞和任何組織中表達(dá)。在用以轉(zhuǎn)錄所述ddRNAi制劑的表達(dá)盒中使用的啟動子優(yōu)選地是組成型啟動子，如用于泛素、CMV、β-肌動蛋白、組蛋白H4、EF-1α或pgk基因的啟動子，所述基因的表達(dá)通過RNA聚合酶II與啟動子結(jié)合，或被RNA聚合酶I結(jié)合的啟動子元件而控制。在其它實施方式中，使用PolII啟動子，如CMV、SV40、hAAT、U1、β-肌動蛋白或雜交的PolII啟動子。在其它實施方式中，使用被RNA聚合酶III結(jié)合的啟動子元件，如U6啟動子（例如，U6-1、U6-8、U6-9）、H1啟動子、7SL啟動子、人Y啟動子（hY1、hY3、hY4（見Maraia等，NucleicAcidsRes22(15):3045-52(1994))和hY5（見Maraia等，NucleicAcidsRes24(18):3552-59(1994)））、人MRP-7-2啟動子、腺病毒VA1啟動子、人tRNA啟動子、5S核糖體RNA啟動子以及這些啟動子中任何啟動子的功能性雜交體和組合。同樣可以使用這些啟動子的變異體，其中所述啟動子被修飾以減少或增加它的活性。例如，當(dāng)一種強啟動子引起可操作地連接至所述啟動子的序列的過量表達(dá)時，可以修飾所述啟動子以減少它的活性。當(dāng)使用U6啟動子時，優(yōu)選地所述DNA序列可操作地與以鳥嘌呤（G）堿基起始的啟動子連接；當(dāng)使用H1啟動子時，優(yōu)選地所述DNA序列可操作地與以腺嘌呤（A）堿基起始的啟動子連接。因此，所述核酸的序列可能相對于另一種啟動子而偏袒使用一種啟動子?？蛇x地，在一些實施方式中，選擇能夠誘導(dǎo)表達(dá)自所述ddRNAi構(gòu)建體的多ddRNAi制劑表達(dá)的啟動子是最佳的。使用這樣的啟動子的一些用于可誘導(dǎo)表達(dá)的系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于四環(huán)素響應(yīng)系統(tǒng)和lac操縱子-抑制子系統(tǒng)（見WO03/022052A1公開文本和美國專利公開文本2002/0162126A1）、蛻皮激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，或者由糖皮質(zhì)激素、孕酮、雌激素、RU-486、類固醇、甲狀腺激素、環(huán)AMP、細(xì)胞因子、鈣化醇調(diào)節(jié)子家族調(diào)節(jié)的啟動子，或金屬硫蛋白啟動子（由無機金屬調(diào)節(jié)）。在本發(fā)明的一些實施方式中有用的啟動子可以是組織特異的或細(xì)胞特異的。當(dāng)用于啟動子時，術(shù)語“組織特異的”指能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列在特定類型的組織中選擇性表達(dá)而相同的感興趣的核苷酸序列在不同類型的組織（如，大腦）中相對缺乏表達(dá)的啟動子。當(dāng)用于啟動子時，術(shù)語“細(xì)胞特異的”指能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列在特定類型的細(xì)胞中選擇性表達(dá)而相同的感興趣的核苷酸序列在相同組織的不同類型的細(xì)胞中相對缺乏表達(dá)的啟動子。當(dāng)用于啟動子時，術(shù)語“細(xì)胞特異的”也表示能夠啟動感興趣的核苷酸序列在單一組織中的一個區(qū)域中選擇性表達(dá)的啟動子。可選地，啟動子可以是組成型的或可調(diào)節(jié)的。此外，可以對啟動子修飾以具有不同的特異性。在HBV感染的情況下，可以使用肝臟特異啟動子。肝臟特異啟動子的例子是人α抗胰蛋白酶啟動子（hAAT）、阿樸脂蛋白H（ApoH）和卵磷脂膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶啟動子（LCAT）?？蛇x地，可以使用運甲狀腺素蛋白或TTR啟動子。所述TTR啟動子源自鼠前清蛋白基因，并也被稱為前清蛋白。所述全長TTR啟動子通?？刂蒲寮谞钕偎亟Y(jié)合蛋白的表達(dá)，所述蛋白由肝細(xì)胞以及在成人中由脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞產(chǎn)生。在一種實施方式中，優(yōu)選的TTR啟動子是控制脈絡(luò)叢表達(dá)的區(qū)域缺失但是保留驅(qū)動肝特異性表達(dá)的區(qū)域的TTR啟動子。見例如WO2007/120533和US20060189561，所述內(nèi)容通過引用的方式結(jié)合至本文。如上所述，本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體任選地包括增強子元件。一種優(yōu)選的增強子元件是ApoE。所述ApoE增強子元件由源自阿樸脂蛋白E（ApoE）的大約155bp組成。ApoE介導(dǎo)脂蛋白微粒的結(jié)合、內(nèi)化和分解代謝，并且是低密度脂蛋白（ApoB/E）受體和肝組織的ApoE受體的配體。與ApoE基因相關(guān)的基因增強子是能夠增加核酸在肝臟中特異轉(zhuǎn)錄的真核控制元件。所述ApoE增強子可以位于肝特異啟動子的上游或下游2000核苷酸處，并且可以以多于一個拷貝的狀態(tài)存在。ApoE/hAAT是一種優(yōu)選的增強子/啟動子組合?？蛇x地，可以使用合成增強子（SynEnh），如在US20060189561（通過引用的方式結(jié)合至本文）中所描述的。當(dāng)所述ddRNAi表達(dá)盒或構(gòu)建體包含多于一條終止子序列或元件時，所述終止子序列或元件可以是相同的，或者不同的，或者可以是在任何盒內(nèi)僅出現(xiàn)一次的終止元件和出現(xiàn)兩次或更多次的終止元件的組合。無論使用何種的終止序列或元件，需要選擇這些終止序列或元件以保證它們適合與所使用的肝特異啟動子一起工作。在使用PolI、PolII或PolIII啟動子的情況下，可以使用合適的終止子序列。在本發(fā)明中有用的終止元件包括U1終止序列（U1盒）、合成的多聚A終止子以及被稱為最小的多聚A終止子?？梢詫⑥D(zhuǎn)錄中止位點，如MAZ1和MAZ2（見Ashfield等，EMBOJ1994Vol13No235656pp以及Yonaha和ProudfootEMBOJ.2000Jul.17;19(14):3770-7）插入至多聚A終止子的上游以幫助聯(lián)結(jié)轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化。對于PolIII啟動子，序列TTTT、TTTTT或TTTTTT通常被用作終止子。在這些情況下，轉(zhuǎn)錄本通常以序列UU終止。ddRNAi構(gòu)建體-基于病毒的ddRNAi構(gòu)建體的遞送開發(fā)任何HBV治療劑的挑戰(zhàn)是事實上病患中的所有肝細(xì)胞都被感染。就這點而言，需要一種能夠?qū)崿F(xiàn)用本發(fā)明的ddRNAi制劑有效地和一致地轉(zhuǎn)導(dǎo)全部肝細(xì)胞的方法以提供對于慢性HBV感染的有效基因治療。此外，對于有效地體內(nèi)治療HBV感染，本發(fā)明的ddRNAi表達(dá)盒需要能夠被轉(zhuǎn)染至原代細(xì)胞、干細(xì)胞和不分裂細(xì)胞。為克服這個限制，本發(fā)明的ddRNAi表達(dá)盒被引入至遞送載體（優(yōu)選地，所述遞送載體源自病毒，以保證與病毒遞送的相容性）以產(chǎn)生ddRNAi構(gòu)建體。如之前所述的，所述載體骨架可以用于兩種目的：作為表達(dá)載體以及遞送載體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的基因工程技術(shù)完成構(gòu)建體的產(chǎn)生，包括但不限于，標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)、寡核苷酸合成、DNA合成、限制性核酸內(nèi)切酶消化、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒純化和DNA測序。所述構(gòu)建體優(yōu)選地包括，例如，將ddRNAi構(gòu)建體包裝至病毒顆粒所必須的序列和/或使得將所述ddRNAi構(gòu)建體整合至靶細(xì)胞基因組的序列。所述病毒構(gòu)建體也可以包括使得病毒復(fù)制和繁殖的基因，盡管在優(yōu)選的實施方式中，這樣的基因?qū)⒈环词教峁?。此外，所述ddRNAi構(gòu)建體可以包含來自以天然形式或修飾形式融合的任何已知生物體的基因組的基因或基因序列。例如，優(yōu)選的病毒構(gòu)建體包括對于構(gòu)建體在細(xì)菌中復(fù)制有用的序列。所述病毒載體骨架可以選自慢病毒、腺病毒（Adv）和腺相關(guān)病毒（AAV）載體。非整合的病毒載體可以用于本發(fā)明的ddRNAi制劑在分裂細(xì)胞中瞬時表達(dá)，或用于在非分裂細(xì)胞中較長期穩(wěn)定表達(dá)。整合的病毒載體，如慢病毒載體，在分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞中均介導(dǎo)穩(wěn)定的、長期表達(dá)?？蛇x地，如在US20040214329中描述的小環(huán)載體可以用于遞送ddRNAi表達(dá)盒。小環(huán)載體提供持久穩(wěn)定高水平的核酸轉(zhuǎn)錄，并且其特征為缺乏表達(dá)沉默的細(xì)菌序列。AAV載體是非致病性的，并且與其它病毒載體相比具有較少的免疫原性。AAV載體感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞以及在這些組織中指導(dǎo)基因長期表達(dá)的能力使得它成為基因治療中的有用載體。此外，AAV有具有不同組織向性的多種假型。優(yōu)選的AAV載體是雙鏈AAV假型8（dsAAV8）。通常，AAV的基因組僅包含兩個基因?！皉ep”基因編碼至少四種在DNA復(fù)制中使用的單獨的蛋白?！癱ap”基因產(chǎn)物被差異剪切以產(chǎn)生三種蛋白，包括所述病毒的衣殼。當(dāng)將所述基因組包裝至初生病毒中時，僅末端反向重復(fù)序列（ITR）是有作用的序列?？梢詫ep和cap從所述基因組中刪除并由選擇的異源序列取代。但是，為了產(chǎn)生復(fù)制和將基于AAV的異源構(gòu)建體包裝至初生病毒體所需要的蛋白，必須反式提供rep和cap蛋白。通常由用輔助病毒（如腺病毒或皰疹病毒）共感染所提供的輔助功能同樣也可以以一種或多種DNA表達(dá)質(zhì)粒的形式反式提供。由于所述基因組通常僅編碼兩種基因，作為遞送載體，AAV被限定為包裝能力為單鏈4.5千個堿基（kb）是不奇怪的。但是，盡管這個大小限定可能限制了可以被遞送用于替代基因治療的基因，這并不負(fù)面影響更短序列（如ddRNAi載體）的包裝和表達(dá)。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一種包括病毒載體的ddRNAi構(gòu)建體，所述病毒載體插入有根據(jù)本發(fā)明的ddRNAi表達(dá)盒。優(yōu)選地，所述表達(dá)盒編碼多RNAi制劑，如長發(fā)夾結(jié)構(gòu)或多發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在一種實施方式中，所述病毒載體是AAV載體。在產(chǎn)生基于病毒的ddRNAi構(gòu)建體之后，所述構(gòu)建體被包裝至病毒顆粒中。可以使用本領(lǐng)域任何已知的方法來生產(chǎn)有傳染性的病毒顆粒，其基因組包括一個拷貝的病毒ddRNAi構(gòu)建體。一種方法使用包裝細(xì)胞，所述包裝細(xì)胞反式穩(wěn)定表達(dá)將病毒ddRNAi構(gòu)建體融合至病毒顆粒中所需要的病毒蛋白質(zhì)，以及對于具體病毒遞送體系所必需或優(yōu)選的其它序列（如，用于復(fù)制、結(jié)構(gòu)蛋白和病毒裝配的序列）以及用于組織進(jìn)入的病毒來源的或人造的配體。在將病毒ddRNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞之后，所述包裝細(xì)胞然后復(fù)制病毒序列，表達(dá)病毒蛋白并將ddRNAi表達(dá)構(gòu)建體包裝至有傳染性的病毒顆粒。所述包裝細(xì)胞系可以是能夠表達(dá)病毒蛋白的任何細(xì)胞系，包括但不限于293、HeLa、A549、PerC6、D17、MDCK、BHK、紅櫻桃（bingcherry）、phoenix、Cf2Th或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或開發(fā)的其它任何細(xì)胞系。例如，在美國專利號6,218,181中描述了一種包裝細(xì)胞系?？蛇x地，不能穩(wěn)定表達(dá)必需病毒蛋白的細(xì)胞系可以與一種或多種構(gòu)建體一起共轉(zhuǎn)染以實現(xiàn)有效生產(chǎn)功能顆粒。一種構(gòu)建體是基于病毒的ddRNAi構(gòu)建體；另一種構(gòu)建體包括編碼使得細(xì)胞生產(chǎn)功能性病毒以及其它輔助功能所必需的蛋白的核酸。所述包裝細(xì)胞系或復(fù)制和包裝構(gòu)建體可能不表達(dá)外膜基因產(chǎn)物。在這些實施方式中，編碼所述外膜基因的基因可以在分離的構(gòu)建體上提供，所述分離的構(gòu)建體與基于病毒的ddRNAi構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。由于外膜蛋白部分地對病毒顆粒的宿主范圍起作用，所述病毒可以是假型的。如上所述，“假型”病毒是具有來自病毒而不是基因組所源自的病毒的外膜蛋白的病毒顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇用于所使用的病毒遞送系統(tǒng)和被靶定的細(xì)胞的合適假型。除了特定的宿主范圍，所選擇的假型可以將所述病毒濃縮至很高的滴度?？蛇x地，病毒可以用將感染限定在特定物種中的親嗜性外膜蛋白假型（例如，僅允許鼠類細(xì)胞感染的親嗜性外膜，而雙嗜性外膜允許人和鼠類細(xì)胞感染）。此外，基因修飾的配體可以用于細(xì)胞特異靶定，如用于肝細(xì)胞的脫唾液酸糖蛋白，或者用于受體介導(dǎo)的結(jié)合的轉(zhuǎn)鐵蛋白。在包裝細(xì)胞系中生產(chǎn)之后，純化并定量（滴定）包含所述ddRNAi表達(dá)盒的病毒微粒。純化策略包括密度梯度離心，或者優(yōu)選地，柱層析方法。治療方法施用本發(fā)明的ddRNAi制劑、ddRNAi構(gòu)建體或siRNA制劑抑制在感染有HBV的細(xì)胞中HBV基因的表達(dá)。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一種在個體中治療HBV感染的方法，包括向有治療需要的病患提供治療有效量的ddRNAi制劑，其中所述ddRNAi制劑抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中一種或多種靶序列（優(yōu)選地，HBV的聚合酶基因）的表達(dá)。對病患施用的ddRNAi制劑可以是以下一種或多種：·一種ddRNAi制劑，包括第一效應(yīng)器序列和第一效應(yīng)器互補序列；其中所述效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器互補序列和第一效應(yīng)器互補序列；其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器序列，第三效應(yīng)器序列，第三效應(yīng)器互補序列，第二效應(yīng)器互補序列和第一效應(yīng)器互補序列；其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第一效應(yīng)器互補序列，第二效應(yīng)器序列和第二效應(yīng)器互補序列；其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第一效應(yīng)器互補序列，第二效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器互補序列，第三效應(yīng)器序列和第三效應(yīng)器互補序列；其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，第二效應(yīng)器序列，2～100個非自身互補核苷酸的序列，第二效應(yīng)器互補序列和第一效應(yīng)器互補序列；其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補；·一種ddRNAi制劑，從5’到3’方向包括：第一效應(yīng)器序列，2～100個非自身互補核苷酸的序列，第一效應(yīng)器互補序列，第二效應(yīng)器序列，2～100個非自身互補核苷酸的序列和第二效應(yīng)器互補序列；其中每一效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的以及如附圖所例示的，所述制劑中，任何具體的效應(yīng)器序列都可以與其互補序列在位置上互換。在上文所述的每一實施方式的具體形式中，每一個效應(yīng)器序列的長度至少是17個核苷酸，所述核苷酸選自SEQIDNO:1-27的任何一條序列的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。所述效應(yīng)器序列可以全部是相同的，或者全部不同，或者是其組合，例如序列是SEQIDNO:1的至少10個連續(xù)核苷酸的2個效應(yīng)器序列和序列是SEQIDNO:4的至少10個連續(xù)核苷酸的1個效應(yīng)器序列。優(yōu)選地，所述效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:1-27的任何一條序列中的任何連續(xù)11、12、13、14、15或16個核苷酸；最優(yōu)選地，選自SEQIDNO:1-27的任何一條序列中的17個或更多個連續(xù)核苷酸。通常，所述效應(yīng)器互補序列的長度與其對應(yīng)的效應(yīng)器序列的長度相同或大致相同（即，±15%核苷酸長度）。如在本說明書較早章節(jié)中所描述的，可以通過ddRNAi構(gòu)建體中的ddRNAi表達(dá)盒施用這些ddRNAi制劑中的每一種。可以通過遞送兩種或更多種每一種都能夠表達(dá)單一ddRNAi制劑的ddRNAi表達(dá)盒或構(gòu)建體，或者遞送一種或多種每一種都能夠表達(dá)多于一種ddRNAi制劑的ddRNAi表達(dá)盒或構(gòu)建體來實現(xiàn)多靶定。在可選的實施方式中，每一效應(yīng)器序列可以與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本有100%互補性，或者可以僅有1、2、3、4或5個核苷酸變化。治療HBV感染的方法可以可選地包括鑒定感染HBV的個體的初步步驟，包括鑒定HBV分離體的血清型。對于更長期或穩(wěn)定地提供本發(fā)明的ddRNAi制劑，通過本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體提供所述ddRNAi制劑，即，從插入至遞送至所述細(xì)胞的合適的載體的ddRNAi表達(dá)盒體內(nèi)表達(dá)ddRNAi制劑。所述ddRNAi表達(dá)盒包括：·一條或多條啟動子序列；·一條或多條DNA序列，所述DNA序列選自編碼SEQIDNO:1-27的一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的序列；·一條或多條DNA序列，所述DNA序列編碼一條或多條效應(yīng)器互補序列；·一條或多條終止子序列；以及可選地，·一條或多條編碼環(huán)序列的DNA序列；·一條或多條增強子序列。如在本說明書之前所描述的，所述ddRNAi表達(dá)盒的這些成分可以具有不同的5’至3’設(shè)置，都適于在本發(fā)明的方法中使用。在本發(fā)明的方法中，所述HBV靶基因至少是聚合酶（P）基因，以及可能地當(dāng)所述靶序列包含在重疊開放閱讀框中時，所述靶基因是表面抗原或X基因，且所述ddRNAi制劑包括ddRNAi效應(yīng)器序列，所述ddRNAi效應(yīng)器序列是表1中列出的SEQIDNO:1～27中的一條序列的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸?？蛇x地，如之前詳細(xì)描述的，編碼所述效應(yīng)器序列或與所述第一效應(yīng)器序列互補的序列的序列可以與SEQIDNO:1～27有1、2、3、4或5個核苷酸變化，而不影響所編碼的序列與靶序列堿基配對的能力以及抑制HBV靶序列表達(dá)的能力。通常，每一效應(yīng)器序列與其對應(yīng)的效應(yīng)器互補序列形成雙鏈區(qū)域。在另一種實施方式中，治療個體中HBV感染的方法包括施用治療有效量的ddRNAi構(gòu)建體，所述ddRNAi構(gòu)建體編碼具有多于一種如上所列出的那些效應(yīng)器序列的ddRNAi制劑。待治療的HBV感染可以是慢性HBV感染?！奥浴北硎舅鯤BV感染是長效的或持久的。術(shù)語慢性描述了疾病的過程，或它的發(fā)作和進(jìn)展速率。當(dāng)治療慢性HBV感染時，優(yōu)選地施用所述ddRNAi構(gòu)建體并且所述構(gòu)建體穩(wěn)定地保持在或整合至所述靶細(xì)胞，以使得所述ddRNAi制劑的更長期表達(dá)。如上所詳述的，這可以通過使用具有病毒載體骨架的ddRNAi構(gòu)建體而實現(xiàn)。根據(jù)此，提供了一種治療個體中慢性HBV感染的方法，包括對需要治療的病患施用治療有效量的本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體。治療慢性HBV感染的目的是通過干擾病毒復(fù)制減少所述病毒的感染性。這最終降低了HBV傳染和傳播的風(fēng)險。因此提供了一種減少感染有HBV的個體中的HBV感染性的方法，包括對個體施用本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體以靶定HBV基因，優(yōu)選地聚合酶基因。在慢性乙型肝炎治療中使用的臨床端點將與代償?shù)囊倚透窝撞』迹ㄆ渲谐志玫牟《疽种?、血清學(xué)反應(yīng)、組織學(xué)改善、肝功能檢測的標(biāo)準(zhǔn)化和非臨床進(jìn)程是主要的端點）和代償失調(diào)的乙型肝炎病患之間的不同。在代償失調(diào)的疾病病患中，肝臟廣泛地被創(chuàng)傷和纖維化，肝臟損傷的預(yù)防/逆轉(zhuǎn)和疾病過程的預(yù)防和避免肝臟移植是治療的主要目標(biāo)。代償?shù)囊倚透窝椎亩它c是病毒負(fù)荷的減少以及血清學(xué)和生物化學(xué)改進(jìn)、組織學(xué)改進(jìn)、肝臟衰竭和末期肝臟疾病的測量、并發(fā)癥、移植和致死率。在另一種實施方式中，提供了一種將個體中的由HBV感染導(dǎo)致的肝臟疾病的進(jìn)程最小化的方法，包括對個體施用本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體以靶定HBV基因，優(yōu)選地聚合酶基因。在本發(fā)明的另一種實施方式中，提供了一種將個體中與HBV感染有關(guān)的癥狀最小化的方法，包括對個體施用本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體以靶定HBV基因，優(yōu)選地聚合酶基因。個體的HBV感染的狀態(tài)或嚴(yán)重性可以通過測量他們的病毒負(fù)荷而評估?！安《矩?fù)荷”的意思是涉及的體液中病毒的量。例如，可以以RNA拷貝每毫升血漿給出。具有高的病毒負(fù)荷的個體被認(rèn)為具有更嚴(yán)重的HBV感染。可選地，所述病毒負(fù)荷是個體對具體治療的反應(yīng)性的指示。如果所述治療有效并保持低水平的病毒，這表示成功的治療。因此，提供了一種降低患有HBV感染的個體中病毒負(fù)荷的方法，包括對所述個體施用本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體以靶定HBV基因，優(yōu)選地聚合酶基因。隨后的監(jiān)測已接受使用本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體進(jìn)行治療的個體中的病毒負(fù)荷因此是本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體和ddRNAi制劑的有效性的表型指示劑?？蛇x地，急性HBV感染的治療可以不需要長期治療，并且事實上，相對于整合的或穩(wěn)定保持的ddRNAi構(gòu)建體中的ddRNAi制劑的長期表達(dá)，它可能更依賴于ddRNAi制劑或siRNA制劑的瞬時存在?！凹毙浴钡囊馑际荋BV感染具有快速的發(fā)作和/或短的持續(xù)時間。根據(jù)本發(fā)明的這一實施方式，提供了一種治療個體中急性HBV感染的方法，包括對有治療需要的病患施用治療有效量的體外合成的或化學(xué)合成的ddRNAi制劑，用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）基因中的一種或多種靶序列的表達(dá)。所述ddRNAi制劑包括至少：長度為至少17個核苷酸、選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個連續(xù)核苷酸的第一效應(yīng)器序列；和第一效應(yīng)器互補序列；其中所述效應(yīng)器序列與所述靶基因的一個區(qū)域的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本基本互補。在該實施方式中，本發(fā)明的ddRNAi制劑在體外生產(chǎn)或化學(xué)合成，并被提供至所述細(xì)胞。在本說明書中描述的任何本發(fā)明的siRNA制劑或ddRNAi制劑適于體外表達(dá)并遞送至細(xì)胞。優(yōu)選地，所述HBV靶基因至少是聚合酶（P）基因，以及可能地當(dāng)所述靶序列包含在重疊開放閱讀框中時，所述靶基因是表面抗原、核心抗原或X基因。因此，在本發(fā)明的一種實施方式中，所述ddRNAi制劑抑制乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶基因中的一種或多種靶序列的表達(dá)。所述第一效應(yīng)器序列優(yōu)選地選自表1中列出的SEQIDNO:1～27的效應(yīng)器序列中的一條序列的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸?？蛇x地，所述效應(yīng)器序列與SEQIDNO:1～27可以有1、2、3、4或5個核苷酸變化，而不影響所述效應(yīng)器序列與靶序列堿基配對的能力以及抑制HBV聚合酶基因表達(dá)的能力。在另一種實施方式中，可以施用siRNA制劑。優(yōu)選地，與所述ddRNAi制劑相似，所述siRNA制劑靶定HBV聚合酶基因，且序列可以選自SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸，或可以與SEQIDNO:1～27有1、2、3、4或5個核苷酸變化，而不影響所述效應(yīng)器序列與靶序列堿基配對的能力以及抑制HBV聚合酶基因表達(dá)的能力。對含有急性HBV感染的個體施用本發(fā)明的ddRNAi制劑或siRNA制劑同樣可以降低病毒負(fù)荷，減少與急性感染相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性以及減少HBV的感染性。在本發(fā)明的另一種實施方式中，提供了本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體、ddRNAi制劑或siRNA制劑在制備用于治療HBV感染（優(yōu)選地慢性HBV感染）、減少HBV病毒負(fù)荷、減少與HBV感染相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性和減少HBV的感染性的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明另一方面，提供了用于治療HBV感染（優(yōu)選地慢性HBV感染）、減少HBV病毒負(fù)荷、減少與HBV感染相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性和減少HBV的感染性的ddRNAi構(gòu)建體、ddRNAi制劑或siRNA制劑。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含ddRNAi構(gòu)建體、ddRNAi制劑或siRNA制劑作為活性成分用于治療HBV感染（優(yōu)選地慢性HBV感染）、減少HBV病毒負(fù)荷、減少與HBV感染相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性和減少HBV的感染性的組合物。在本發(fā)明的方法中使用的ddRNAi構(gòu)建體、ddRNAi制劑或siRNA制劑的一種或多種效應(yīng)器序列包括能夠抑制所述HBV靶基因區(qū)域至少70%表達(dá)的序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，所述一種或多種效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。藥物組合物通過與合適的藥物學(xué)可接受的載體或稀釋劑組合，本發(fā)明的ddRNAi制劑、siRNA制劑或包含ddRNAi表達(dá)盒的載體可以被配制成藥物組合物。因此，提供了一種包含本發(fā)明的ddRNAi制劑、ddRNAi表達(dá)盒、ddRNAi構(gòu)建體或siRNA制劑和藥物學(xué)可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。在藥物劑量形式中，可以單獨或與其它藥物活性化合物聯(lián)合或一起施用所述制劑或包含ddRNAi表達(dá)盒的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地意識到制劑或包含所述ddRNAi表達(dá)盒的載體的劑量水平將作為所述遞送載體的性質(zhì)、所述靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)相對容易度、所述RNAi制劑在靶細(xì)胞中的表達(dá)水平等的函數(shù)而變化。本發(fā)明的ddRNAi制劑、siRNA制劑或包括ddRNAi表達(dá)盒的載體將被配制成制品，用于將它們?nèi)芙?、懸浮或乳化于水性或非水性溶劑中而注射或施用，所述溶劑包括油、合成的脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸或丙二醇的酯；以及如果期望，與常規(guī)添加劑如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑一起施用。本發(fā)明期望的藥物學(xué)可接受的載體或稀釋劑包括以使用的劑量和濃度對接受者無毒的任何稀釋劑、載體、賦形劑和穩(wěn)定劑，并包括如磷酸、檸檬酸和其它有機酸的緩沖液；包括抗壞血酸和甲硫氨酸的抗氧化劑；防腐劑（如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六烴季銨、苯扎氯銨、芐索氯銨，苯酚、丁醇或苯甲醇，對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯，鄰苯二酚，間苯二酚，環(huán)己醇，3-戊醇和m-甲酚）；低分子量（如小于大約10個殘基）多肽；蛋白，如血漿白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它的碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬復(fù)合物（例如，鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合物）；和/或非離子型表面活性劑如吐溫TM、PLURONICSTM或聚乙二醇（PEG）。所述藥物組合物可以被制備用于多種途徑和類型的施用。通常，通過均勻地和密切地將所述活性成分與液體載體或精細(xì)分離的固體載體或兩者聯(lián)系在一起而制備配方，并且如果需要，制備成形產(chǎn)品。可以在室溫、在合適的pH值下，以及在期望的純度下通過與生理學(xué)可接受的載體混合而操作所述配方，所述載體是在使用的劑量和濃度下對接受者無毒的載體。在本發(fā)明的組合物中使用的ddRNAi構(gòu)建體、ddRNAi制劑或siRNA制劑的一種或多種效應(yīng)器序列包括能夠抑制所述HBV靶基因區(qū)域至少70%表達(dá)的序列中的任何10個或更多個、優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，所述一種或多種效應(yīng)器序列選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:23。實施例以下實施例實際上是例舉說明，不作為任何形式的限定。實施例1：整個siRNA靶（EsT）庫的生產(chǎn)亞克隆來自HBVAdr-1（登錄號M38454）的全長依賴于HBVRNA的DNA聚合酶基因并用于生產(chǎn)整個siRNA靶（EsT）庫。測序5000個克隆，其中642個被鑒定為具有范圍在19-23bp的非重復(fù)序列。代表用于本發(fā)明的ddRNAi制劑的潛在靶的序列沿著所述靶基因分布（圖2）。實施例2：使用具有≥50%敲減的SEC的大規(guī)模篩選結(jié)果為鑒定之后在制備本發(fā)明的ddRNAi制劑中使用的最有效的siRNA序列，通過PCR擴增的siRNA表達(dá)盒（SEC）被轉(zhuǎn)染至HepG22.2.15細(xì)胞。評估對HBV聚合酶mRNA表達(dá)水平的作用以鑒定起作用的siRNA序列?；瘜W(xué)合成與第一次篩選的SEC相對應(yīng)40個siRNA并轉(zhuǎn)染至HepG22.2.15細(xì)胞中以確認(rèn)初始聚合酶mRNA敲減水平。HepG22.2.15是包含整合的成串的HBV基因組二聚體的穩(wěn)定細(xì)胞系（Genebank登錄號：U95551），并能夠穩(wěn)定表達(dá)HBV抗原和HBVDane顆粒。所述對應(yīng)結(jié)果在圖3中顯示。如能夠從圖3中看到的，當(dāng)聚合酶表達(dá)的SEC抑制>50%時，大多數(shù)對應(yīng)的合成的siRNA序列給出HBVmRNA的大約70%敲減，且僅2/23給出敲減水平低于50%。與具有<50%沉默功效的SEC相對照，僅18%（3/17）的相應(yīng)的合成siRNA產(chǎn)生>70%敲減（p<0.05-培生卡方檢驗，|tStat|=4.29>1.68）。此外，產(chǎn)生>90%敲減的合成siRNA（需要解釋這個）對應(yīng)于給出65%敲減的SEC克隆。從這里可以推斷出在通過來自SEC的siRNA的HBVmRNA的敲減和由合成的siRNA產(chǎn)生的HBVmRNA的敲減之間存在合理的相互關(guān)系，達(dá)到通過SEC的≥50%敲減的截斷值。所述截斷值用于SEC的篩選的剩余部分。實施例3：通過siRNA表達(dá)盒（SEC）的靶篩選圖4顯示了用于抑制HBVmRNA積累的體外大規(guī)模篩選的結(jié)果（501個非重復(fù)siRNA制劑）。在這些篩選的序列中，100個siRNA序列有效敲減HBVmRNA≥50%，其中14個導(dǎo)致>70%的敲減（表2）。在HBV聚合酶基因上的前100個siRNA靶的分布在圖5A中給出，任何序列能夠最終在聚合酶上繪制。例如圖5B繪制了第一批3個序列。表2：在轉(zhuǎn)染的HepG22.2.15細(xì)胞中相對于空載體對照測量相對的mRNA表達(dá)（通過一步定量RT-PCR方法使用SensiMixSYBR一步試劑盒（Bioline，美國），根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)），所述空載體對照的水平被任意地設(shè)定為1.0。用于HBV聚合酶基因的特定引物是：正向引物5’-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3’，反向引物5’-GCGTCAGCAAACACTTGG-3’，所述PCR產(chǎn)物的長度158bp。U6snRNA（正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)用作內(nèi)部對照，所述PCR產(chǎn)物的長度是94bp。使用2-ΔΔCt分析方法標(biāo)準(zhǔn)化聚合酶基因的相對表達(dá)水平。使用一式四份獨立轉(zhuǎn)導(dǎo)實施所述實驗。實施例4：使用合成的siRNA確認(rèn)活性第一輪篩選使用具有相對啟動子的載體（pU6H1-GFP）。在shRNA表達(dá)構(gòu)建體中，所述shRNA處于單一啟動子控制下。因此，為了在開發(fā)基于表2中所示的前14個siRNA序列的shRNA表達(dá)構(gòu)建體之前確認(rèn)前14個siRNA序列的功效，用每一siRNA轉(zhuǎn)染HepG22.2.15細(xì)胞，并評估HBV復(fù)制的抑制以測量HBV聚合酶mRNA水平?；瘜W(xué)合成所述14個siRNA并具有dTdT3’突出。5’-FAM標(biāo)記的siRNA-GL3（具有不相關(guān)siRNA序列的pGL3熒光素酶報道載體）用作負(fù)對照。將所述siRNA用DEPC處理的水溶解為100μM，等分并保存于-20℃。此外，長度為29bp的SEQIDNO:4被重新設(shè)計為8個siRNA（SEQIDNO:20～27），每一個長度是22bp，由SEQIDNO:4的重疊序列組成（下面表3）：表3：SEQIDNORNAi效應(yīng)器序列4UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGAGUUAUCTT20GGGAGAGGACAACAGAGUUAUCTT21CGGGAGAGGACAACAGAGUUAUTT22GCGGGAGAGGACAACAGAGUUATT23UGCGGGAGAGGACAACAGAGUUTT24UUGCGGGAGAGGACAACAGAGUTT25UUUGCGGGAGAGGACAACAGAGTT26AUUUGCGGGAGAGGACAACAGATT27UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGTT通過變化5’FAM-標(biāo)記的siRNA-GL3和Lipofectamine2000（Invitrogen）實施轉(zhuǎn)染優(yōu)化。所述細(xì)胞在37℃、5%CO2下保持在補充有10%PBS（Excellbio，中國）和200μg/mLG418（Sangon，中國）的DMEM（GIBCO，美國）中。使用優(yōu)化的方案用siRNA轉(zhuǎn)染HepG22.2.15細(xì)胞并在轉(zhuǎn)染后72小時收獲。使用Trizol（Invitrogen）分離總RNA，并如在實施例3中詳述的，使用SensiMixSYBR一步試劑盒（Bioline，美國），根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)，在一步定量RT-PCR方法中定量總RNA。結(jié)果所述結(jié)果被表示為平均值±STDV（表4和圖9）siNC=負(fù)對照；正常=未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在所檢測的22個siRNA中，全部展示出至少大約50%抑制，最多的展示出60～70%抑制。盡管在SEQIDNO:4的22bp變異體SEQIDNO:20～27之間的高度序列相似度，抑制它們序列的表達(dá)的能力在50至70%之間變化?；谶@些結(jié)果，SEQIDNO:3、9、12、13和23被選出用于進(jìn)一步開發(fā)。雖然所有的SEQIDNO都靶定所述聚合酶基因，同樣基于它們沿著所述聚合酶基因mRNA分布為基礎(chǔ)選擇這些序列（見表1中列“HBV靶位點”）。實施例5：shRNA設(shè)計和構(gòu)建步驟1-效應(yīng)器序列設(shè)計根據(jù)SEQIDNO:3、9、12、13和23設(shè)計shRNA表達(dá)構(gòu)建體。可以使用不同啟動子容易地合成構(gòu)建體，所述啟動子包括不同版本的具有不同內(nèi)在活性的人U6啟動子（Domitrovich,AMandKunkel,GR(2003)Multiple,dispersedhumanU6smallnuclearRNAgeneswithvariedtranscriptionalefficienciesNucleicAcidsResearch31:2344-2352）或多種polII啟動子。在設(shè)計這些構(gòu)建體時，考慮以下事項：·Dicer以shRNA為基礎(chǔ)開始加工?！icer的加工過程是不嚴(yán)密的，但是主要期望每22個核苷酸剪切?！6終止被期待在所述shRNA的3’末端添加UU?！に霰患庸さ男?yīng)器序列期望地包含5’U或A以促進(jìn)有效的Ago2載入?！に鲂?yīng)器序列被置于環(huán)的3’位置以避免對于最大限度的U6轉(zhuǎn)錄是優(yōu)選的5’G?！た梢酝ㄟ^在所述ddRNAi制劑所靶定的序列的上游或下游融合2或3個核苷酸的序列而將5’A或U殘基融合至shRNA效應(yīng)器序列中。這被定義為“滑動”序列1、2或3個核苷酸，即，用于shRNA的效應(yīng)器序列可以基于相對于所述siRNA效應(yīng)器序列的5’末端的5’端或3’端的1、2或3個核苷酸的序列。當(dāng)應(yīng)用于基于SEQIDNO:3、9、12、13和23這5個siRNA時：i）對于基于SEQIDNO:3:gccgggcaacgggguaaagguucTT的shRNA“最好的”shRNA效應(yīng)器序列（最小化5’GC序列，“向下”滑動3nt）GGGCAACGGGGUAAAGGUUCuu（uu來自polIII終止）ii）對于基于SEQIDNO:9:gggaaagcccuacgaaccacuTT的shRNA“最好的”shRNA效應(yīng)器序列（最小化5’G，向下滑動3nt至5’A，在3’添加GA（來自HBV基因組以最大化同源性）AAAGCCCUACGAACCACUGAuuiii）對于基于SEQIDNO:12:gcccacucccauaggaauuuuccTT的shRNA“最好的”shRNA效應(yīng)器序列在反義鏈上提升2nt以避免UUUU（將引起過早的終止），添加來自HBV序列的AG，這將偶然地?fù)饺?’A。AGGCCCACUCCCAUAGGAAUUiv)對于基于SEQIDNO:13:ggaucuugcagaguuuggTT的shRNA“最好的”shRNA效應(yīng)器序列（將長度增加至20nt，向上滑動2nt，添加來自HBV序列的TG，這將導(dǎo)致5’T（即，U））TGGGAUCUUGCAGAGUUUGGuuv)對于基于SEQIDNO:23:ugcgggagaggacaacagaguuTT的shRNA“最好的”shRNA效應(yīng)器序列在3’末端減少2ntUGCGGGAGAGGACAACAGAGUU步驟2-表達(dá)盒制備基于在步驟（a）中設(shè)計的效應(yīng)器序列的U6shRNA盒（Genscript）并克隆至pUC57中。所述表達(dá)盒的插入物，包括用于后續(xù)操作的一些側(cè)翼限制性位點，具有以下序列：U6.HBVshRNA3GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAAGAGACCGGGCAACGGGGTAAAGGTTCTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQIDNO:28)；U6.HBVshRNA9GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCAAGAGAGGAAAGCCCTACGAACCACTGATTTTTTGTTAACGAATTC(SEQIDNO:29)；U6.HBVshRNA12GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCACAAGAGATGAGGCCCACTCCCATAGGAATTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQIDNO:30)；U6.HBVshRNA13GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCAAACTCTGCAAGATCCCAGACAAGAGATCTGGGATCTTGCAGAGTTTGGTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQIDNO:31)；U6.HBVshRNA23GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTCTGTTGTCCTCTCCCGCAAACAAGAGATTTGCGGGAGAGGACAACAGAGTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQIDNO:32)。這些表達(dá)盒的每一個所對應(yīng)的表達(dá)的shRNA在圖6中示出（如SEQIDNO:36至40）。符號“∧”和“∨”表示shRNA的潛在加工位點，這些位點起因于轉(zhuǎn)錄起始/終止或具有22nt相位和2nt3’突出的Dicer加工過程，假定這樣加工過程的預(yù)測效應(yīng)器序列在下面示出。實施例6：使用多序列構(gòu)建體表達(dá)細(xì)胞的穩(wěn)定shRNA的產(chǎn)生如上面所詳述的，一種設(shè)計本發(fā)明的ddRNAi表達(dá)盒的有用途徑是假定Dicer在每22個核苷酸處剪切（也被指定為22nt相位）。因此，編碼效應(yīng)器序列的DNA序列可以被設(shè)計為編碼SEQIDNO:1～27中的一條序列中的任何10個或更多個以及優(yōu)選地任何17個或更多個連續(xù)核苷酸，以及合適的間隔子和用于所述啟動子和/或終止子的其它序列要求。將使用以下結(jié)構(gòu)產(chǎn)生ddRNAi構(gòu)建體（使用非限制的例示序列）：i）單發(fā)夾表達(dá)盒如上所提及的，圖6圖示了基于SEQIDNO:3（圖6A）、SEQIDNO:9（圖6B）和SEQIDNO:12（圖6C）、SEQIDNO:13（圖6D）和SEQIDNO:23（圖6E）的所述表達(dá)盒、表達(dá)的發(fā)夾RNAi制劑和由Dicer（假定22個核苷酸相位）所加工的理論效應(yīng)器序列。在圖6A和6B的盒中，分別編碼SEQIDNO:3和9的20個連續(xù)核苷酸；在圖6C至6E的盒中，分別編碼SEQIDNO:12、13和23的21個連續(xù)核苷酸。發(fā)夾RNAi制劑上的箭頭表示期望Dicer剪切的位置以產(chǎn)生下面所示的效應(yīng)器序列。圖6A至6E的表達(dá)盒的序列已經(jīng)在上面提供（SEQIDNO:28至32）。ii）多發(fā)夾表達(dá)盒圖7例示了基于SEQIDNO:1、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的所述表達(dá)盒、表達(dá)的發(fā)夾RNAi制劑（SEQIDNO:41至43）以及由Dicer（假定22個核苷酸相位）加工的理論效應(yīng)器序列，此時SEQIDNO:1、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6被設(shè)置在所述盒中以在加工之前引起單獨發(fā)夾RNAi制劑的表達(dá)（圖7A）或包含3個發(fā)夾RNAi制劑的單一RNA的表達(dá)（圖7B）。SEQIDNO:1、4和6在涉及單一發(fā)夾表達(dá)盒方面與上面所述的相同。發(fā)夾RNAi制劑上的符號“∧”和“∨”表示期望Dicer剪切的位置以產(chǎn)生下面所示的效應(yīng)器序列。圖7A的表達(dá)盒具有DNA序列：TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCTCCCTTATCGTCAATCTTCAAGAGAAAGATTGACGATAAGGGAGATTTTTTTTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGATAACTCTGTTGTCCTCTTTCAAGAGAAGAGGACAACAGAGTTATCTTTTTTTTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCCCACCGCACGGAGGCCTTTTCAAGAGAAAGGCCTCCGTGCGGTGGGGTTTTTTT(SEQIDNO:33)。在圖7A的盒中，每一效應(yīng)器互補序列可操作地與啟動子序列連接，而對應(yīng)的效應(yīng)器序列可操作地與終止元件或序列連接。相反，在圖7B的表達(dá)盒中，所述第一效應(yīng)器互補序列（效應(yīng)器1互補序列）可操作地與啟動子連接，而最后效應(yīng)器（效應(yīng)器6）可操作地與終止元件或序列連接，箭頭表示Dicer加工的預(yù)期位點。設(shè)計該盒以表達(dá)單一RNA分子（SEQIDNO:44），且具有DNA序列：TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGCTGTTGACAGTGAGCGTCTCCCTTATCGTCAATCTTCAAGAGAAAGATTGACGATAAGGGAGATGCCTACTGCCTCGGATTCTGCTGTTGACAGTGAGCGGTTGTCCTCTCCCGCAAATACAAGAGATATTTGCGGGAGAGGACAACTGCCTACTGCCTCGGATTCTGCTGTTGACAGTGAGCGCCCCACCGCACGGAGGCCTTCAAGAGAAAGGCCTCCGTGCGGTGGGGTGCTGTTGACAGTGAGCGTTTTTTT(SEQIDNO:34)。iii）長發(fā)夾表達(dá)盒圖8例示了基于（按順序）SEQIDNO:1、SEQIDNO:6和SEQIDNO:4的表達(dá)盒、表達(dá)的發(fā)夾RNAi制劑（SEQIDNO:45）和由Dicer（假定22個核苷酸相位）加工的理論效應(yīng)器序列。在圖8的盒中，根據(jù)上面的實施例，編碼SEQIDNO:1的17個連續(xù)核苷酸和SEQIDNO:6的20個連續(xù)核苷酸，但是與圖7和8的盒相反，僅編碼SEQIDNO:4的18個連續(xù)核苷酸。在發(fā)夾RNAi制劑上的箭頭表示期望Dicer剪切的位置以產(chǎn)生下面所示的效應(yīng)器序列。圖8的表達(dá)盒具有DNA序列：TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTCCCTTATCGTCAATCTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTCTGATGTCCTCTCCCGCAAATACAAGAGATATTTGCGGGAGAGGACAACAGAAGGCCTCCGTGCGGTGGGGTGAAAGATTGACGATAAGGGAGATTTTTTT(SEQIDNO:35)。實施例7：體外測定ddRNAi制劑的功效為檢測ddRNA制劑的功效，可以用本發(fā)明的RNA制劑轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞和細(xì)胞系并測定HBV復(fù)制的抑制。為測定本發(fā)明的ddRNAi構(gòu)建體的功效，構(gòu)建基于pGL3熒光素酶報道載體的質(zhì)粒DNA。首先，“pGL3多”包含在螢火蟲熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3的3’未翻譯區(qū)（UTR）的單一拷貝的序列，編碼用于分別基于SEQIDNO:3、9、12、13和23的siRNA或shRNA3、9、12、13和23的靶位點。第二，“pGL3-23”包含三次重復(fù)的基于SEQIDNO:23的shRNA23。在這些質(zhì)粒上的HBV靶位點對應(yīng)于由具體的siRNA或shRNA識別的HBV的正義序列，并包含所述靶位點的上游和下游的額外的10nt的HBV序列。以下信息涉及使用pGL3-23構(gòu)建體進(jìn)行的實驗。出于方便原因，我們選擇采用初始檢測，所述檢測使用在HEK293細(xì)胞中的瞬時實驗的雙熒光素酶實驗。將細(xì)胞培植在96孔板中（0.1mL培養(yǎng)基/孔）以在轉(zhuǎn)染前達(dá)到大約50%的融合。使用生產(chǎn)商（Invitrogen）的方案用LipofectamineTM2000將質(zhì)粒DNA和化學(xué)合成的siRNA（或shRNA載體）共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。測試構(gòu)建體與表達(dá)海腎（Renilla）熒光素酶（pRL-TK，Promega）（作為轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)在對照）的構(gòu)建體一起使用。如果化學(xué)合成的siRNA或表達(dá)自載體的shRNA在沉默靶序列中有效，由于所述靶序列可操作地與熒光素酶基因連接，所以轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的熒光素酶水平將降低。因此，多種劑量的化學(xué)合成的siRNA或shRNA表達(dá)載體與恒定量的pGL3-23和對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染（見下表）。表5：檢測抗pGL3-23的siRNA23用指定量的pGL3-23和對照（pRL-TK）質(zhì)粒以及變化量的基于SEQIDNO:23的siRNA（HBV-siRNA23）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。siNC，一種在HBV中沒有已知的靶序列的不相關(guān)的siRNA用作負(fù)對照和用于調(diào)整添加至細(xì)胞的siRNA的總量，以避免由于不平等轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的潛在的人工結(jié)果。siRNAGL3用作正對照，使得siRNA被靶定至所述熒光素酶基因。表6：檢測抗pGL3-23的shRNA23用指定量的pGL3-23和對照質(zhì)粒（pRL-TK）以及變化量的用于表達(dá)基于SEQIDNO:23的shRNA的檢測質(zhì)粒（HBVshRNA23）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。pUC57用作負(fù)對照并用于調(diào)整添加至細(xì)胞的質(zhì)粒DNA的總量，以避免由于不平均轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的人工結(jié)果。表達(dá)基于GL3siRNA的熒光素酶shRNA的質(zhì)粒用作正對照。將用于檢測的樣品轉(zhuǎn)染至4個單獨孔中，并使用雙熒光素酶檢驗系統(tǒng)（Promega）和SynergyTM2Luminescence讀微板器（Biotek），分別根據(jù)生產(chǎn)商的方案，在轉(zhuǎn)染后48小時測量螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。測量每一孔的螢火蟲/海腎活性比例，通過標(biāo)準(zhǔn)化至各自對照計算siRNA或shRNA的抑制功效。結(jié)果圖10A和B中的圖顯示了使用表5和6中列出的條件轉(zhuǎn)染有不同量的靶定pGL3-23的化學(xué)合成的siRNA23（A）或shRNA23表達(dá)構(gòu)建體（B）的細(xì)胞中的熒光素酶活性（+/-SD；n=4）。即使在最低的濃度下，基于SEQIDNO：23的siRNA和shRNA相對于負(fù)對照（siNC或shNC-任意地設(shè)置為1）是下調(diào)的。所述正對照熒光素酶siRNA和shRNA同樣下調(diào)來自pGL3-23的熒光素酶表達(dá)水平。實施例8：體內(nèi)檢測ddRNAi制劑的功效可以使用HBV的小鼠模型，如HBV感染的NOD/SCID小鼠（Yang等，2002；Ketzinel-Gilad等，2006），以及表達(dá)HBV的轉(zhuǎn)基因小鼠系，任一一種或兩種都可以用于這些實驗。把ddRNAi制劑注射至小鼠的尾部靜脈將用于遞送所述制劑至肝臟?？梢栽诓煌瑫r間點使用qRT-PCR檢驗監(jiān)測HBV復(fù)制的抑制以測量肝臟組織中HBVpolmRNA的水平，或者通過定量用本發(fā)明的ddRNAi制劑處理的動物和合適的對照動物中循環(huán)的HBsAg和HBeAg的水平的比較來監(jiān)測HBV復(fù)制的抑制，所述合適的對照動物如注射有如上所述的亂序的（scrambled）序列或無相關(guān)的DNA。用于穩(wěn)定表達(dá)ddRNAi制劑的合適表達(dá)構(gòu)建體包括慢病毒載體。實施例9：在正常小鼠模型中體內(nèi)檢測臨床前候選物在正常小鼠模型中體內(nèi)檢測臨床前候選物的一種可用遞送系統(tǒng)是AAV。對于AAV，使用本領(lǐng)域公知的策略將ddRNAi構(gòu)建體在體外包裝并將其靜脈注射至HBV感染的NOD/SCID小鼠和/或HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。將如上所述監(jiān)測HBV復(fù)制的抑制。應(yīng)當(dāng)理解，在本說明書中公開和定義的本發(fā)明延伸至在本文或附圖中提及或顯現(xiàn)的兩種或多種個別性質(zhì)的所有可交替的組合。所有這些不同的組合構(gòu)成了本發(fā)明的多種可選擇的方面。