專利名稱：：紫杉醇類似物的制備和作為抗腫瘤劑的應(yīng)用的制作方法紫杉醇(Paclitaxel)是著名的抗腫瘤劑，并且已被美國食品醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)用于治療乳腺癌和卵巢癌。這種藥物目前還正進行用于治療其它類型癌癥的臨床試驗。但是，世界范圍內(nèi)紫杉醇的供應(yīng)只限于為數(shù)不多的紫杉樹和紫杉醇含量相對較少的其它紫杉物種，對于用于人和動物的抗腫瘤治療和為研制具有類紫杉醇抗腫瘤作用的抗腫瘤藥而進行的常規(guī)生物活性試驗來講，紫杉醇嚴(yán)重短缺。因此，極其需要紫杉醇的替代來源以及具有類紫杉醇抗腫瘤作用的替代化合物。紫杉醇常常與其結(jié)構(gòu)類似的著名的紫杉烷——三尖杉寧堿(Cephalomannine)一起存在。三尖杉寧堿和紫杉醇的結(jié)構(gòu)示于下面式(1)中。紫杉醇三尖杉寧堿紫杉醇和三尖杉寧堿是在短葉紫杉樹和其它紫杉物種(包括歐洲紫杉、東北紫杉、云南紫杉、紫杉、Taxuscapitata，Taxusbrownii和Taxusdarkgreenspreader)的樹皮中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物。在粗榧物種例如西雙版納粗榧以及培養(yǎng)的植物細(xì)胞和真菌中也發(fā)現(xiàn)有這些化合物。據(jù)報道三尖杉寧堿在緩解白血病腫瘤方面有效。見美國專利4,206,221。根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在出乎意料地發(fā)現(xiàn)某些新的紫杉醇類似物，尤其是2″，3″側(cè)鏈鹵化的三尖杉寧堿，在許多腫瘤中顯示出很強的體外和體內(nèi)類紫杉醇功效，從而為紫杉醇和紫杉醇衍生物(如Taxotere)提供了一種適用的替代物。三尖杉寧堿和紫杉醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)中都含有11個不對稱碳原子，其中9個是在紫杉烷環(huán)上，2個是在碳13位的側(cè)鏈上。三尖杉寧堿和紫杉醇的立體結(jié)構(gòu)示于下面式(II)中紫杉烷的立體結(jié)構(gòu)圖1.紫杉醇2.三尖杉寧堿；三尖杉寧堿中的環(huán)外2″，3″側(cè)鏈雙鍵以及此化合物結(jié)構(gòu)中存在的立體中心數(shù)目，提供了這種紫杉烷存在許多立體異構(gòu)體的可能性。例如，三尖杉寧堿可以分布在兩種異構(gòu)形式中，其中碳13位的羥基被苯基異絲氨酸?；?，而苯基異絲氨酸在氨基處被(Z)-或(E)-2-甲基-2-丁烯酸酰化分別導(dǎo)致(Z)-和(E)-三尖杉寧堿的形成。此外，已知三尖杉寧堿和紫杉醇由于在層析過程中受熱或是由于在酸性或堿性溶液中，可以在碳7位發(fā)生差向異構(gòu)，形成示于下面式(III)中的7-表-三尖杉寧堿。Miller等，有機化學(xué)雜志(J.Org.Chem)，401469(1981)；Chaudhary等，有機化學(xué)雜志(J.Org.Chem)，5883978(1993)；和Wender等，CRC出版社，BocaRaton，F(xiàn)la.，(1995)。因此，在鹵化時2″，3″側(cè)鏈位可以形成非對映異構(gòu)產(chǎn)物的混合物。因此，除了上面所述的以外，本發(fā)明提供了2″，3″-二鹵三尖杉寧堿和2″，3″-二鹵-7-表-三尖杉寧堿的分離和純化的非對映異構(gòu)體，它們顯示出強的抗腫瘤效力。7-表-三尖杉寧堿發(fā)明詳述及優(yōu)選實施方案本發(fā)明提供了紫杉醇的新類似物，特別是分離并純化的2″，3″-二鹵三尖杉寧堿和2″，3″-二鹵-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體，它們在許多腫瘤細(xì)胞系中顯示出強的體外和體內(nèi)類紫杉醇抗腫瘤活性。本發(fā)明還提供了制備這些化合物的方法及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，二鹵三尖杉寧堿類似物的非對映異構(gòu)體混合物是以良好的產(chǎn)率由相對較純的三尖杉寧堿來源制得或是由含有三尖杉寧堿、紫杉醇及其它紫杉烷化合物的未純化的復(fù)雜混合物制得。這種類似物的制備方法是將三尖杉寧堿分子的不飽和側(cè)鏈選擇性鹵化，同時留下分子的其它部分或混合物中其它重要的紫杉烷化合物(如紫杉醇)不受觸動。由混合物中分離和純化單體的2″，3″-二鹵三尖杉寧堿/二鹵-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體是用常規(guī)方法完成的，這些化合物也顯示出強的抗腫瘤效力。進行選擇性鹵化的方法是，使三尖杉寧堿和/或7-表三尖杉寧堿在一定的條件下反應(yīng)，這包括能有效地使這些化合物的2″，3″側(cè)鏈部分選擇性鹵化溫度和時間，然后將所形成的極性較小的二鹵三尖杉寧堿/二鹵-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體混合物與紫杉醇和其它紫杉烷化合物分離。單體的非對映異構(gòu)體可以用標(biāo)準(zhǔn)的層析方法和/或重結(jié)晶法從混合物中分離出來。本發(fā)明的合成方法很有利地與紫杉烷化合物的各種復(fù)雜的或較純的混合物中存在的三尖杉寧堿及7-表-三尖杉寧堿的濃度無關(guān)，因此可使用含三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿的任何來源作為起始物。這些來源的典型例子包括各種紫杉物種的樹皮，例如短葉紫杉、歐洲紫杉、云南紫杉、紫杉和喜馬拉雅紫杉；粗榧物種，例如西雙版納粗榧；植物材料；各種紫杉和粗榧物種的葉、針葉和椏枝；含有紫杉烷類化合物的復(fù)雜混合物的生物體提取物；以及由諸如紫杉和粗榧物種的細(xì)胞培養(yǎng)物和產(chǎn)生三尖杉寧堿的真菌等來源生產(chǎn)三尖杉寧堿及7-表-三尖杉寧堿的下游純化液中。在本發(fā)明的一項實施例中，將除紫杉醇外還含有三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿的紫杉烷混合物用溶在惰性溶劑(優(yōu)選鹵化的溶劑，如四氯化碳、氯仿、二氯甲烷或二氯乙烯)中的化學(xué)計量數(shù)量的鹵素(如溴或氯)處理。例如，在一種典型的處理方法中，用鹵素在四氯化碳中處理含大約30％重量三尖杉寧堿的混合物，結(jié)果以定量產(chǎn)率形成了2″，3″-二鹵三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體和相應(yīng)的2″，3″-二鹵-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體的混合物。通用的反應(yīng)方案(IV)如下其中，I.(2″R，3″S)-二鹵三尖杉寧堿R1＝OHR2＝HII.(2″S，3″R)-二鹵三尖杉寧堿R1＝OHR2＝HIII.(2″R，3″S)-二鹵-7-表-三尖杉寧堿R1＝HR2＝OHIV.(2″S，3″R)-二鹵-7-表-三尖杉寧堿R1＝HR2＝OHX＝鹵素所形成的純的二鹵非對映異構(gòu)體I-IV可以分離，其化學(xué)結(jié)構(gòu)用常規(guī)的分析和物理化學(xué)方法闡明。另外，根據(jù)本發(fā)明，對于含三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿以及約0.01-99.05％重量紫杉醇的混合物的鹵化，所用的方法與上述相似。先將混合物溶在惰性溶劑中，優(yōu)選四氯化碳、氯仿、1，2-二氯乙烷或二氯甲烷，隨后與鹵素反應(yīng)，例如與溴或氯在惰性的氯化溶劑中的溶液反應(yīng)，攪拌反應(yīng)混合物直到三尖杉寧堿反應(yīng)完全。反應(yīng)優(yōu)選在-20℃至20℃的溫度下進行，更優(yōu)選的反應(yīng)溫度是-5至5℃，最好是在暗處進行。優(yōu)選的鹵素溶液是溴或氯在四氯化碳中的0.01-0.1M溶液。為保證反應(yīng)條件有利于形成所要的2″，3″-二鹵三尖杉寧堿和/或2″，3″-二鹵-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)反應(yīng)產(chǎn)物，可以方便地用常規(guī)的分析技術(shù)(如HPLC)監(jiān)測反應(yīng)的進程并保持合適的反應(yīng)條件。含有紫杉烷雜質(zhì)的反應(yīng)混合物隨后可以用常規(guī)方法，例如層析和重結(jié)晶，進行分離和純化，分離和純化過的單體非對映異構(gòu)體可用于抗腫瘤治療。傳統(tǒng)的知識會使人們預(yù)料，在有幾個官能基的紫杉烷化合物存在下使用鹵素將產(chǎn)生不良的副反應(yīng)，從而消耗三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿和鹵素的濃度，而不形成所要的二鹵三尖杉寧堿，或是使其相當(dāng)高的產(chǎn)率降低。還預(yù)料其它有價值的紫杉烷，例如紫杉醇，會由于這種鹵化作用而降級。但是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，三尖杉寧堿和7-表-三尖杉寧堿中2″，3″-側(cè)鏈雙鍵鹵化的選擇性在所控制的條件下很高，紫杉醇既不明顯降級也不發(fā)生鹵化。如上所述，通過用例如HPLC對反應(yīng)進行監(jiān)測，鹵化期間任何不良的降級或反應(yīng)產(chǎn)物均可避免，并且能適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)有效條件而無需過多的實驗工作。本發(fā)明中使用的鹵素的摩爾當(dāng)量取決于三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿含量和其它不飽和化合物是否存在。一般來說，純度較差的混合物，即，相對于三尖杉寧堿和7-表-三尖杉寧堿不飽和紫杉烷類的含量較多的混合物，將需要較高摩爾當(dāng)量的鹵素使混合物中存在的所有的或基本上所有的三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿鹵化。通常在植物提取物中與三尖杉寧堿、7-表-三尖杉寧堿和紫杉醇一起存在的各種其它不飽和紫杉烷的結(jié)構(gòu)在列下面式(V)中提供以下實施例用以說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，具體說明含有不同數(shù)量三尖杉寧堿、7-表-三尖杉寧堿、紫杉醇及其它紫杉烷類的樣品的選擇性溴化和氯化，而沒有明顯的不良反應(yīng)和/或降級(例如紫杉醇)。還提供了顯示本發(fā)明的二鹵三尖杉寧堿/二鹵-7-表-三尖杉寧堿化合物抗腫瘤效力的實施例。這些實施例只是用來說明本發(fā)明的某些實施方案，而不是對于由權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍的限制。實施例1含三尖杉寧堿的部分純化混合物的溴化將還含有約6-7％紫杉醇的91.5％三尖杉寧堿0.63g(0.0007mol)在150ml四氯化碳中的溶液加到一只裝有250ml分液漏斗的500ml三口圓底燒瓶中。然后將燒瓶浸在冰鹽浴中。當(dāng)溫度降到-5℃時，以反應(yīng)溫度不超過5℃的速度在攪拌下慢慢加入溴(0.122lg)在四氯化碳中的溶液(76.31ml，0.01M)。三尖杉寧堿與溴的摩爾比為1∶1.1。這一加入步驟約需3小時，所形成的溶液為淺褐色并且混濁。每小時進行HPLC分析以監(jiān)測溴化反應(yīng)。當(dāng)所有的三尖杉寧堿都轉(zhuǎn)化成2″，3″-二溴衍生物時反應(yīng)完全，根據(jù)HPLC分析這需要8小時。由于溴的消耗，與深色的起始溶液不同，反應(yīng)混合物為淺黃色至無色。然后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到一升的分液漏斗中，先用0.5％亞硫酸鈉水溶液(300ml)和0.5％碳酸氫鈉水溶液(300ml)洗，然后用去離子水洗2次(每次200ml)，至最終pH為6.5。合并的水層用CH2Cl2萃取一次，CH2Cl2層與先前的有機萃取液混合。有機層隨后用Na2SO4干燥，過濾，蒸發(fā)至干。產(chǎn)量為0.76g淺奶油色固體，按起始物計產(chǎn)率約100％。將奶油色的固體物質(zhì)在硅膠柱(50g，ICNSilitech，32-63D，60)上層析，用丙酮∶CH2Cl2溶劑混合物(10∶90)作洗脫劑。收集50ml級分并用TLC檢驗(硅膠60F254，Merck#5554，用丙酮/CH2Cl220/80展開，用香草醛-硫酸/甲醇噴霧試劑)。此級Rf＝0.64處有一單斑的級分(級分#26-#38)混合，濃縮至干，得到0.485g淺奶油色粉末，將其重結(jié)晶成白色晶狀固體，熔點158℃，用物理化學(xué)方法(TLC，HPLC，UV，IR，NMR，MS)鑒定為2″，3″-二溴三尖杉寧堿。按起始物三尖杉寧堿計算，產(chǎn)率估計為70％。實施例2含有三尖杉寧堿、紫杉醇和其它紫杉烷類化合物的粗制混合物的溴化采用與實施例1中使用的類似裝置，將2.0g粗制的紫杉醇樣品溶在150ml四氯化碳和150mlCH2Cl2中形成透明的淺黃色溶液，該樣品根據(jù)HPLC分析含有51.2％紫杉醇、28.8％三尖杉寧堿和約20％其它紫杉烷類或非紫杉烷類雜質(zhì)的混合物。將燒瓶浸在冰鹽浴中攪拌。當(dāng)溫度降到-5℃時，以反應(yīng)溫度不超過5℃的速度向溶液中加入0.1332g100％溴在83.13ml(0.01M)四氯化碳中的溶液(1摩爾三尖杉寧堿∶1.2摩爾溴)。加料約需3小時，形成混濁的淺黃褐色溶液。加完溴之后，使反應(yīng)在相同條件下再繼續(xù)8小時，每小時進行紫杉醇和三尖杉寧堿的HPLC分析。當(dāng)溶液變成無色或淺黃色并且所有的三尖杉寧堿都已轉(zhuǎn)化成二溴衍生物時，反應(yīng)完成。如果在上述8小時后溶液仍含有多于1-2％的三尖杉寧堿，則保持原來的條件，逐滴加入10ml0.01M溴/四氯化碳，反應(yīng)1小時，然后再用HPLC分析。反應(yīng)混合物中多余的溴用0.5％Na2SO3水溶液(300ml)、0.5％NaHCO3水溶液(200ml)和去離子水(2×200ml)依次洗滌除掉。反應(yīng)混合物用無水硫酸鈉干燥，在高真空下濃縮至干，得到2.35g干燥的淺奶油色至白色的粉末。干物質(zhì)隨后在實施例1列出的條件下在硅膠柱上純化。要分離的混合物與硅膠之比為1∶60，因此使用120g硅膠。每個級分均用TLC檢驗，每第三個級分用HPLC檢驗。將在TLC中具有相同Rf并在HPLC中具有相同保留時間的級分混合，得到兩個合并的級分。級分(#25-#39)顯示一個Rf0.64的TLC單斑，代表二溴三尖杉寧堿；級分(#41-#81)顯示Rf0.49的TLC單斑，代表紫杉醇。級分#25-#39在約40℃于高真空下濃縮至干以后，形成白色到淺黃色固體0.460g(理論產(chǎn)率的66.6％)，熔點158-160℃，用TLC測定色譜純度為96.19％。所用的TLC材料如下在硅膠60F254板(Merck，#5554)上Rf＝0.64(單斑)溶劑體系丙酮∶CH2Cl2(20∶80)噴霧試劑香草醛/硫酸在甲醇中所得二溴三尖杉寧堿的質(zhì)譜[FAB]+[M+H]+＝990，992，994[M+Na]+＝1014[M+K]+＝1030第二合并級分(#41-#81)濃縮后得到1.16g(＞100％理論產(chǎn)率)紫杉醇，將它用50∶50丙酮/己烷重結(jié)晶、過濾，用同樣比例的冷卻溶劑洗，在40℃于高真空下干燥24小時。產(chǎn)量為0.902g(按起始物計為45.11％，按起始物中紫杉醇的HPLC分析計為88.08％)白色晶體物質(zhì)，熔點214-216℃。TLC分析物質(zhì)在可信樣品存在下在硅膠60F254板〔Merck#5554〕上Rf＝0.49。溶劑體系丙酮/CH2Cl2(20∶80)。噴霧試劑香草醛/硫酸在甲醇中所形成物質(zhì)的紫外與紅外光譜均與純的紫杉醇相當(dāng)，從而證實此溴化反應(yīng)對于三尖杉寧堿的2″，3″不飽和側(cè)鏈位置的高度選擇性，而留下它的密切類似物紫杉醇不受觸動。實施例3說明含三尖杉寧堿的粗制混合物溴化反應(yīng)的放大實施例將10.00g粗制的紫杉醇(根據(jù)HPLC分析，含量為28.8％三尖杉寧堿、51.2％紫杉醇和約20％其它紫杉烷類或非紫杉烷類雜質(zhì))溶在一只2升三口燒瓶內(nèi)的1.5升四氯化碳中，燒瓶裝有一個500ml的分液漏斗、回流冷凝器、溫度計和磁攪拌器，并浸沒在冰鹽浴中。攪拌反應(yīng)混合物直到溫度降到-5℃，然后逐滴加入41.2ml0.1M的溴(0.665g溴)/四氯化碳溶液，歷時約3小時。三尖杉寧堿與溴之摩爾比為1∶1.2。溫度不超過5℃。加完溴溶液后，繼續(xù)攪拌并維持溫度為-1至5℃。每小時用HPLC監(jiān)測反應(yīng)，直到所有的三尖杉寧堿都轉(zhuǎn)化成二溴衍生物(約8小時)。此1500-1600ml溶液的最終顏色是淺黃或奶油色，這取決于起始混合物的顏色和可能存在的少量多余溴。為除掉任何微量的溴，將反應(yīng)混合物依次用0.5％Na2SO3水溶液(500ml)、0.5％NaHCO3水溶液(500ml)和去離子水(2×500ml)洗。反應(yīng)混合物隨后用無水Na2SO4干燥，減壓濃縮至干，得到13.20g淺奶油色至白色的固體物質(zhì)。此物質(zhì)在以上實施例1和2中列出的條件下于硅膠柱上層析分離。用淤漿法制備一只裝有600g硅膠(比例1∶50)的100×5cm的玻璃柱。將柱子用丙酮/CH2Cl2(10∶90)洗脫。使用1升丙酮/CH2Cl2(25∶75)作為最終的柱洗液。每個級分均用TLC分析，每第3個級分用HPLC分析。級分#11-#22具有Rf＝0.64的單斑，將它們合并，濃縮至干燥(40℃，高真空)，得到3.25g(95％)2″，3″-二溴三尖杉寧堿，為白色至淺黃色固體。此化合物的分析如下熔點158-160℃Rf＝0.64(單斑)，在硅膠60F254板(Merck，#5554)上。溶劑體系丙酮/CH2Cl2(20∶80)噴霧試劑香草醛/硫酸在甲醇中元素成分和分子量(根據(jù)HRFAB+)C45H54NO1479Br2[M+H]+計算值990.191000實驗值990.191103(Δm＝0.1ppm)C45H54NO1479Br81Br[M+H]+計算值992.181000實驗值992.189057(Δm＝8.1ppm)C45H54NO1481Br2[M+H]+計算值994.175000實驗值994.187011(Δm＝12.1ppm)C45H53NO14Na79Br81Br[M+Na]+計算值1014.161000其驗值1014.171002(Δm＝9.9ppm)C45H53NO14K79Br81Br[M+K]+計算值1030.097000實驗值1030.144940(Δm＝46.5ppm)[α]D25＝-40.207°(c0.29，MeOH)甲醇中的紫外光譜[λmaxnm，(ε)]274.2(1550.8)；227.1(18610.4)；221.8(18325.1)KBr中的紅外光譜(cm-1)3500，1105，1070(叔和仲OH)3420，1670，1580(-CONH-)3110，3060，1605，1505，770，710(單取代的芳族化合物.)3060，2960，2915，2870，1465，1370(-CH3，-CH2-，＝CH-)3020，1670，1310，980(雙鍵)1730，1270(芳族酯)1715，1240(＞C＝O)1730，1180(乙酸酯)855(環(huán)氧化物環(huán))520(溴化合物)1HNMR，在CDCl3中(300MHz)1.94(d，3H，-COC(Br)CH3-5″)(ppm；僅側(cè)鏈質(zhì)子)1.98(d，3H，-HC(Br)CH3-4″)4.63(qt，1H，＞CH(Br)-3″)13CNMR(300MHz)170.21和170.25(C-1′)(ppm，僅側(cè)鏈C)72.76and72.90(C-2′)172.26and172.32(C-1″)54.34and54.52(C-3′)69.71and69.88(C-2″)55.13and55.35(C-3″)30.39and30.77(C-4″)27.21and27.62(C-5″)EI-MS568，551，509，491，449，431，405，391，386，329，(m/z)(主碎片)326，308，278，264，245，217，200，188，159，149，122，105，91，83，77，55，43.DCI-MS(m/z)(主碎片)569，552，510，492，474，450，432，424，392，387，370，329，327，309，279，265264，246，218，200，188，167，149，125，124，106，101，100，91，83，69.FAB+-MS1030[M+K]+；1014[M+Na]+；992(正離子模式)[M+H]+(見元素分析)；974[M-H2O]+；(m/z)932[M-AcOH]+；914[M-AcOH-H2O]+；912[M-HBr]+；870[M-BzOH]+；854[870-H2O-2H]；832[M2-HBr]+；705[M-243-Ac]+；569[T]+；551[T-H2O]；509[T-AcOH]+；491[T-AcOH-H2O]+；448[T-BzOH]+；429；424[SH2]+；413；405[S-H2O]+；391[S-O-H2O]+；387[T-AcOH-BzOH]+；376；347[S-O-CO-HCHO]+；338327[387-T-AcOH]+；315；284[327-Ac]+，279；264[832-T]+or[424-2HBr]+；246[264-H2O]+；231；218[264-HCOOH]+；188；167[S-C5H8ONBr2]+；149[167-H2O]+；133；122[BzOH]+；113105[Bz]+；91[C7H7]+；83；77[C6H6]+；76；57；55；(T＝化合物中的紫杉烷環(huán)；S-化合物中的酸(側(cè))鏈.)HPLC條件1柱CN10μ(250×4.6mmn)溶劑體系CH3CN∶H2O(40∶60)流速1mL/分檢測器Waters490uv在227nm注射體積20μLRT2″，3″-二溴三尖杉寧堿26.06分。條件2柱CurosilG6μ(250×3.2mm)溶劑體系CH3CN∶H2O(45∶55)流速0.75mL/分檢測器Waters490uv在227nm注射體積20μLRT2″，3″-二溴三尖杉寧堿2種非對映異構(gòu)形式RTI＝23.53RTII＝24.50熱重分析(TGA)28℃(100.0％)，100℃(99.64％)(溫度及分解％)150℃(98.88％)，175℃(95.35％)，180℃(86.74％)，200℃(60.38％)，250℃(45.03％)。示差掃描量熱法(DSC)173.76℃，187.73℃。如以下分析所證實的，粗制紫杉醇混合物的溴化反應(yīng)顯示出對于三尖杉寧堿不飽和側(cè)鏈2″，3″位的令人吃驚的高度選擇性，同時留下紫杉醇不受觸動。將在TLC中具有單斑(Rf0.49，與可信的紫杉醇樣品相同)并在HPLC中有單峰的級分#26-#68合并，濃縮并干燥(40℃，高真空1-2mm)，得到6.10g白色固體。將此物質(zhì)自60ml丙酮/己烷(50∶50)混合物中結(jié)晶，過濾，用同一比例的冷溶劑洗，在高真空下于40℃干燥24小時，得到4.84g(92％)白色晶狀固體，與可信樣品比較后確定為紫杉醇。分析結(jié)果如下熔點214-216℃Rf0.49(在可信樣品存在下)硅膠60F254板(Merck#5554)溶劑體系丙酮/CH2Cl2(20∶80)噴霧試劑香草醛/硫酸在甲醇中元素分析C47H51O14N％C％H％N計算值66.116.021.64實驗值65.975.891.63[α]D25＝-51.104°(c0.33，MeOH)甲醇中的紫外光譜(λmax，nm，(ε)227.2(29824.1)208.026256.3)IR光譜(KBr)(cm-1)3500，1105，1070(tert.&sec.OH)3430，1650，1580(-CONH-)1610，1520，780，710(單取代的芳香環(huán))2950，2910，1480，1450，1370(-CH3，-CH2-，＞CH-基團)3020，1315，980(雙鍵)1725，1270(芳香酯)1710，1240(＞C＝O)850(環(huán)氧化物環(huán))1HNMR譜1.88(S，10H，C-1)；5.66(d，1H，C-2)；(300MHz；CDCl3)3.82(dd，1H，C-3)；2.38(S，3H，CH3COO(ppm)atC-4)；4.94(dd，1H，C-5)；1.88(ddd，1H，C-6)；2.48(ddd，1H，C-6)；2.53(d，1OH，C-7)；4.38(dd，1H，C-7)；6.27(S，1H，C-10)；2.23(S，3H，CH3COOatC-10)；6.20(qt，1H，C-13)；2.27(ddd，1H，C-14)；2.33(dd，1H，C-14)；1.13(S，3H，C-19)；1.23(S，3H，C-18)；1.78(S，3H，C-18)；1.68(S，3H，C-19)；4.20(dd，1H，C-20)；4.30(S，1H，C-20)；3.77(S，1H，C-2′)；4.78(ddd，1H，C-2′)，5.20(ddd，1H，C-3′)，7.10(d，1H，N-1)；7.30-7.53(m，10H，芳香環(huán)上對位和間位HA1，B1，&C1)；7.64(t，1H，A1-p)；7.72(dd，2H，C1-o)；8.11(dd，2H，A1-o).13CNMR譜79.1(C-1)；75.1(C-2)；45.8(C-3)；81.2(300MHz，CDCl3)(C-4)；84.4(C-5)；35.6(C-6)；72.1(ppm)(C-7)；56.7(C-8)；203.6(C-9)；75.6(C-10)；133.3(C-11)；141.9(C-12)；72.3(C-13)；35.7(C-14)；43.2(C-15)；21.8(C-16)；26.9(C-17)；14.7(C-18)；9.5(C-19)；76.5(C-20)；73.3(C-2′)；55.1(C-3′)；20.7(CH3CO)在C-10；22.6(CH3CO在C-4)；170.3(CH3CO在C-10)；171.1(CH3CO在C-4)；167.0(ArCO-A1)；167.0(ArCO-C1)；172.7(PhISCO-)；129.3(aC-A1)；133.8(aC-B1)；138.1(aC-C1)；130.3(o-C，A1)；127.0(o-C，B1)；127.0(o-C，C1)；128.7(m-C，A1)；128.6(m-C，B1)；129.0(m-C，C1)；133.6(p-C，A1)；131.9(p-C，B1)；128.3(p-C，C1).EIMS[M}+＝853568[T]+；550[T-H2O]+；508[T-AcOH]+；490(m/z，主碎片)[T-AcOH-H2O]+；448[T-2AcOH]+or[T-BzOH]+；386[T-AcOH-BzOH]+；326[T-BzOH-2AcOH]+；308[326-H2O]+；286[M-T]+or[S]+；280；268[S-O]+；240[S-O-CO]+；210[S-O-CO-HCOH]+；122[BzOH]+；105[Bz]+；91[C7H7]+；77[C6H5]+；51；43[Ac]+.DC/MS[M+H]+＝854569；551；509；492；449；387；327；(m/z；主碎片)311；287；269；240；224；222；210；165；149；123；105；92；71.FABMS(正離子模式)(m/z；主碎片)892[M+K]-；876[M+Na}+；854[M+H]+；569；551；523；509；495；369；327；286；240；210；177；155；149；119；105；85；69.FABMS(負(fù)離子模式)852-[M-H]-HPLC柱μBondapak苯基溶劑體系CH3CN∶CH3OH∶H2O-132∶20∶48流速1mL/分檢測器Waters490uv在227nm注入體積20μL熱解重量分析50℃(100.0％)，205℃(99.86％)，215℃(99.10％)，220℃(92.19％)，250℃(56.66％)，275℃(45.92％).示差掃描量熱法210℃。水含量(％H2O)0.90％(KarlFischer)實施例42″，3″-二溴三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體的分離與純化4.1原材料批量的云南紫杉粗制植物提取物中含約15-40％三尖杉寧堿，50-70％紫杉醇和約20-35％其它的紫杉烷/非紫杉烷組分，該提取物或是得自西雅圖，俄勒岡州的短葉紫杉(T.brevifolia)，或是得自中華人民共和國(云南紫杉或喜馬拉雅紫杉)。溴試劑得自FisherScientific公司。所用的硅膠是ICNSilitech，32-63μm，60，ICNBiomedicals公司，Aurora，OH。使用的所有溶劑均為HPLC級或ACS級，由Specturm化學(xué)品制造公司得到。所用的純化水為自用的去離子水。4.2粗制植物提取物的溴化將粗制的植物提取物(10.0g，26.4％三尖杉寧堿)溶在氯仿中以便得到總計250ml溶液。將此溶液在冰浴中冷卻并在磁攪拌器連續(xù)攪拌下加入四氯化碳4750ml。向冷卻的溶液(4℃)中逐滴加入0.1M的溴/四氯化碳溶液40ml。此混合物的HPLC分析表明紫杉醇與三尖杉寧堿的峰面積比為2.6∶1。將反應(yīng)混合物在暗處攪拌，溫度逐漸升至15℃。反應(yīng)7小時后，再加入7ml0.1M的溴/四氯化碳溶液，在15℃下繼續(xù)反應(yīng)。又反應(yīng)8小時后，加入最后一份7ml0.1M的溴/四氯化碳溶液，在15℃下繼續(xù)反應(yīng)過夜(14小時)?；旌衔镫S后的HPLC分析表明紫杉醇與三尖杉寧堿的峰面積比為11∶1。再反應(yīng)7小時后此比例增加到12.3∶1。然后用5000ml0.2％亞硫酸鈉水溶液洗此混合物。水層的pH為8.0。接著用水洗兩次(2×5升)。第一次和第二次水洗液的pH分別是6.5-7.0和6.0-6.5。將合并的水層用5升氯仿再萃取。將有機層合并，用無水硫酸鈉(500g)干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下蒸發(fā)至干。固體殘余物(13.64g)用層析法純化。4.3溴化物質(zhì)的層析純化將這樣得到的溴化物質(zhì)(13.64g)用中壓層析法純化，使用用淤漿堆積法填充硅膠(ICNSilitech，32-63μm，60)的柱子(6.9cmi.d.，70cm長)，使用1.5％的甲醇/1，2-二氯乙烷。加入溶在同一溶劑中的樣品，以50ml/分的速度洗脫。共收集55個級分(每份500ml)。各級分用TLC法分析，TLC板用10％甲醇/1，2-二氯乙烷展開，用1％的香草醛在50/50的硫酸-甲醇中的溶液檢測。二溴-7-表-三尖杉寧堿洗脫在級分10-14中，蒸發(fā)掉溶劑后得到1.42g固體。同樣，二溴三尖杉寧堿洗脫在級分24-28中，蒸發(fā)掉溶劑后得到1.64g固體。二溴三尖杉寧堿及相應(yīng)的7-表-三尖杉寧堿的單個非對映異構(gòu)體隨后用下面44中討論的半制備型HPLC拆分和分離。中壓層析級分34-54的蒸發(fā)形成4.79g純的紫杉醇，熔點214°-216℃，用紫外、紅外、高效液相色譜、質(zhì)譜、核磁等測得的分析數(shù)據(jù)與美國專利申請08/571，427中列出的相同。4.42″，3″-二溴三尖杉寧堿和2″，3″-二溴-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體的分離二溴三尖杉寧堿和二溴-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體去除其它雜質(zhì)的最終純化是用半制備型HPLC(WatersDeltaprep3000)完成的，使用一根WatersDeltapakC18柱，100，19mm×30cm，以50％乙腈/水作為流動相，流速15ml/分。洗脫峰用一臺設(shè)定在227nm的WatersLambdaMax481型紫外檢測儀監(jiān)測。將溶在2ml甲醇中的每份200mg物質(zhì)注入柱中。二溴三尖杉寧堿非對映體I的洗脫液在54分時出峰，非對映體II在56分出峰。類似地，二溴-7-表-三尖杉寧堿非對映體III在約104分時出峰，相應(yīng)的非對映體IV在112分時出峰。將從重復(fù)的注入液收集到的級分合并，在40℃下減壓蒸發(fā)除掉有機溶劑。濾出結(jié)晶的固體，用水洗，在40℃下于真空烘箱中干燥，得到純的二溴三尖杉寧堿和二溴-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體。所得到的以下非對映異構(gòu)體的二溴化合物的制備、分離和結(jié)構(gòu)列在VI中(I)(2″R，3″S)-二溴三尖杉寧堿，(DiBr-I)(II)(2″S，3″R)-二溴三尖杉寧堿，(DiBr-II)(III)(2″R，3″S)-二溴-7-表-三尖杉寧堿，(DiBr-III)和(IV)(2″S，3″R)-二溴-7-表-三尖杉寧堿，(DiBr-IV)非對映異構(gòu)體的分析鑒定如下圖1是2″，3″-二溴三尖杉寧堿和2″，3″-二溴-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體(DiBr-I-IV)的TLC分離圖，總結(jié)在下面的表1中。表1分道線化合物(1)DiBr-I(2)DiBr-II(6)DiBr-III(7)DiBr-IV(T)紫杉醇板硅膠60F254(Merck#5554)溶劑體系a)10％CH3OH/1，2-二氯乙烷b)己烷/氯仿/乙酸乙酯/CH3OH20/60/15/5試劑a)紫外光b)香草醛/H2SO4在甲醇中圖2是非對映異構(gòu)體(I)DiBr-I；(II)DiBr-II；(III)DiBr-III；和(IV)DiBr-IV的混合物的HPLC層析譜。在得到此層析譜時使用的設(shè)備和條件如下柱ESIndustriesFSP(五氟苯基)，4，6mm內(nèi)徑×250mm，粒度5μm，孔徑60溶劑體系水/乙腈/甲醇，41∶39∶20流速0.50ml/分，無梯度洗脫檢測器Waters990光電二極管列陣檢測器，在227nm處監(jiān)測。注射體積20μl。圖3是非對映異構(gòu)體DiBr-I、DiBr-II、DiBr-III和DiBr-IV在甲醇中的疊合的紫外光譜圖。譜圖結(jié)果總結(jié)在下面表2中。表2異構(gòu)體λmax(nm)(ε)DiBr-I226.014732DiBr-II226.012415DiBr-III219.437900DiBr-IV218.420013圖4是非對映異構(gòu)體DiBr-I、DiBr-II、DiBr-III和DiBr-IV在KBr中的疊合的紅外光譜圖。其結(jié)果總結(jié)在下面表3中。表3譜線，cm-1官能基3500，1105，1070叔和仲OH3420，1670，1580-CONH-3110，3060，1605單取代的芳香環(huán)1505，770，7102960，2915，2870-CH3-；-CH2-；-CH-1465，1370在脂族或碳環(huán)化合物中3020，1670，1310雙鍵980730，1270芳族酯1715，1240＞C＝O1730，1180乙酸酯855氧雜環(huán)丁烷環(huán)圖5是非對映異構(gòu)體DiBr-I、DiBr-II、DiBr-III和DiBr-IV的EI-MS(電子轟擊質(zhì)譜)譜圖，其結(jié)果總結(jié)如下圖5EI-MS；[M]+＝992(m/z；主碎片)568[T]+；550[T-H2O]+；508[T-AcOH]+；490[T-AcOH-H2O]+；448[T-2AcOH]+；or[T-BzOH]+；390[S-O-H2O]+；386[T-AcOH-BzOH]+；348[S-O-CO-HCHO]+；326[T-BzOH-2AcOH]+；308[T-326-H2O]+；284[327-Ac]+；264[832-T]+；or[424-2HBr]+；246[264-H2O]+；218[264-HCOOH]+；188，167[S-C5H8ONBr2]+；148[167-H2O]+；122[BzOH]+；105[Bz]+；91[C7H7]+；83[C4H7C≡O(shè)]+；77[C6H5]+；57，55.(T＝化合物中的紫杉烷環(huán)S＝化合物中的酸(側(cè))鏈.)圖6是非對映異構(gòu)體DiBr-I、DiBr-II、DiBr-III和DiBr-IV的FAB+-MS(快原子轟擊質(zhì)譜)譜圖，總結(jié)如下圖6FAB+-MS(正離子模式)(m/z)1030[M+K]+；1014[M+Na]+；992[M+H]-(SeeElem.Anal.)；974[M-H2O]+；932[M-AcOH]+；914[M-AcOH-H2O]-；912[M-HBr]+；870[M-BzOH]+；854[870-H2O-2H]；832[M-2HBr]+；705[M-243-Ac]-；569[T]+；551[T-H2O]；509[T-AcOH]+；491[T-AcOH-H2O]+；448[T-BzOH]+；429；424[SH2]+；413；405[S-H2O]+；391[S-O-H2O]+；387[T-AcOH-BzOH]+；376；347[S-O-CO-HCHO]+；338327[387-T-AcOH]+；315；284[327-Ac]+，279；264[832-T]+or[424-2HBr]+；246[264-H2O]+；231；218[264-HCOOH]+；188；167[S-C5H8ONBr2]+；149[167-H2O]+；133；122[BzOH]+；113105[Bz]+；91[C7H7]+；83；77[C6H5]+；76；57；55；(T＝化合物中的紫杉烷環(huán)S＝化合物中的酸(側(cè))鏈.)圖7-10是這些非對映異構(gòu)體的1H-NMR圖譜，圖11是13C-NMR圖譜，結(jié)果總結(jié)如下DIBr-I1H-NMR在CDCL3中(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和一些重要的質(zhì)子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)3.36(d，1H)-4.74(d，1H)-5.68(d，1H)-4.62(qt，1H)-(＞CH-Br)(H-3″)1.81(s，3H)-1.78(d，3H)-2.35(s，3H)-2.68(m，1H)(-CH2-)(H-6a)1.98(m，1H)-(-CH2-)(H-6a)4.41(m，1H)-2.46(d，1H)-6.28(s，1H)-2.22(m，2H)-(-CH2-)(2H-14，a，b)2.01(s，3H)-(-CH3)(3H-C-H)4.22(qt，2H)(-CH2-)(2H-20a，b)DIBr-I13C-NMR(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和一些重要的碳原子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)170.3-(C-1′；C＝O)73.0-(C-2′)54.6-(C-3′)172.4-(C-1″；C＝O)70.1-(C-2″)55.4-(C-3″)22.7-(C-4″)27.6-(C-5″)203.5-(C-9；C＝O)該活性化合物可以其本身、它們的制劑形式或以從中再作進一步稀釋的制備好的使用形式來使用，例如配好備用的溶液劑、懸濁劑、乳劑、粉劑、膏劑和顆粒劑。它們以常規(guī)的方式使用，例如通過澆灌、噴灑、噴霧或撒播的方式。根據(jù)本發(fā)明的活性化合物可在植物出苗前或出苗后應(yīng)用。它們也可在播種前加到土壤中。所用的活性化合物的量可在相當(dāng)大的范圍內(nèi)變化。這主要根據(jù)所要求效果的性質(zhì)而定。通常每公頃土壤面積所用活性化合物的量為0.01至10Kg之間，優(yōu)選每公頃用0.05至5Kg。根據(jù)本發(fā)明的活性化合物的制備和應(yīng)用可見于下面實施例。制備實施例實施例(Ia-1)將4.14g(0.138mol)氫化鈉懸浮在70ml無水甲苯中，并將此混合物回流。滴加溶有25.6g(0.069mol)N-(2，4，6-三甲基苯基-乙?；?-1-氨基-4-叔丁基-環(huán)己烷甲酸甲酯的140ml無水甲苯，再將該混合物回流到反應(yīng)結(jié)束(用薄層層析檢驗)。在混合物冷卻到室溫后，在冰冷卻下滴加乙醇，直至不再放出氫氣。然后蒸除溶劑，殘渣用乙醇溶解，再在0-20℃<p>DIBr-II13C-NMR(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和一些重要的碳原子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)170.3-(C-1′；C＝O)72.9-(C-2′)54.6-(C-3′)172.4-(C-1″)C＝O)70.1-(C-2″)55.2-(C-3″)22.7-(C-4″)27.9-(C-5″)203.5-(C-9；C＝O)DIBr-III1H-NMR在CDCL3中(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和一些重要的質(zhì)子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)3.23(d，1H)4.76(d，1H)5.65(d，1H)4.62(qt，1H)-(＞CH-Br)(H-3″)1.98(s，3H)1.28(s，3H)2.45(s，3H)1.72(t，2H)-(-CH2-)(H-6a，b)3.72(m，1H)4.62(s，1H)6.79(s，1H)2.42(m，1H)-(-CH2-)(2H-14a，b)2.05(m，1H)-(-CH2-)(2H-14a，b)2.18(s，3H)-(-CH3-)(3H-C-18)4.38(s，2H)-(-CH2-)(2H-20a，b)DIBr-III13C-NMR(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和一些重要的碳原子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)169.3-(C-1′；C＝O)72.9-(C-2′)54.0-(C-3′)172.5-(C-1″)C＝O)57.7-(C-2″)54.5-(C-3″)22.6-(C-4″)29.4-(C-5″)207.1-(C-9；C＝O)DIBr-IV1H-NMR在CDCL3中(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和一些重要的質(zhì)子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)3.23(d，1H)<p>DIBr-IV13C-NMR(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和一些重要的碳原子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)169.2-(C-1′；C＝O)72.1-(C-2′)54.1-(C-3′)172.5-(C-1″；C＝O)57.8-(C-2″)54.3-(C-3″)22.6-(C-4″)29.4-(C-5″)207.1-(C-9；C＝O)本發(fā)明的二溴三尖杉寧堿/7-表-三尖杉寧堿的物理化學(xué)性質(zhì)總結(jié)在下面表4中。表4紫杉醇的溴代類似物的物理化學(xué)性質(zhì)</tables>*DiBr-I至IV的IR譜彼此重疊**溶劑體系A(chǔ)甲醇/1，2-二氯乙烷(1∶9或1∶10)溶劑體系B己烷/氯仿/乙酸乙酯/甲醇(2∶6∶1.5∶0.5)***條件1柱ESIndustriesFSP(五氟苯基)4.6mm內(nèi)徑×250mm，粒度5μm，孔徑60；流動相水/乙腈/甲醇(41∶39∶20)；流速0.50ml/分；分離模式無梯度洗脫；檢測器Waters990光電二極管列陣檢測器，在227nm處監(jiān)測洗脫液；注入體積20μl。條件2柱Phenomenex4.6mm內(nèi)徑×250mm，粒度5μm，孔徑80；流動相水/乙腈/甲醇(45∶40∶15)；流速0.50ml/分；分離模式無梯度洗脫；檢測器Waters490可編程多波長檢測器，在227nm處監(jiān)測洗脫液；注入體積整個混合物80μl。實施例5顯示二溴三尖杉寧堿/二溴-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體混合物的抗腫瘤效力及其與已知的紫杉醇抗腫瘤效力相關(guān)的體外和體內(nèi)研究已知紫杉醇及其衍生物Taxotere(Rhne-PoulencRhor公司)對于一些腫瘤具有極其理想的抗腫瘤效力。這些抗腫瘤藥以一種獨特的方式起作用，它們阻止了構(gòu)成有絲分裂紡錘體微管的微管蛋白的解聚，而這種解聚對于細(xì)胞分化是必不可少的，這樣就造成了細(xì)胞分化與腫瘤細(xì)胞增生一道停止。紫杉醇的作用機理，它的藥理性質(zhì)等在例如Rowinsky等的以下文章中有說明“紫杉醇一種新研究的抗微管藥物”，國立癌癥研究所雜志(J.Natl.CancerInst.)821247(1990)。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)一種新的二溴三尖杉寧堿/二溴-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體的混合物具有很強的類紫杉醇的體外和體內(nèi)抗腫瘤效力。5.1體外研究(NCI)以下體外研究是按照國立癌癥研究所(NCI)的試驗性療法計劃進行的，它證實了本發(fā)明的二溴三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體的很強的抗腫瘤效力，而這一效力與紫杉醇的密切相關(guān)。試驗性療法計劃作為公眾服務(wù)提供了一種體外抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)篩選工作，它使用一組60種不同的人類腫瘤細(xì)胞系，用一定濃度范圍的候選藥物對其進行試驗。見Boyd等，藥物開發(fā)研究(DrugDevelopmentResearch)3491-109(1995)，該文在本發(fā)明中全文引用作為參考。正如Boyd等所討論的，篩選工作按這樣的方式設(shè)計和操作，即，構(gòu)成篩選的每種細(xì)胞系的相對和絕對敏感性都要可重復(fù)到能夠產(chǎn)生各個細(xì)胞系對候選藥物響應(yīng)的特征圖形(“指紋”)的程度。近來關(guān)于NCI體外篩選的體內(nèi)對應(yīng)研究已經(jīng)表明，體外篩選是選擇有體內(nèi)抗癌效力的化合物的有效方法。參見Grever等，美國癌癥研究協(xié)會年報(Proc.Am.Assoc.Cancer.Res.)35369(1994)。篩選工作的操作和解釋在Boyd等及本發(fā)明引用的其它幾篇文章中有詳細(xì)的討論，這里無需重復(fù)，只是列出了用化合物“XCLY-401759類似物”表示的新的2″，3″-二溴三尖杉寧堿/二溴-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體與已知的抗腫瘤化合物紫杉醇的篩選對比結(jié)果。XCLY-401759的體外抗腫瘤效力按試驗結(jié)果和均值圖分別示于圖12和13。按相應(yīng)的方式，用劑量響應(yīng)的均值圖表示的紫杉醇體外抗腫瘤效力示于圖14中。5.1.1結(jié)果的討論(NCI)在NCI體外抗癌藥物篩選中，一種抗腫瘤候選藥物，即本發(fā)明的XCLY-401759，對細(xì)胞系生長百分?jǐn)?shù)(PG)的影響和計算出的響應(yīng)參數(shù)在以下文獻中有詳細(xì)的討論Boyd等，“NCI用的以疾病為目標(biāo)的體外抗腫瘤藥物篩選數(shù)據(jù)顯示及分析方法”，細(xì)胞毒性抗癌藥物藥物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)的模型和概念(CytotoxicAnticancerDrugsModelsandConceptsforDrugDiscoveryandDevelopment)，Kluwer學(xué)術(shù)出版社，Amsterdam，11-34頁(1992)，和Monks等“在培養(yǎng)物中使用互異的一組人類腫瘤細(xì)胞系實現(xiàn)高通量抗癌藥物篩選的可行性”，國立癌癥研究所雜志(J.Natl.CancerInst.)83757-766(1991)，上述文獻的全部內(nèi)容在本發(fā)明中引用作為參考。一般來說，在篩選數(shù)據(jù)報告(圖12)和均值圖(圖13和14)中，“GI50”代表50％生長抑制因子，“TGI”代表完全生長抑制或細(xì)胞靜止的作用水平，“LC50”代表致死濃度，或凈的細(xì)胞殺死或細(xì)胞毒性參數(shù)。附有符號“＜”的數(shù)值表示劑量水平或?qū)嶋H值比最低試驗濃度還小，而附有符號“＞”的數(shù)值表示有效劑量或?qū)嶋H值比最高試驗濃度還高。均值圖是由NCI體外篩選試驗中所試驗的化合物對各細(xì)胞系得到的GI50、TGI和LC50濃度構(gòu)成的。Boyd等(1995)提供了關(guān)于均值圖構(gòu)成的詳細(xì)討論。在解釋該均值圖時，通常突出到右方的條塊表示特定細(xì)胞系對一種抗癌候選藥物的敏感性超過所試驗的所有細(xì)胞系的平均敏感性，而延伸到左方的條塊表示細(xì)胞系平均來說對抗癌候選藥物不太敏感。條塊的標(biāo)度是對數(shù)標(biāo)度，于是，在例如GI50均值圖中延伸到垂直參考線右方例如2或3單位的條塊，表示該抗癌候選藥物對于某個特定的細(xì)胞系的響應(yīng)參數(shù)在相當(dāng)于對所有細(xì)胞系所需的平均濃度的百分之一至千分之一的濃度下就可以達到，從而指示該特定的腫瘤細(xì)胞系對于所試驗的候選藥物非常敏感。現(xiàn)在回到圖13，XCLY-401759對于以下細(xì)胞系在TGI方面顯示出相對較大的效果白血病細(xì)胞系HL-60(TB)；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H522；結(jié)腸癌細(xì)胞系COLO205和HT29；CNS癌細(xì)胞系SF-539和SNB-75；卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3；直腸癌細(xì)胞系RXF-393；和乳腺癌細(xì)胞系MCF7、MDA-MB-231/ATCC、HS578T、MDA-MB-435和MDA-N。與圖14的紫杉醇的分析相比較，XCLY-401759對于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H522顯示出象紫杉醇一樣的非常高的響應(yīng)(對于XCLY-401759和紫杉醇分別為＜-8和＜-10)。還比較了XCLY-401759和紫杉醇都具有高量級響應(yīng)的以下細(xì)胞系結(jié)腸癌細(xì)胞系COLO205(＜-8和＜-7.97)，CNS癌細(xì)胞系SNB-75(-7.30和-9.18)，以及例如乳腺癌細(xì)胞系HS5787(-7.61和-9.91)。XCLY-401759對于很多細(xì)胞系的高量級作用在GI50方面或許更顯著，此時XCLY-401759對于很多同一細(xì)胞系，例如對于所試驗的各種結(jié)腸癌細(xì)胞系、黑素瘤細(xì)胞系、卵巢癌細(xì)胞系和直腸癌細(xì)胞系，顯示出與紫杉醇一樣的高響應(yīng)水平，從而其型式屬于類紫杉醇抗腫瘤活性，并因此可重復(fù)地顯示出這種新的XCLY-401759混合物的高的抗腫瘤效力。XCLY-401759的強的類似紫杉醇的抗腫瘤效力進一步表示在總結(jié)于下面表5中的由NCI得到的相關(guān)數(shù)據(jù)中表5NCI對比-相關(guān)-GI50XCLY-401759/LCONC-4.00M(BV)CORR.*NSCLCONC(MAXX)COEFF.(N)化學(xué)名稱1)125973-4.60210.82560紫杉醇2)9999910.0010.81110MDRRHOD303)49842-5.601270.75560長春花堿硫酸鹽4)3053-6.60710.71360放線菌素D5)328426-5.60190.69960葉下珠糖苷6)337766-3.60100.68660蒽雙咪腙鹽酸鹽7)330500-3.30120.66359MACBECINII8)165563-3.70140.61860鴉膽丁9)58514-4.0080.60460色霉素A310)267469-3.70130.59060脫氧阿霉素11)83265-3.90150.58660S-三苯甲基-L-半胱氨酸NCI對比-相關(guān)-TGIXCLY-401759/LCONC-4.00M(BV)CORR.NSCLCONC(MAXX)COEFF.(N)化學(xué)名稱1)125973-4.60200.83059紫杉醇2)49842-5.601280.72759長春花堿硫酸鹽3)332598-9.0090.60559RHIZOXIN4)153858-4.00150.59859美登素5)67574-3.00620.52759長春新堿硫酸鹽6)330500-3.30120.50159MACBECINII7)328426-5.60190.49359葉下珠糖苷8)83265-390150.48459S-三苯甲基-L-半胱氨酸9)325014-3.65110.45159波林菌素10)79037-3.30580.43059氯乙環(huán)己亞硝脲11)349156-3.65110.42259PANCRATIASTATIN*NSC-試驗編號LCONC-最高試驗濃度的對數(shù)MAXX-試驗總數(shù)COEFF.-Pearson相關(guān)系數(shù)CORR.-(N)-細(xì)胞系總數(shù)見Paull等.，國立癌癥研究所雜志(1989)811088-1092。5.2體外研究(南方研究所)一個獨立的研究組——南方研究所(Birmingham，Alabama)進行了關(guān)于XCLY-401759對于MX-1(乳腺癌)、RXF-393(直腸細(xì)胞癌)、NCI-H522(肺腺癌)和OVCAR-3(卵巢癌)等四種人類腫瘤系的生物抗細(xì)胞活性的另外的體外研究。在這些研究中，XCLY-401759類似物顯示出一系列與紫杉醇相近的活性。此項試驗用上述的人類腫瘤細(xì)胞系進行，采用標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)技術(shù)和半自動染料轉(zhuǎn)化分析方法。用于試驗的人類細(xì)胞系的選擇至少部分地是基于以下準(zhǔn)則(1)臨床重要的組織發(fā)生，(2)適當(dāng)?shù)纳L特性，和(3)研究所對于具體細(xì)胞系的經(jīng)驗。該研究的材料、方法和結(jié)果如下。5.2.1材料和方法5.21.1細(xì)胞培養(yǎng)在南方研究所的研究中，人類細(xì)胞系在無菌條件下于含有10％胎牛血清(Sigma化學(xué)公司)、2mML-谷氨酰胺及碳酸氫鈉的RPMI1640(Hyclone公司，完全培養(yǎng)基)中繁殖，并在37℃下于裝有高效微?？諝膺^濾器的SterilcultCO2組織培養(yǎng)恒溫箱(Forma公司)中在5％CO2和濕度95％的條件下培養(yǎng)。每一到兩周將細(xì)胞系傳代培養(yǎng)并用于實驗。所有的細(xì)胞系都用GeneProbeTM(Fischer公司)鑒別支原體的污染，陽性培養(yǎng)物則用BM-CyclinTM抗微生物系統(tǒng)(BoehringerMannheim公司)在三個通道上不斷處理以消除污染物。只有確認(rèn)不含支原體的細(xì)胞系才用來試驗化合物的抗細(xì)胞活性。5.2.1.2抗細(xì)胞活性實驗設(shè)計對于所有的試驗收取細(xì)胞并使其成粒狀沉淀以除去培養(yǎng)基，然后懸浮在新鮮的完全培養(yǎng)基中。取樣測定細(xì)胞密度。細(xì)胞計數(shù)用庫爾特Z1型細(xì)胞計數(shù)器進行，生存力通過用碘化丙錠染色后在庫爾特EPICSElite流動型細(xì)胞計數(shù)上分析來測定。將細(xì)胞樣品用完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至密度為5×103細(xì)胞/ml。在組織培養(yǎng)群集板(96孔，Costar公司產(chǎn)品編號3595)上接種100μl細(xì)胞(5×103)，按所述進行培養(yǎng)。在處理的當(dāng)天將類似物XCLY-401759溶在100％乙醇中，然后逐次地用培養(yǎng)基稀釋。0劑量對照樣用培養(yǎng)基模擬處理。適當(dāng)?shù)目?8行)用5種濃度等級(10-4、10-5、10-6、10-7和10-8M)處理。原始載液(培養(yǎng)基中的乙醇)的最高劑量為≤0.2％乙醇。在0.2％濃度下配制一個載液對照樣以確定載液對細(xì)胞系的影響。將紫杉醇(得自XECHEM公司，NewBrunswick，NewJersey)溶在DMSO中，逐次用培養(yǎng)基稀釋，然后加到孔中使劑量為1×10-8和1×10-9M。每個群集板含有一細(xì)胞對照樣(8個孔，用完全培養(yǎng)基模擬處理)，一個培養(yǎng)基對照樣(7個孔，裝有培養(yǎng)基，用來減掉由培養(yǎng)基條件產(chǎn)生的信號)，和一個空氣空白樣(1個孔，用來校正板讀數(shù)器)。一旦完成加藥，將板堆放并包裹在塑料薄膜中以減少蒸發(fā)，按所述進行培養(yǎng)。平行測定的各組群集板與藥物接觸1或72小時。為保證適當(dāng)?shù)乃幬锝佑|時間，將板在無菌巾上無菌地吸干，用培養(yǎng)基溫和地洗三次。然后向樣品中加入新鮮培養(yǎng)基，將板包在塑料包皮中。兩組接觸藥物的板都培養(yǎng)到第7天，然后用磺化羅丹明B(SRB)法分析抗細(xì)胞活性。5.2.13結(jié)果在一小時接觸中，在所有試驗的細(xì)胞系中都顯示出與XCLY-401759濃度有關(guān)的活性。OVCAR-3卵巢和NCI-H522肺細(xì)胞系對于XCLY-401759最敏感。紫杉醇的活性在所試驗的兩個濃度對于MX1、RXF393和OVCAR-3腫瘤細(xì)胞系最小，而NCI-H522對紫杉醇敏感。當(dāng)接觸時間增加到72小時時，所有的細(xì)胞系對于XCLY-401759和紫杉醇的敏感性都提高。與其它細(xì)胞系相比，MX-1對于紫杉醇和XCLY-401759相對地敏感性差。總之，根據(jù)南方研究所的研究，XCLY-401759在所試驗的不同腫瘤病原的四種人類腫瘤細(xì)胞系中產(chǎn)生一系列與紫杉醇相近的抗細(xì)胞活性。結(jié)果總結(jié)在下面的表6和7中。表6南方研究所處理第1天接觸藥物1小時后洗滌沉淀的板；第7天對板讀數(shù)抑制％處理濃度細(xì)胞系(每孔沉積5.0×103細(xì)胞)藥物(M)RXF393MX-1OVCAR-3NCI-H522XCLY-4017591.0E-082.53.223.17.91.0E-0716.03.781.224.81.0E-0623.80.097.295.21.0E-0542.91.798.199.41.0E-0438142.798.399.5載液對照樣0.00.87.04.5紫杉醇1.0E-093.71.61.28.31.0E-0813.84.07.135.1表7南方研究所處理第1天接觸藥物72小時后洗滌沉積的板；第7天對板讀數(shù)抑制％處理濃度細(xì)胞系(每孔沉積5.0×103細(xì)胞)藥物(M)RXF393MX-1OVCAR-3NCI-H522XCLY-4017591.0E-0864.829.498.797.21.0E-0780.745.499.198.61.0E-0685.176.599.298.41.0E-0581.675.498.898.31.0E-04100.098.3100.0100.0載液對照樣4.42.30.00.0紫杉醇1.0E-0941.510.698.196.11.0E-0873.341.199.398.75.3體內(nèi)研究按照NCI試驗性療法計劃，對于本發(fā)明的XCLY-401759類似物對幾種新生腫瘤細(xì)胞系的抗腫瘤效力進行了體內(nèi)中空纖維試驗。此試驗按照試驗性療法計劃的生物試驗部分進行。在這些試驗中，將所需要的人類腫瘤細(xì)胞在聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纖維中培養(yǎng)，將每種細(xì)胞系的樣品均植入到小鼠兩個生理區(qū)室(腹膜內(nèi)和皮下)的每一室中。每只試驗鼠均接受總計六根纖維(3根腹膜內(nèi)，3根皮下)，代表3種不同的癌細(xì)胞系。三只小鼠用潛在的抗腫瘤化合物處理，每種化合物2種試驗劑量，以腹膜內(nèi)途徑采用每天4次處理的時間表。載液對照樣由6只小鼠組成，它們只接受化合物稀釋劑。在治療最后一天的次日收集纖維培養(yǎng)物。為確定抗腫瘤效力，用甲染料(MTT)轉(zhuǎn)化試驗測定每種細(xì)胞系的活細(xì)胞質(zhì)量。由此，用化合物處理過的樣品的平均光密度除以載液對照樣的平均光密度，計算出T/C％。對各樣品測定細(xì)胞質(zhì)量的凈增加。用XCLY-401759非對映異構(gòu)混合物/化合物對于最低限度的12種人類癌細(xì)胞系進行試驗，總計4次實驗，每次實驗包括3個細(xì)胞系。對于每個細(xì)胞系均以T/C％的形式報道兩個化合物劑量各自的實驗數(shù)據(jù)，腹膜內(nèi)和皮下樣品的數(shù)值分別計算。這一體內(nèi)試驗的結(jié)果總結(jié)在下面的表8-11中。表8XCLY-401759的毛細(xì)管中空纖維試驗NCI實驗編號HF597-0HF宿主…無胸腺裸鼠性別……雌性來源/系……1來源APA％T/C(凈生長)處理MDA-MB-43.5OVCAR-5SF-295組號劑量/單位途徑時間表小鼠數(shù)目纖維數(shù)目IPSCIPSCIPSC3150.00mg/kg/劑量腹膜內(nèi)每天4次，4天3293＞10082＞10091＞1004100.00mg/kg/劑量腹膜內(nèi)每天4次，4天33558460＞1002494載液組3-＞1(劑量-150.00)在鹽水中Tween80(0.05％)(未知)注射體積.0.1ml/10mg體重組4-＞1(劑量-100.00)在鹽水中Tween80(0.05％)(未知)注射體積.0.1ml/10mg體重關(guān)于HF597-0-HF的意見此實驗是在可接受的質(zhì)量控制參數(shù)內(nèi)，被認(rèn)為有效。表9XCLY-401759的毛細(xì)管中空纖維試驗NCl實驗編號HF596-0-HF宿主…無胸腺裸鼠性別……雌性來源/系……1來源APA％T/C(凈生長)處理LOXIMVICOLO205OVCAR-3組號劑量/單位途徑時間表小鼠數(shù)目纖維數(shù)目IPSCIPSCIPSC3150.00mg/kg/劑量腹膜內(nèi)每天4次，4天323633-53＞1007493994100.00mg/kg/劑量腹膜內(nèi)每天4次，4天33-56-19397956284載液組3-＞1(劑量-150.00)在鹽水中Tween80(0.05％)(未知)注射體積.0.1ml/10mg體重組4-＞1(劑量-100.00)在鹽水中Tween80(0.05％)(未知)注射體積.0.1ml/10mg體重關(guān)于HF596-0-HF的意見此實驗是在可接受的質(zhì)量控制參數(shù)內(nèi)，被認(rèn)為有效。表10XCLY-401759的毛細(xì)管中空纖維試驗NCI實驗編號HF594-0-HF宿主…無胸腺裸鼠性別……雌性來源/系……1來源APA％T/C(凈生長)處理NCI-H23MDA-MB-231SW-620組號劑量/單位途徑時間表小鼠數(shù)目纖維數(shù)目IPSCIPSCIPSC3150.00mg/kg/劑量腹膜內(nèi)每天4次，3天337285909988834100.00mg/kg/劑量腹膜內(nèi)每天4次，3天3361＞10021＞10092＞100載液組3-＞1(劑量-150.00)在鹽水中Tween80(0.05％)(未知)注射體積.0.1ml/10mg體重組4-＞1(劑量-100.00)在鹽水中Tween80(0.05％)(未知)注射體積.0.1ml/10mg體重關(guān)于HF594-0-HF的意見此實驗是在可接受的質(zhì)量控制參數(shù)內(nèi)，被認(rèn)為有效。表11XCLY-401759的毛細(xì)管中空纖維試驗NCI實驗編號HF595-0-HF宿主…無胸腺裸鼠性別……雌性來源/系……1來源APA％T/C(凈生長)處理NCI-H522UACC-62U251組號劑量/單位途徑時間表小鼠數(shù)目纖維數(shù)目IPSCIPSCIPSC3150.00mg/kg/劑量腹膜內(nèi)每天4次，3天3375＞100626058944100.00mg/kg/劑量腹膜內(nèi)每天4次，3天33599864＞100487載液組3-＞1(劑量-150.00)在鹽水中Tween80(0.05％)(未知)注射體積.0.1ml/10mg體重組4-＞1(劑量-100.00)在鹽水中Tween80(0.05％)(未知)注射體積.0.1ml/10mg體重關(guān)于HF595-0-HF的意見此實驗是在可接受的質(zhì)量控制參數(shù)內(nèi)，被認(rèn)為有效。實施例62″，3″-二氯三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體的制備及生物活性研究6.1原材料云南紫杉或喜馬拉雅紫杉的粗制植物提取物得自中華人民共和國，其中含有約15-40％的三尖杉寧堿、約50-70％的紫杉醇和約20-35％的其它紫杉烷/非紫杉烷組分。氯氣得自Matheson公司。所用的硅膠是ICNSilitech，32-63μm，60，ICNBiomedicals公司，Aurora，OH。使用的溶劑全是HPLC級或ACS級，得自Spectrum化學(xué)品制造公司。所用的純化水為自備去離子水。6.2粗制植物提取物在氧化氯仿中的氯化6.2.1氧化氯仿的制備將氯(3.12g)逐滴加到41氯仿中以便中和在市售溶劑中存在的穩(wěn)定劑戊烯。將溶液激烈混合，在室溫下放置過夜，然后用1.5％亞硫酸鈉溶液(1.0l)洗一次，用水(2×1.0l)洗兩次。接著加過氧化氫溶液(3％，10ml)，激烈混合，放置3-5天。溶劑中的氯含量用容量分析法測定。隨后向5ml溶劑樣品中加1.0NHCl(10ml)和水(50ml)。向此混合物中加KI(2g)，充分混合至溶解，所形成的深褐色溶液用0.1N硫代硫酸鈉溶液滴定。當(dāng)溶液的顏色變成淺褐色時，加入3-4滴淀粉指示劑溶液(0.5％，USP)。將這一深藍-紫色溶液進一步滴定至溶液變成無色。記下達到終點時所用的硫代硫酸鈉溶液的體積，算出氯含量。理想的氯含量為0.01-0.1％。將溶劑用無水硫酸鈉(100g)干燥，用于下面的氯化反應(yīng)。6.2.2氯化將粗制的植物提取物(5.0g，28.8％三尖杉寧堿，62.2％紫杉醇)溶在3升燒瓶內(nèi)用冰浴冷卻到4℃的氧化氯仿(1升)中。1小時后混合物的HPLC分析表明紫杉醇與三尖杉寧堿之比為8∶1。隨后將反應(yīng)混合物于15℃下攪拌9小時。此時反應(yīng)混合物的HPLC分析表明紫杉醇與三尖杉寧堿之比為19∶1。用5ml去離子水洗過的5ml反應(yīng)混合物樣品的pH約為2.0。然后用500ml1.0％亞硫酸鈉水溶液洗，水層的pH為7.5。接著用水洗兩次(2×500ml)。第一次和第二次水洗液的pH分別為7.0和6.5。合并的水層再用150ml氯仿萃取。將有機層合并，用無水硫酸鈉(85g)干燥，蒸發(fā)至干。固體殘余物(5.85g)用層析法純化。氯化物質(zhì)的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析表明，形成了作為反應(yīng)產(chǎn)物的二氯三尖杉寧堿的非對映體以及在起始物中存在的紫杉醇混合物。6.3氯化物質(zhì)的層析純化將氯化物質(zhì)(5.85g)在一個用淤漿法堆積的硅膠(300g)柱(4.1cm內(nèi)徑，62cm長)上用10％丙酮/1，2-二氯乙烷層析純化。將樣品溶在10％丙酮/1，2-二氯乙烷中。在頭兩個700和350ml的級分之后，所有的后繼級分均限于50ml。各級分用TLC法分析(TLC板用20％丙酮/1，2-二氯乙烷展開，用1％的香草醛/50∶50硫酸∶甲醇檢測)。二氯三尖杉寧堿洗脫在級分8-13中，溶劑蒸發(fā)后得到1.6g固體(～90％)。此物質(zhì)最后用半制備型HPLC純化。6.4粗制的植物提取物在1，2-二氯乙烷中氯化6.4.1氯在1，2-二氯乙烷中的溶液的制備為制備氯在1，2-二氯甲烷中的溶液，將氯氣緩慢地鼓入用冰預(yù)冷到0-4℃的1升1，2-二氯乙烷中。繼續(xù)鼓氣幾分鐘(約10分鐘)，直到1，2-二氯乙烷中的氯達到所要求的濃度。定期抽取溶劑樣品并分析溶解的氯含量如下向一只250ml的錐形瓶中的5ml溶劑樣品內(nèi)加入1.0NHCl(10ml)和水(50ml)。向此混合物中加入KI(2g)，充分混合至溶解，生成的深褐色溶液用0.1N硫代硫酸鈉溶液滴定。當(dāng)溶液的顏色變成淺褐色時，加3-4滴淀粉指示劑溶液(0.5％，USP)。將此深藍-紫色溶液進一步滴定，直到溶液變成無色。記下達到終點時所用的硫代硫酸鈉溶液的體積，計算氯含量。理想的氯含量為0.01-0.1％。6.4.2氯化將溶在1，2-二氯乙烷(200ml)中的粗制植物提取物(5.0g)冷卻到-4℃，在攪拌下逐滴加到用冰浴冷卻到4℃的0.06％氯/1，2-二氯乙烷(1250ml)溶液中。加完后將混合物在4℃下攪拌1小時，樣品用HPLC分析。HPLC分析表明三尖杉寧堿的峰幾乎完全消失。將混合物用1.0％亞硫酸鈉溶液(1升)和水(2×1升)洗。水層的pH值如下亞硫酸鈉洗，7.5-8.0；第一次水洗，6.0-6.5；第二次洗，5.5。將水層用1，2-二氯乙烷(200ml)萃取。將有機層合并，用無水硫酸鈉(50g)干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下蒸發(fā)。殘余的固體在真空烘箱中于40℃下干燥2小時，得到5.3g氯化物質(zhì)。此物質(zhì)的HPLC分析表明，作為反應(yīng)產(chǎn)物的二氯三尖杉寧堿與起始的粗制植物提取物中存在的紫杉醇一起存在。6.5氯化物質(zhì)與紫杉醇用結(jié)晶法分離將6.4.2中的氯化的產(chǎn)物混合物(5.30g)溶在250ml錐形瓶內(nèi)的50ml丙酮中。向此溶液中加入己烷(65ml)，充分混合，在室溫下放置直到開始結(jié)晶。然后將錐形瓶在4℃下存放60小時。將晶體過濾，用冷的20％丙酮/己烷洗，在真空烘箱中于40℃干燥3.5小時，得到3.10g紫杉醇(～95％，晶體I)。將合并的濾液和洗液蒸發(fā)，殘余的固體在真空烘箱中于40℃下干燥2小時，得到1.96g母液物質(zhì)(母液I)。將晶體I(3.10g)溶在32ml丙酮中，向此溶液中加入40ml己烷，混合物在室溫下放置5小時，4℃下放置過夜。將晶體過濾，用20％丙酮/己烷洗，在40℃下于真空烘箱中干燥3小時，得到2.49g紫杉醇(98.5％，晶體II)。將濾液和洗液合并后蒸發(fā)。殘余的固體在真空烘箱中于40℃下干燥2小時，得到0.65g母液物質(zhì)(母液II)。將晶體II再次溶于溫?zé)岬谋?25ml)中。向此溶液中加入25ml己烷，混合物在室溫下存放5小時，4℃下放置過夜。將晶體過濾，用20％丙酮/己烷洗，在真空烘箱中于40℃下干燥，得到2.10g紫杉醇(99.5％，晶體III)。將濾液和洗液合并，蒸發(fā)。殘余的固體在真空烘箱中于40℃下干燥2小時，得到0.47g母液物質(zhì)(母液III)。母液I、II和III含有二氯三尖杉寧堿，將其合并，用半制備型HPLC進一步分離。6.62″，3″-二氯三尖杉寧堿和2″，3″-二氯-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體的最終純化二氯三尖杉寧堿和7-表-二氯三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體去除其它雜質(zhì)的最終純化用半制備型HPLC(WatersDeltaprep3000)完成，使用WatersDeltapakC18柱(100，19mm×30cm)，以45％乙腈/水作為流動相，流速為15ml/分。用設(shè)定在227nm的紫外檢測器監(jiān)測洗脫峰。注入溶在2ml甲醇中的每份200mg物質(zhì)。二氯三尖杉寧堿非對映體I在約86分時出現(xiàn)洗脫峰，而非對映體II在98分。類似地，二氯-7-表-三尖杉寧堿非對映體III在約118分時出峰，而相應(yīng)的非對映體IV在124分時出峰。由重復(fù)注入的樣品中收集相應(yīng)級分，合并后于40℃減壓蒸發(fā)以除去有機溶劑。濾出結(jié)晶的固體，用水洗，在真空烘箱中于40℃下干燥，得到純的二氯三尖杉寧堿和二氯-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體。用這種方式分離出的二氯三尖杉寧堿非對映體I帶有污染物，通過在所述的HPLC步驟在峰值洗脫時收集較小的級分作進一步的純化。所得到的以下非對映異構(gòu)的二氯化合物的制備、分離和結(jié)構(gòu)示于VII中(I)(2″R，3″S)-二氯三尖杉寧堿(DiCl-I)；(II)(2″S，3″R)-二氯三尖杉寧堿(DiCl-II)；(III)(2″R，3″S)-二氯-7-表-三尖杉寧堿(DiCl-III)；和(IV)(2″S，3″R)-二氯-7-表-三尖杉寧堿(DiCl-IV)。這些非對映異構(gòu)體的分析鑒定如下。圖15是2″，3″-二氯三尖杉寧堿和2″，3″-二氯-7-表-三尖杉寧堿立體異構(gòu)體(DiCl-I至DiCl-IV)的TCL分離圖。圖16的圖標(biāo)列在下面的表12中。表12分道線編號立體異構(gòu)體1DiCl-I2DiCl-IIT紫杉醇3DiCl-III4DiCl-IV板硅膠60F254(Merck#5554)溶劑體系a)10％CH3OH/1，2-二氯乙烷b)己烷/氯仿/乙酸乙酯/CH3OH20∶60∶15∶5試劑a)紫外光b)香草醛/H2SO4-甲醇圖16是本發(fā)明的二氯三尖杉寧堿和二氯-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體混合物的HPLC層析圖，各個峰鑒別在下面表13中。表13峰編號立體異構(gòu)體IDiCl-IIIDiCl-IIIIIDiCl-IIIIVDiCl-IV在產(chǎn)生此層析譜中使用的設(shè)備和條件如下柱ESIndustries，F(xiàn)SP(五氟苯基)；4.6mm內(nèi)徑×250mm；5μm；60溶劑體系水/乙腈/甲醇，41∶39∶20流速0.50ml/分，無梯度檢測器Waters900光電二極管列陣檢測器，在227nm處監(jiān)測注入體積20μl。在圖17中以疊合的形式列出了本發(fā)明的立體異構(gòu)體在甲醇中的紫外光譜。譜圖結(jié)果總結(jié)在下面的表14中。表14峰編號立體異構(gòu)體λmax，nm(ε)IDiCl-I226.614,813IIDiCl-II227.214,990IIIDiCl-III228.217,252IVDiCl-IV229.414,694圖15畫出了本發(fā)明立體異構(gòu)體的疊合的紅外光譜圖，其內(nèi)容總結(jié)在下面的表15中。表15譜線，cm-1官能基3500，1105，1070叔和仲羥基3420，1670，1580-CONH-3110，3060，1605單取代的芳香環(huán)1505，770，7102960，2915，2870-CH3-；-CH2-；-CH-基團1465，1370(在脂族或碳環(huán)化合物中)3020，1670，1310雙鍵9801730，1270芳香酯1715，1240＞＝O基團1730，1180乙酸酯855氧雜環(huán)丁烷環(huán)圖19-22分別是DiCl-I、DiCl-II、DiCl-III和DiCl-IV非對映異構(gòu)體在CDCl3中的1H-NMR譜圖(300MHz)，圖23是這些非對映異構(gòu)體的13C-NMR(300MHz)譜圖，其結(jié)果全總結(jié)如下DICL-I1H-NMR在CDCL3中(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和某些重要的質(zhì)子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)2.54(m，1H)-(H-6a)1.92(t，1H)-(H-6b)2.32(m，2H)-(H-14a)2.32(m，2H)-(H-14b)4.58(q，1H)-(＞CH-Cl-C3″)1.55(d，3H)1.70(s，3H)DICL-I13C-NMR在CDCL3中(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和某些重要的碳原子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)170.2-(C-1′；C＝O)73.1-(C-2′)55.0-(C-3′)172.0-(C-1′)C＝O)70.8-(C-2″)58.7-(C-3″)21.8-(C-4″)27.5-(C-5″)203.6-(C-9；C＝O)DICL-II1H-NMR在CDCL3中(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和某些重要的質(zhì)子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)2.56(m，1H)-(H-6a)1.94(t，1H)-(H-6b)2.34(m，2H)-(H-14a)2.34(m，2H)-(H-14b)4.58(q，1H)-(＞CH-Cl-C3″)1.55(d，3H)1.70(s，3H)DICL-II13C-NMR(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和某些重要的碳原子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)170.2-(C-1′；C＝O)72.6-(C-2′)55.0-(C-3′)172.6-(C-1″)C＝O)70.6-(C-2″)58.7-(C-3″)21.8-(C-4″)27.7-(C-5″)203.5-(C-9；C＝O)DICL-III1H-NMR在CDCL3中(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和某些重要的質(zhì)子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)2.35(m，2H)-(H-6a)2.35(m，2H)-(H-6b)2.54(m，1H)-(H-14a)2.35(m，1H)-(H-14b)4.50(qt，1H)-(＞CH-Cl-C3″)1.52(d，3H)1.28(s，3H)DICL-III13C-NMR(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和某些重要的碳原子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)170.2-(C-1′；C＝O)73.0-(C-2′)54.8-(C-3′)172.2-(C-1″)C＝O)62.7-(C-2″)55.3-(C-3″)21.6-(C-4″)29.3-(C-5″)203.5-(C-9；C＝O)DICL-IV1H-NMR在CDCL3中(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和某些重要的質(zhì)子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)2.35(m，2H)-(H-6a)2.35(m，2H)-(H-6b)2.54(m，1H)-(H-14a)2.35(m，1H)-(H-14b)4.50(q，1H)-(＞CH-Cl-C3″)1.52(d，3H)1.28(s，3H)DICL-IV13C-NMR(300MHz，ppm；僅側(cè)鏈和某些重要的碳原子)化學(xué)位移(ppm)指認(rèn)170.2-(C-1′；C＝O)72.9-(C-2′)53.9-(C-3′)172.2-(C-1″)C＝O)62.5-(C-2″)55.0-(C-3″)21.7-(C-4″)29.3-(C-5″)203.5-(C-9；C＝O)圖24是DiCl-IV非對映體的EI-MS圖譜，它同樣是DiCl-I、DiCl-II、DiCl-III的碎裂圖譜，圖25是這些非對映異構(gòu)體的MS-FAB+(快原子轟擊質(zhì)譜)圖，其結(jié)果總結(jié)如下。DiCl-I，DiCl-II，DiCl-III和DiCl-IVE1-MS；[M+]＝902568[T]+；550[T-H2O]+；508[T-AcOH]+；490[T-AcOH-H2O]+；(m/z，主碎片)480；448[T-2AcOH]+或[T-B2OH]+；386[T-AcOH-B2OH]+326[T-B2OH-2ACOH]+；308[T-326-H2O]+；264[832-T]+；246[264-H2O]+；188；148；122[B2OH]+；105[B2]+；91[C7H7]+；83[C4H7C＝O]；77[C6H5]+；57；55；43DiCl-I、DiCl-II、DiCl-III和DiCl-IV(m/z，主碎片)940([M+K]+)；924([M+Na]+)；902([M+1H]+)；842([M-60+])；832([cephal])；824([M-60-18]+)；569([T]+)；551([T-18]+)；527([T-43]+)；509([T-60]+)；491([T-60-18]+)；449/448([T-122]+)；405([S-18])；387([T-60-122]+)；327([387-60]+)；309([327-18]+)；264([832-T]+)；246([264-18]+)；218([264-46]+)；105([C6H5CO]+)；91([C7H7]+)；77([C6H5]-)；本發(fā)明的二氯三尖杉寧堿/二氯-7-表-三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體的物理化學(xué)性質(zhì)總結(jié)在下面的表16中。表16紫杉醇的氯化類似物的物理化學(xué)性質(zhì)</tables>*DiCl-I至IV的IR圖譜是可重合的。**溶劑體系A(chǔ)甲醇/1，2-二氯乙烷(1∶10)溶劑體系B己烷/氯仿/乙酸乙酯/甲醇(2∶6∶1.5∶0.5)***條件1柱ESIndustriesFSP(五氟苯基)4.6mm內(nèi)徑×250mm，5μm粒徑，孔徑60；流動相水/乙腈/甲醇(41∶39∶20)；流速0.50ml/分；分離模式無梯度；檢測器Waters990光電二極管列陣檢測器，在227nm處監(jiān)測洗脫液；注入體積20μl。條件2柱Phenomenex4.6mm內(nèi)徑×250mm，5μm粒徑，孔徑80；流動相水/乙腈/甲醇(45∶40∶15)；流速0.50ml/分；分離模式無梯度；檢測器Waters490可編程多波長檢測器，在227nm處監(jiān)測洗脫液；注入體積80μl總混合物。實施例7顯示(2″R，3″S)-和(2″S，3″R)-二氯三尖杉寧堿非對映異構(gòu)體抗中瘤效力的體外NCI研究在此項NCI研究中，分離和純化過的二氯三尖杉寧堿的(2″R，3″S)和(2″S，3″R)非對映異構(gòu)體在NCI的60種人類腫瘤細(xì)胞系篩選研究中顯示出很強的類似紫杉醇的體外抗腫瘤效力。7.1結(jié)果的討論NCI體外研究的結(jié)果總結(jié)在圖26、27、28和29中。分別代表非對映異構(gòu)體(2″R，3″S)和(2″S，3″R)的圖27和29兩個均值圖顯示出這兩種化合物的強抗腫瘤效力。權(quán)利要求1.化學(xué)式如下的一種化合物其中R選自R1＝OHR2＝H；R1＝OHR2＝H；R1＝HR2＝OH；和R1＝HR2＝OH；X是鹵素。2.一種藥物制劑，其中包括作為活性組分的權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，以及一種或多種可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。3.一種治療動物或人類腫瘤的方法，其中包括使需要治療的動物或人服用腫瘤敏感數(shù)量的權(quán)利要求1化合物。4.一種制造二鹵三尖杉寧堿和/或二鹵-7-表-三尖杉寧堿的方法，該方法包括在能夠?qū)⑷馍紝帀A和/或7-表-三尖杉寧堿的2″，3″不飽和側(cè)鏈部分選擇性鹵化的條件下，將三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿鹵化，生成2″，3″-二鹵三尖杉寧堿和/或二鹵-7-表-三尖杉寧堿。5.權(quán)利要求4的方法，其中三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿以任何數(shù)量存在于含有紫杉醇及其它含紫杉烷環(huán)化合物的混合物中，隨后自混合物中分離出這樣生成的2″，3″-二鹵三尖杉寧堿。6.權(quán)利要求5的方法，其中鹵化反應(yīng)在暗處于約-20℃至20℃的溫度下進行。7.權(quán)利要求6的方法，其中的反應(yīng)溫度為約-5℃至5℃。8.權(quán)利要求7的方法，其中鹵化反應(yīng)用相對于三尖杉寧堿濃度為化學(xué)計量數(shù)量的鹵素進行。9.以下化學(xué)式的一種化合物其中R選自R1＝OHR2＝HR1＝OHR2＝HR1＝HR2＝OH；和R1＝HR2＝OH10.一種藥物制劑，其中含有作為活性組分的權(quán)利要求9的化合物或其可藥用的鹽，以及一種或多種可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。11.一種治療動物和人類腫瘤的方法，該方法包括使需要治療的動物或人服用腫瘤敏感數(shù)量的權(quán)利要求9化合物。12.權(quán)利要求11的方法，其中在所服用的化合物里，；R1＝OH；R2＝H13.權(quán)利要求11的方法，其中在所服用的化合物里，；R1＝OH；R2＝H14.權(quán)利要求11的方法，其中在所服用的化合物里，；R1＝H；R2＝OH15.權(quán)利要求11的方法，其中在所服用的化合物里，；R1＝H；R2＝OH16.一種制備以下化學(xué)式的化合物的方法，其中R選自R1＝OHR2＝HR1＝OHR2＝HR1＝HR2＝OH；andR1＝HR2＝OH；所述方法包括，在能夠?qū)⑷馍紝帀A和/或7-表-三尖杉寧堿的2″，3″-不飽和側(cè)鏈部分選擇性溴化的條件下將三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿溴化。17.權(quán)利要求16的方法，其中生成了非對映異構(gòu)體化合物I、II、III和IV的混合物，該方法還包括從混合物中將各化合物I、II、III和IV分開。18.權(quán)利要求16的方法，其中三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿以任何數(shù)量存在于含有紫杉醇和其它紫杉烷環(huán)化合物的混合物中。19.權(quán)利要求16的方法，其中溴化反應(yīng)在暗處于約-20℃至20℃的溫度下進行。20.權(quán)利要求19的方法，其中反應(yīng)溫度為約-5℃至5℃。21.權(quán)利要求18的方法，其中溴化反應(yīng)用相對于三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿濃度為化學(xué)計量數(shù)量的溴進行。22.權(quán)利要求18的方法，其中溴化反應(yīng)用溴的氯化溶劑中進行，該氯化溶劑選自CCl4、CHCl3、ClCH2CH2Cl和CH2Cl2。23.化學(xué)式如下的一種化合物，其中R選自R1＝OHR2＝HR1＝OHR2＝HR1＝HR2＝OH和R1＝HR2＝OH24.一種藥物制劑，其中含有作為活性組分的一種或多種權(quán)利要求23的化合物或其可藥用的鹽，以及一種或多種可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。25.一種治療動物和人類腫瘤的方法，其中包括使需要治療的動物或人服用腫瘤敏感數(shù)量的一種或多種權(quán)利要求23化合物。26.權(quán)利要求25的方法，其中在所服用的化合物里，R1＝OHR2＝H27.權(quán)利要求24的方法，其中在所服用的化合物里，R1＝OHR2＝H28.權(quán)利要求24的方法，其中在所服用的化合物里，R1＝HR2＝OH29.權(quán)利要求24的方法，其中在所服用的化合物里，R1＝HR2＝OH30.一種制備以下化學(xué)式的化合物的方法，其中R選自R1＝OHR2＝HR1＝OHR2＝HR1＝HR2＝OH和R1＝HR2＝OH該方法包括在能將三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿的不飽和2″，3″側(cè)鏈部分選擇性氯化的條件下將三尖杉寧堿和/或7-表三尖杉寧堿氯化。31.權(quán)利要求30的方法，其中生成了非對映異構(gòu)體I、II、III和IV的混合物，該方法還包括從混合物中將各化合物I、II、III和IV分開。32.權(quán)利要求30的方法，其中三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿以任何數(shù)量存在于含有紫杉醇和其它紫杉烷環(huán)化合物的混合物中。33.權(quán)利要求32的方法，其中氯化反應(yīng)在約-20℃至20℃的溫度下進行。34.權(quán)利要求32的方法，其中氯化反應(yīng)在約-5℃至20℃的溫度下進行。35.權(quán)利要求32的方法，其中氯化反應(yīng)在暗處進行。36.權(quán)利要求32的方法，其中氯化反應(yīng)用相對于三尖杉寧堿和/或7-表-三尖杉寧堿濃度的化學(xué)計量數(shù)量的氯進行。37.權(quán)利要求32的方法，其中氯化反應(yīng)用氯在一種氯化溶劑中的溶液進行，該氯化溶劑選自CCl4、CHCl3、ClCH2CH2Cl和CH2Cl2。全文摘要本發(fā)明提供了新的紫杉醇類似物,特別是2″,3″側(cè)鏈鹵化的三尖杉寧堿,它們對于許多種腫瘤在體外和體內(nèi)都顯示出類似紫杉醇的強效力。文檔編號C07D305/14GK1190964SQ96193020公開日1998年8月19日申請日期1996年12月13日優(yōu)先權(quán)日1995年12月13日發(fā)明者R·C·潘迪,L·K·揚科夫,R·奈爾,A·保羅艾申請人:塞克化學(xué)有限公司