專利名稱：PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種對PSD-95/nNOS解偶聯劑有特異性識別作用 的分子印跡聚合物。 利用該分子印跡聚合物，可以識別具有PSD-95/nNOS解偶聯作用的化合物。
背景技術：
腦缺血后N-甲基-D-天門冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic acid, NMDA)受體過 度激活，通過神經元型一氧化氮合成酶(Neuronal Nitric Oxide Synthase，nNOS)合成 的一氧化氮的病理性釋放是腦缺血損傷后的神經元損傷的主要因素之一。突觸后密度蛋 白-95 (Postsynaptic Density Protein-95, PSD-95)在此通路中扮演了重要角色。在腦 缺血情況下，NMDA受體過度激活，形成NMDA/PSD-95/nNOS復合物，病理性釋放N0，與超氧 負離子(02_)反應產生毒性更強的過氧亞硝酸鹽陰離子(0N00_)，導致神經元的損傷。由于 NMDA受體、PSD-95、nNOS具有多種重要的生理作用，抑制其功能可能導致嚴重的毒副作用。 PSD-95/nNOS的解偶聯，可以在不影響NMDA受體、PSD-95、nNOS功能的前提下抑制NO的病 理性釋放。文獻報道4-N-(2-羥基-3，5-二氯芐基)氨基水楊酸(化合物1)，6-Ν-(2-羥 基-3，5-二氯芐基)氨基苯并三氮唑(化合物2)，具有明確的PSD-95/nNOS解偶聯作用 (中國專利 200910025698. 1 ;British Journal ofPharmacology 2009，158，494-506)。黃 芩苷能夠與PSD-95結合，可能具有PSD-95/nNOS解偶聯作用(Phytomedicine 2004，11 277-284)。化合物1、化合物2、黃芩苷元的化學結構<formula>formula see original document page 3</formula>
化合物1化合物2黃芩苷元PSD-95/nNOS解偶聯劑的活性評價可以采用核磁共振的方法，該方法需要分別獲 得PSD-95以及nNOS，通過測定其給藥前后核磁共振N-H相關譜的變化，判斷目標化合物與 PSD-95的結合情況；或者采用采用免疫共沉淀法，考察小鼠MCAO條件下，給藥組與空白組 nNOS與PSD95結合強度增強程度的差異。兩種方法均費時費力，難以快速簡便的分子印記 聚合物具有強特異性和高選擇性，可以作為人工抗體，高通量快速篩選目標化合物。天然產 物中，許多有效成分往往因為含量低微而被漏篩或者難以純化，利用分子印記聚合物可以 將一些含量很低的化合物直接從粗提物中提取出來。
發(fā)明內容
發(fā)明目的為了克服現有技術的不足，本發(fā)明提供一種可用于識別PSD-95/nNOS 解偶聯功能的化合物分子印跡聚合物及其制備方法。該分子印跡聚合物能夠識別具有PSD-95/nNOS解偶聯作用的化合物，可用于高通量快速篩選PSD-95/nNOS解偶聯目標化合 物，也能夠識別具有PSD-95/nNOS解偶聯作用的天然產物。技術方案一種PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物制備方法，其制備步驟為 將模板分子和功能單體按1 1-1 8的摩爾比溶解到含有交聯劑、引發(fā)劑的乙腈溶液 中，制備成混合液，交聯劑在乙腈中的濃度為20mmOl/L-80mmOl/L，引發(fā)劑在乙腈中的濃度 0. lg/L-lg/L ；將混合液密封后，采用加熱攪拌的方式聚合反應生成粉末狀聚合物，聚合反 應溫度為50-70°C，反應時間為12-24h ；將粉末狀聚合物加入甲醇和三乙胺的混合溶液中 進行超聲處理，去除模板分子，離心后將粉末狀聚合物加入甲醇中超聲處理，去除三乙胺； 將上述處理得到的聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到分子印跡聚合物。所述模板分子和功能單體的摩爾比優(yōu)選為1 4。所述交聯劑在乙腈中的濃度優(yōu)選為80mmol/L。所述引發(fā)劑在乙腈中的濃度優(yōu)選為0. 8g/L。所述模板分子為6-N- (2-羥基-3，5- 二氯芐基)氨基苯并三氮唑或者4_N_ (2_羥 基-3，5- 二氯芐基)氨基水楊酸。所述功能單體為4-乙烯吡啶、2-乙烯吡啶或丙烯酰胺中的一種或任意幾種混合 物。所述交聯劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。所述弓丨發(fā)劑為偶氮二異丁腈。有益效果本發(fā)明的有益效果在于，制得分子印跡聚合物不僅對模板分子有特異 性的吸附能力，而且對其他PSD-95/nNOS解偶聯劑同樣存在特異性的吸附，能夠識別具有 SD-95/nNOS解偶聯作用的天然產物。
四
圖1是PSD-95/nNOS解偶聯分子印跡聚合物對化合物1、化合物2、黃芩苷元的吸 附曲線，由圖可以看出，所得的PSD-95/nNOS解偶聯分子印跡聚合物對化合物1、化合物2、 黃芩苷元均有良好的吸附效果，對于高通量快速篩選PSD-95/nNOS解偶聯目標化合物，發(fā) 現具有PSD-95/nNOS解偶聯作用的天然產物具有一定的應用前景。
五具體實施例方式下面的實施例可使本專業(yè)技術人員全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā) 明。實施例1 將Immol的6_N_ (2-羥基-3，5_ 二氯芐基)氨基苯并三氮唑和6mmol的功能單體 丙烯酰胺溶解到IOOmL含有Smmol三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、80mg的引發(fā)劑偶氮二異 丁腈的純乙腈溶液中，制備成混合液。將混合液密封后超聲脫氣5min，通氮氣IOmin除去氧 分子，然后將混合液密封后，采用加熱攪拌的方式聚合反應生成粉末狀聚合物，聚合溫度為 55-70°C，反應時間為16h。聚合完成后，用IOOmL的甲醇和三乙胺的混合溶液，對合成好的 聚合物進行超聲處理，去除模板分子，離心后將粉末狀聚合物加入甲醇中超聲處理，去除三 乙胺；將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到分子印跡聚合物。
實施例2:將lmmol的4_N_(2_羥基-3，5_ 二氯芐基)氨基水楊酸和8mmol的功能單體丙 烯酰胺溶解到IOOmL含有Smmol三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、80mg的引發(fā)劑偶氮二異丁 腈的純乙腈溶液中，制備成混合液。將混合液密封后超聲脫氣5min，通氮氣IOmin除去氧 分子，然后將混合液密封后，采用加熱攪拌的方式聚合反應生成粉末狀聚合物，聚合溫度為 50-650C，反應時間為24h。聚合完成后，用IOOmL的甲醇和三乙胺的混合溶液，對合成好的 聚合物進行超聲處理，去除模板分子，離心后將粉末狀聚合物加入甲醇中超聲處理，去除三 乙胺。將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到PSD-95/nNOS解偶聯分子印跡聚合物。實施例3 將Immol的4_N_ (2_羥基_3，5_ 二氯芐基)氨基水楊酸和4mmol的功能單體2-乙 烯吡啶溶解到IOOmL含有Smmol三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、80mg的引發(fā)劑偶氮二異丁 腈的純乙腈溶液中，制備成混合液。將混合液密封后超聲脫氣5min，通氮氣IOmin除去氧 分子，然后將混合液密封后，采用加熱攪拌的方式聚合反應生成粉末狀聚合物，聚合溫度為 55-650C，反應時間為24h。聚合完成后，用IOOmL的甲醇和三乙胺的混合溶液，對合成好的 聚合物進行超聲處理，去除模板分子，離心后將粉末狀聚合物加入甲醇中超聲處理，去除三 乙胺。將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到PSD-95/nNOS解偶聯分子印跡聚合物。實施例4 將Immol的4_N_ (2-羥基-3，5_ 二氯芐基)氨基水楊酸和Immol的功能單體4_乙 烯吡啶、4mmol的功能單體丙烯酰胺溶解到IOOmL含有5mmol三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸 酯、80mg的引發(fā)劑偶氮二異丁腈的純乙腈溶液中，制備成混合液。將混合液密封后超聲脫 氣5min，通氮氣IOmin除去氧分子，然后將混合液密封后，采用加熱攪拌的方式聚合反應生 成粉末狀聚合物，聚合溫度為55-65°C，反應時間為24h。聚合完成后，用IOOmL的甲醇和三 乙胺的混合溶液，對合成好的聚合物進行超聲處理，去除模板分子，離心后將粉末狀聚合物 加入甲醇中超聲處理，去除三乙胺。將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到PSD-95/ nNOS解偶聯分子印跡聚合物。實施例5 將Immol的4_N_ (2-羥基-3，5_ 二氯芐基)氨基水楊酸和4mmol的功能單體4-乙 烯吡啶溶解到IOOmL含有Smmol三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、80mg的引發(fā)劑偶氮二異丁 腈的純乙腈溶液中，制備成混合液。將混合液密封后超聲脫氣5min，通氮氣IOmin除去氧 分子，然后將混合液密封后，采用加熱攪拌的方式聚合反應生成粉末狀聚合物，聚合溫度為 55-65°C，反應時間為16h。聚合完成后，用IOOmL的甲醇和三乙胺的混合溶液，對合成好的 聚合物進行超聲處理，去除模板分子，離心后將粉末狀聚合物加入甲醇中超聲處理，去除三 乙胺。將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到PSD-95/nNOS解偶聯分子印跡聚合物。實施例6 將4mmol的功能單體4_乙烯吡啶溶解到IOOmL含有8mmol三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、80mg的引發(fā)劑偶氮二異丁腈的純乙腈溶液中，制備成混合液。將混合液密封后超 聲脫氣5min，通氮氣IOmin除去氧分子，然后將混合液密封后，采用加熱攪拌的方式聚合反 應生成粉末狀聚合物，聚合溫度為55-65°C，反應時間為16h。聚合完成后，用IOOmL的甲醇 和三乙胺的混合溶液，對合成好的聚合物進行超聲處理，去除模板分子，離心后將粉末狀聚合物加入甲醇中超聲處理，去除三乙胺。將聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到空白的分子印跡聚合物。實施例7:50mg實施例5的分子印跡聚合物(MIP)、50mg實施例6的聚合物(NIP)，分別加 入到不同濃度的目標分子(化合物1，化合物2，黃芩苷元)的IOmL乙腈溶液，于室溫下振 搖24小時，采用高效液相法(化合物1、化合物2檢測波長為284nm，黃芩苷元檢測波長為 276nm，流動相為體積比為70 30的甲醇水溶液，流速lmL/min)，測定其吸附容量，以溶液 濃度為橫坐標，吸附容量為縱坐標，做吸附曲線。吸附容量(ymol/g)= (C0-C1) X 200其中=Ctl為吸附前溶液濃度(mmol/L)，C1為吸附后溶液濃度(mmol/L)從圖1可見，所得的PSD-95/nNOS解偶聯分子印跡聚合物對化合物1、化合物2、黃 芩苷元均有良好的吸附效果，對于開發(fā)具有PSD-95/nNOS解偶聯作用的天然產物具有一定 的應用前景。
權利要求
一種PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物制備方法，其特征為a.將模板分子和功能單體按1∶1-1∶8的摩爾比溶解到含有交聯劑、引發(fā)劑的乙腈溶液中，制備成混合液，交聯劑在乙腈中的濃度為20mmol/L-80mmol/L，引發(fā)劑在乙腈中的濃度0.1g/L-1g/L；b.將混合液密封后，采用加熱攪拌的方式聚合反應生成粉末狀聚合物，聚合反應溫度為50-70℃，反應時間為12-24h；c.將粉末狀聚合物加入甲醇和三乙胺的混合溶液中進行超聲處理，去除模板分子，離心后將粉末狀聚合物加入甲醇中超聲處理，去除三乙胺；d.將上述處理得到的聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到分子印跡聚合物。
2.根據權利要求1所述PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物的制備方法，其特征在 于模板分子和功能單體的摩爾比為1 4。
3.根據權利要求1所述PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物的制備方法，其特征在 于交聯劑在乙腈中的濃度為80mmol/L。
4.根據權利要求1所述PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物的制備方法，其特征在 于引發(fā)劑在乙腈中的濃度為0. 8g/L。
5.根據權利要求1所述PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物的制備方法，其特征在 于模板分子為6-N- (2-羥基-3，5- 二氯芐基)氨基苯并三氮唑或者4-N- (2-羥基-3，5- 二 氯芐基)氨基水楊酸。
6.根據權利要求1所述PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物的制備方法，其特征在 于功能單體為4-乙烯吡啶、2-乙烯吡啶或丙烯酰胺中的一種或任意幾種混合物。
7.根據權利要求1所述PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物的制備方法，其特征在 于交聯劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
8.根據權利要求1所述PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物的制備方法，其特征在 于引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。
全文摘要
一種PSD-95/nNOS解偶聯劑分子印跡聚合物制備方法，其制備步驟為將模板分子和功能單體按1∶1-1∶8的摩爾比溶解到含有交聯劑、引發(fā)劑的乙腈溶液中，制備成混合液，交聯劑在乙腈中的濃度為20mmol/L-80mmol/L，引發(fā)劑在乙腈中的濃度0.1g/L-1g/L；將混合液密封后，采用加熱攪拌的方式聚合反應生成粉末狀聚合物，聚合反應溫度為50-70℃，反應時間為12-24h；將粉末狀聚合物加入甲醇和三乙胺的混合溶液中進行超聲處理，去除模板分子，離心后將粉末狀聚合物加入甲醇中超聲處理，去除三乙胺；將上述處理得到的聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到分子印跡聚合物。制得的分子印跡聚合物能夠識別具有SD-95/nNOS解偶聯作用的天然產物。
文檔編號C08F220/56GK101817908SQ20101902609
公開日2010年9月1日 申請日期2010年2月4日 優(yōu)先權日2010年2月4日
發(fā)明者周學敏, 孫旭, 李飛, 殷曉佳, 江珂, 胡琴, 許貫虹, 都述虎 申請人:南京醫(yī)科大學