專利名稱：使用超臨界流體由原料制備紫杉醇的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含有紫杉醇及其衍生物的原料中萃取并純化它們的方法和設(shè)備。具體地說，這些方法和設(shè)備可用于從紅豆杉樹的針葉和其它部分中分離紫杉醇及其衍生物。
背景技術(shù)：
已在植物、微生物和海洋生物體的有機(jī)溶劑萃取物中分離并鑒定了許多在治療疾病中呈現(xiàn)治療活性的化合物。已證實(shí)具有特別好的生理活性的一些化合物已用作化療或抗HIV藥。然而，這些化合物的治療實(shí)用性的研究受到待篩選的天然源太多且常規(guī)萃取技術(shù)的效率低的阻礙。
這些有用化合物的實(shí)例包括得自長(zhǎng)春花的植物生物堿及其半合成物長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春新堿，以及紫杉醇(NSC 125973)，即一種得自短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)的二萜生物堿植物產(chǎn)品。紫杉醇紫杉醇是一類抑制真核生物有絲分裂的藥物。它促進(jìn)微管蛋白聚合并穩(wěn)定胞內(nèi)微管的結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生抗癌效果(參見，Schiff，P.B.等，Nature277，665-667(1979))。
在二十世紀(jì)六十年代，由美國(guó)國(guó)家癌協(xié)會(huì)(NCI)組織的植物篩選計(jì)劃使得發(fā)現(xiàn)了紫杉醇。在短葉紅豆杉樹(Taxus brevifolia)樹皮的粗提取物中首先發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞毒素活性之后，在1966年分離出了該活性化合物。在1967年將其命名為紫杉醇，并且其分子結(jié)構(gòu)于1971由Wani等表征(Wani，M.C.等，J.Am.Chem.Soc.，932325，1971)。Horwitzi等(1979)闡明了其活性機(jī)理(Horwitz，F(xiàn).B.等，Nature，1979，277，665和Eric K.Rowinsky等，J.National Can.Inst.，82，11247(1990))。根據(jù)NCI的報(bào)道，對(duì)常規(guī)抗癌藥都沒有反應(yīng)的卵巢癌、乳房癌或肺癌患者對(duì)紫杉醇的反應(yīng)率分別是30％、50％和20％(David，G.等，J.Nat.Prod.，53，1(1990))。
紫杉醇作為抗癌藥批準(zhǔn)銷售始于1992年，此時(shí)美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)和HPB(加拿大)許可使用紫杉醇治療卵巢癌。在1994年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)可以使用紫杉醇治療乳房癌和卡波濟(jì)氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)。接著，在1997年FDA批準(zhǔn)可以使用紫杉醇治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)并于1997年將紫杉醇擴(kuò)展用于早期乳房癌。此外，研究報(bào)告顯示紫杉醇對(duì)其它類型的癌癥具有優(yōu)異的效果(Spencer，C.M.和Faulds，D.，Drug.48，794-847(1994))。紫杉醇的常規(guī)制備常規(guī)萃取方法是以4個(gè)主要步驟進(jìn)行的。首先，將來自萃取操作的己烷∶丙酮混合物以70/30的己烷∶丙酮混合物比例，在硅酸鎂載體(Florisil)柱上以色譜分離含紫杉醇的餾分。然后將所述紫杉醇餾分濃縮至干。該步驟可以重復(fù)多至9次。其次，將紫杉醇濃縮物在甲醇∶水混合物中結(jié)晶，然后在丙酮∶己烷混合物中重結(jié)晶得到純度為85-95％的紫杉醇。第三，將所述紫杉醇在充有含2.5％異丙醇或2.5％正丁醇的二氯甲烷的硅膠色譜柱上色譜分離，獲得純度約為98％的紫杉醇。第四，將該紫杉醇溶于丙酮中，將溶液過濾，并在丙酮∶己烷混合物中將紫杉醇重結(jié)晶。這種有機(jī)相萃取和色譜純化法獲得純度為99％的紫杉醇，它約為粉碎樹皮的0.014％(J.Liquid Chromatography，12(11)2117-2132(1989)；WO 92/07842)。
通過該技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇受以下因素的制約(i)萃取和純化步驟耗時(shí)長(zhǎng)；(ii)在苛刻環(huán)境中停留的時(shí)間長(zhǎng)和(iii)綜合產(chǎn)量低。而且，短葉紅豆杉樹皮通常取自成齡樹(樹齡100-200年)。因此樹皮供應(yīng)受到限制。
為了克服這些問題已進(jìn)行了許多研究，并且提供了獲得紫杉醇的替代途徑。其中的一些途徑包括完全化學(xué)合成和細(xì)胞培養(yǎng)合成。在1994年報(bào)道了幾種完全化學(xué)合成法。然而，這些方法由于復(fù)雜而難以工業(yè)化。該問題源自紫杉醇具有幾個(gè)不對(duì)稱碳原子并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的事實(shí)。由于細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢并且細(xì)胞容易變?yōu)楹稚虼送ㄟ^細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇在工業(yè)化方面也遇到了一些困難(美國(guó)專利No.5,019,504，1991年5月28日公布)。
紅豆杉樹可以分為以下幾種穗花杉屬、澳洲杉屬(Austrotaxus)、三尖杉屬、白豆杉屬、紅豆杉屬、榧樹屬。其中，紅豆杉屬包括，例如短葉紅豆杉、歐洲紅豆杉、雜種紅豆杉、西藏紅豆杉、加拿大紅豆杉、東北紅豆杉等，它們通常被認(rèn)為是提取紫杉醇及其衍生物的合適物源。
紅豆杉樹，例如東北紅豆杉，在其針葉中具有高的紫杉醇含量，種植地域廣泛并且易于在農(nóng)場(chǎng)栽培。然而，這些樹具有高含量的蠟和非極性組分，使得難以從其中分離出紫杉醇。樹皮的有機(jī)溶劑萃取物中紫杉醇的總量為25％，但是雜質(zhì)含量非常高，為35-42％。為了容易地從東北紅豆杉中分離出紫杉醇，人們必需首先開發(fā)出選擇性除去例如蠟和葉綠素等物質(zhì)的技術(shù)。
本文中的術(shù)語“雜質(zhì)”是指除紫杉醇及其衍生物之外的得自植物萃取物中的所有組分。
已提出使用超臨界流體萃取紫杉醇以改善萃取。術(shù)語“超臨界流體”是指在其臨界壓力和其臨界溫度之上的流體。超臨界流體既有能夠滲透任何物質(zhì)的氣體性能，又有能夠?qū)⑽镔|(zhì)溶于其組分中的液體性能。此外，它具有通過調(diào)整系統(tǒng)壓力和溫度以連續(xù)方式很大程度地改變密度的優(yōu)點(diǎn)。該優(yōu)點(diǎn)與其溶解能力的簡(jiǎn)單控制有關(guān)。同樣地，使用超臨界流體作為食品工業(yè)和醫(yī)療用品領(lǐng)域的有機(jī)溶劑的代用品。
而且，超臨界流體不萃取葉綠素(M.T.Tena等AnalyticalChemistry，第69卷，第3期，521(1997))。尤其是，超臨界二氧化碳有益地從植物中萃取所需組分，但不萃取葉綠素。
韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?994-7829、1994-36099、1995-703845、1996-19486和1996-0055302描述了用超臨界二氧化碳從植物中萃取紫杉醇的方法。
具體地說，韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?994-7829公開了一種連續(xù)地分離和純化高純度的紫杉醇的方法和設(shè)備，其中以逆流方式實(shí)現(xiàn)超臨界流體萃取。該發(fā)明還使用了助溶劑。
韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?994-36099公開了在超臨界二氧化碳萃取之前使用正己烷除去非極性物質(zhì)。即，它提出了一種有機(jī)溶劑萃取和超臨界二氧化碳萃取結(jié)合的方法。
韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?995-703845是一種從觀賞植物紅豆杉的針葉中萃取紫杉醇的方法，包括步驟(a)通過使所述針葉被超臨界流體處理而脫蠟，(b)使所述脫蠟的針葉經(jīng)受超臨界流體和助溶劑，和(c)通過柱色譜法分離紫杉醇。然而，這種方法具有一些問題，例如脫蠟步驟中紫杉醇損失的危險(xiǎn)和所用助溶劑的不完全的萃取能力。
韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?996-55302和1996-19486公開了與上述方法類似的萃取方法。
因此，常規(guī)超臨界萃取技術(shù)對(duì)于紫杉醇的萃取不是最佳的。
在植物中紫杉醇通過弱化學(xué)鍵與細(xì)胞壁相連。根據(jù)所用溶劑的性能，可以部分地從植物中萃取出紫杉醇。超臨界二氧化碳使植物膨脹，這樣使得所需物質(zhì)易于被萃取，而其極性使得高極性和化學(xué)鍵連接的物質(zhì)(例如紫杉醇)的萃取難以進(jìn)行(M.D.Luque de Castro等AnalyticalSupercritical Fluid Extraction，Springer-Verlag，Berlin，第188頁(1994)、Y.Kim等J.Chromatographic Science，第37卷，457(1999))。
同樣，有機(jī)溶劑不能容易地滲透到植物中并且限制了其萃取紫杉醇的能力。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種制備紫杉醇及其衍生物的新方法，包括超臨界流體萃取步驟、有機(jī)溶劑萃取步驟和色譜步驟(例如多柱色譜步驟)。本發(fā)明通過在第一步采用對(duì)于萃取紫杉醇最佳的助溶劑，克服了常規(guī)超臨界流體萃取的局限性。
一方面，本發(fā)明特征在于一種從原料中分離紫杉醇或其衍生物的方法。該方法包括(a)用某種超臨界流體(例如超臨界二氧化碳)和助溶劑萃取原料獲得一萃取物；(b)用有機(jī)溶劑液-液分離所述萃取物得到一溶劑層；和c)通過柱色譜法從所述溶劑層中分離出紫杉醇或其衍生物。這些步驟可以連續(xù)或非連續(xù)方式進(jìn)行。超臨界流體與助溶劑的比例可以為75∶25-85∶15。
助溶劑用于從原料基質(zhì)中釋放紫杉醇及其衍生物。優(yōu)選所述助溶劑在其化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有羥基。例如，助溶劑可以是水與至少一種醇(例如甲醇或乙醇)的混合物。實(shí)例證明有包括水和醇，例如甲醇和乙醇的助溶劑?？梢酝瑫r(shí)使用至少一種助溶劑。優(yōu)選使用水和醇的混合物。水與醇的體積比優(yōu)選為30∶70-5∶95，并且更優(yōu)選為20∶80。而且，其它溶劑，例如醋酸和三乙胺，可以加入到所述助溶劑中，例如至1％(v/v)。醋酸使超臨界流體和助溶劑酸化，并且三乙胺使超臨界流體和助溶劑堿化。在下面的實(shí)施例1中進(jìn)一步描述了助溶劑的選擇標(biāo)準(zhǔn)。水與至少一種醇的體積比可以是30∶70-5∶95(例如20∶80)。
在本發(fā)明的步驟(a)中，超臨界流體的的優(yōu)選條件是溫度為60-100℃并且壓力為300-400bar。更優(yōu)選，溫度是75-85℃，壓力是330-370bar。最優(yōu)選選擇約80℃和約350bar。超臨界流體的流速優(yōu)選是30-50kg/hr。超臨界流體萃取步驟也可以在超臨界流體的溫度為75-85℃，壓力為330-370bar，流速為30-50kg/hr下進(jìn)行。
在步驟(b)中，有機(jī)溶劑的優(yōu)選實(shí)例包括正己烷。正己烷可以與步驟(a)的助溶劑(優(yōu)選醇)組合，然后與醇一起參與液-液分離。優(yōu)選正丁烷的加入量與助溶劑的加入量相當(dāng)。即，正己烷與助溶劑(優(yōu)選醇)的體積比是1∶1?？梢詫⒉襟E(b)重復(fù)1-3次。萃取和液-液分離步驟可以連續(xù)或非連續(xù)地進(jìn)行。
步驟(c)可以包括多柱色譜步驟。每個(gè)柱色譜步驟可以連續(xù)或非連續(xù)地進(jìn)行?？梢允褂玫臉渲膶?shí)例包括硅膠、RP-18、交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)和五氟苯基樹脂。多個(gè)柱各自包括一個(gè)柱樹脂。例如，可以使用硅膠、RP-18和交聯(lián)葡聚糖樹脂?？梢允褂冒ㄎ宸交鶚渲闹鳛槭褂枚鄠€(gè)柱時(shí)的最后柱。
在硅膠柱色譜法中，硅膠可以10倍萃取物重量的量使用，并且可以使用氯仿∶甲醇(例如1∶0→0∶1v/v)的階式梯度系統(tǒng)作為洗脫劑。優(yōu)選可以獲得含有紫杉醇及其衍生物的部分。選擇性地或另外，硅膠可以33倍施加到柱上的萃取物重量的量使用，并且可以用二氯甲烷∶甲醇(例如85∶15v/v)進(jìn)行洗脫。
RP-18樹脂的量可以是施加到柱上的萃取物重量的10倍，并且可以使用甲醇作為洗脫劑。含有漿果赤霉素III的部分可以從RP-18樹脂被洗脫出來。
交聯(lián)葡聚糖樹脂的量可以是施加到柱上的萃取物重量的65倍，并且可以使用甲醇作為洗脫劑。從交聯(lián)葡聚糖樹脂可以洗脫出三尖杉寧。
在交聯(lián)葡聚糖柱色譜法中，交聯(lián)葡聚糖樹脂可以65倍的萃取物重量的量使用，并且可以使用甲醇作為洗脫劑。優(yōu)選通過洗脫可以獲得含三尖杉寧的部分。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用于步驟(c)的最后柱可以包括五氟苯基樹脂。五氟苯基樹脂的量可以是施加到柱上的萃取物重量的133倍?？梢允褂靡译妗盟荻认到y(tǒng)作為洗脫劑。在色譜分離過程中乙腈含量可以從60％到90％變化(例如，在頭40分鐘從60％到80％變化，然后在另外的10分鐘內(nèi)進(jìn)一步增加到90％)。
該方法還可以包括將分離的紫杉醇及其衍生物重結(jié)晶(例如增加產(chǎn)品純度)。可以使用水∶乙醇(1∶1v/v)的溶液。
可用于本發(fā)明方法的原料是含紫杉醇或其衍生物的植物。最適宜的植物是紅豆杉屬種的，例如短葉紅豆杉、歐洲紅豆杉、雜種紅豆杉、西藏紅豆杉和加拿大紅豆杉、東北紅豆杉，但不限于此。在這些紅豆杉屬種中，特別優(yōu)選東北紅豆杉。同樣，可以從整株植物或者從單獨(dú)部分如木質(zhì)、莖、樹皮、根、葉(針葉)、種子或其混合物中提取紫杉醇及其衍生物。該物質(zhì)可以干燥。優(yōu)選使用樹皮或針葉。
本發(fā)明還有特征是一種從原料中分離紫杉醇及其衍生物的設(shè)備。所述設(shè)備包括超臨界流體的儲(chǔ)器、原料可以加入其中的萃取器、將超臨界流體與萃取混合物分離的分離容器、液-液分離器、和至少一個(gè)柱色譜器，都是聯(lián)機(jī)放置(例如都在單一生產(chǎn)線內(nèi))。所述設(shè)備還可以包括至少一個(gè)分離容器，它將超臨界流體與萃取混合物以連續(xù)形式分離。所述設(shè)備使除轉(zhuǎn)移到柱色譜中的溶劑之外的液-液分離器中所用的溶劑全部地回收并循環(huán)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述設(shè)備包括至少一個(gè)分離容器，它將超臨界流體與萃取混合物以連續(xù)的方式分離。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，設(shè)備使除轉(zhuǎn)移到柱色譜中的溶劑之外的液-液分離器中所用的溶劑全部地回收并循環(huán)。這種設(shè)備的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式描述于

圖1中，它舉例說明了在液-液分離器中正己烷和醇混合物的應(yīng)用。
通過本發(fā)明獲得了以下有益效果。
通過將超臨界流體萃取和有機(jī)溶劑分離組合本發(fā)明可以提供一種簡(jiǎn)單地萃取和分離紫杉醇及其衍生物的方法，并且可以避免常規(guī)紫杉醇提取方法中的復(fù)雜的萃取步驟。
從以下兩個(gè)方面本發(fā)明可以提供一些紫杉醇萃取用的最佳助溶劑(i)溶解紫杉醇及其衍生物的能力和(ii)從原料基質(zhì)釋放紫杉醇及其衍生物的能力。結(jié)果，本發(fā)明提供了一種效率提高的紫杉醇的萃取方法。
本發(fā)明還提供了改善萃取紫杉醇的超臨界流體與助溶劑之間的特定條件。而且，本發(fā)明描述了一種顯示萃取期間助溶劑作用機(jī)理的纖維素紙-紫杉醇模型。本發(fā)明人由該模型推斷，水可用作助溶劑。試驗(yàn)結(jié)果顯示，水和醇的助溶劑混合物增加了萃取產(chǎn)量，從而支持了水可用作助溶劑的結(jié)論(參見本文后面的實(shí)施例)。
本發(fā)明方法的紫杉醇的產(chǎn)量比常規(guī)甲醇萃取方法的增加2倍。與甲醇萃取法相比，與萃取物中所含紫杉醇的絕對(duì)量有關(guān)的“萃取選擇性”增加5.5倍。
本發(fā)明還提供了一種包括5個(gè)柱的色譜裝置，這使得與常規(guī)方法相比簡(jiǎn)化了純化。同樣，所用的所有這些樹脂被證實(shí)是可循環(huán)利用的。
附圖簡(jiǎn)述圖是根據(jù)本發(fā)明制備紫杉醇及其衍生物的設(shè)備的示意圖。該設(shè)備使得都超臨界流體萃取步驟、有機(jī)溶劑分離步驟和柱色譜步驟都聯(lián)機(jī)實(shí)施。
圖2是本發(fā)明的超臨界流體萃取設(shè)備的示意圖。
圖3是描述從紅豆杉葉萃取的紫杉醇產(chǎn)量的圖。紫杉醇產(chǎn)量取決于水-甲醇或水-乙醇的助溶劑混合物的組成比。
圖4是描述從紅豆杉葉萃取的紫杉醇產(chǎn)量的圖。紫杉醇產(chǎn)量取決于水-甲醇或水-乙醇的助溶劑混合物的組成比。
圖5是描述來自所用超臨界流體和助溶劑是超臨界二氧化碳∶乙醇∶水(體積比為80∶16∶4)并且在超臨界流體的溫度為80℃，壓力為350bar且流速為40kg/hr的條件下進(jìn)行萃取的試驗(yàn)的紫杉醇萃取產(chǎn)量的圖。使用東北紅豆杉作為原料。
圖6是描述得自所用超臨界流體和助溶劑是超臨界二氧化碳∶乙醇∶水(80∶16∶4 v/v/v)的試驗(yàn)的萃取產(chǎn)量的圖。在超臨界流體的溫度為80℃、壓力為350bar且流速為40kg/hr的條件下進(jìn)行試驗(yàn)。使用東北紅豆杉作為原料。
圖7是得自紅豆杉葉的紫杉醇萃取物的高效液相色譜(HPLC)。圖7(a)是從甲醇萃取獲得的HPLC色譜并且圖7(b)是從超臨界流體萃取獲得的HPLC色譜。
圖8顯示了經(jīng)過超臨界流體萃取和柱純化的萃取物的HPLC。圖8(a)顯示了得自RP-18樹脂柱色譜的結(jié)果。圖8(b)顯示了最終獲得的紫杉醇的HPLC分析。
圖中每一數(shù)字代表以下設(shè)備10二氧化碳汽缸 11二氧化碳增壓泵12CO2加料/排放閥 13CO2/助溶劑混合器14主要溶劑加料/排放閥20助溶劑瓶21助溶劑增壓泵 22助溶劑加料/排放閥30歧管 31排氣閥40等溫萃取器 41萃取室50等溫限定器箱51限定器 60收集箱61收集小瓶 100二氧化碳儲(chǔ)器
110二氧化碳增壓泵120冷卻CO2的熱交換器130加熱CO2的熱交換器 140液化CO2的熱交換器200助溶劑混合儲(chǔ)器210助溶劑增壓泵220助溶劑的熱交換器 300萃取器301背壓調(diào)節(jié)器400第一分離容器401液相控制閥402背壓調(diào)節(jié)器410加熱/冷卻用的熱交換器 500第二分離容器501液相控制閥502背壓調(diào)節(jié)器510壓迫CO2的增壓器600醇儲(chǔ)器610醇蒸發(fā)器 620醇循環(huán)泵630冷卻用熱交換器700己烷儲(chǔ)器710己烷蒸發(fā)器720己烷循環(huán)泵730冷卻用熱交換器800醇與己烷的混合器810液-液分離器 820濃縮器900多柱色譜裝置發(fā)明詳述下面參照附圖詳細(xì)地描述本發(fā)明制備紫杉醇及其衍生物的方法。
本發(fā)明方法的實(shí)施方式可以用圖1和2所述的超臨界流體萃取設(shè)備進(jìn)行。對(duì)大批量原料而言，可以將圖1的設(shè)備用于步驟(a)。圖2的設(shè)備可用于處理少量的原料。
即使在圖1和2的設(shè)備中都描述了使用超臨界CO2作為超臨界流體，但是應(yīng)認(rèn)為并理解的是，這僅僅是為了方便描述起見，本發(fā)明的超臨界流體并不限于CO2。
參照?qǐng)D2詳細(xì)描述本發(fā)明。圖2中所述的設(shè)備的一個(gè)實(shí)例是703型超臨界流體萃取器(DIONEX，美國(guó))。這種設(shè)備用于本文并且包括CO2增壓器、助溶劑混合器和增壓器、等溫萃取器、等溫限定器箱和收集箱。
該設(shè)備可以如下方式操作將萃取室41充滿干燥且磨碎的原料，例如干燥且磨碎的紅豆杉樹針葉。將二氧化碳從CO2汽缸10轉(zhuǎn)移到CO2增壓泵11，然后在其中加壓。為了便于增壓泵操作可以使用液體CO2。助溶劑瓶20預(yù)先充滿一種助溶劑或者以特定比含有兩種溶劑的混合物。用助溶劑增壓泵22將助溶劑加壓至所需壓力。當(dāng)將CO2和助溶劑加壓至所需壓力時(shí)，打開閥12和22以便所述CO2和助溶劑可以流入混合器13。閥12和22分別控制所述CO2和助溶劑的移動(dòng)，并且混合器13將CO2與助溶劑混合?；旌现?，通過閥14和歧管30將CO2和助溶劑從混合器13轉(zhuǎn)移到萃取室41。閥14用作控制CO2和助溶劑移動(dòng)的開關(guān)。在加入CO2和助溶劑之前，憑借等溫萃取器40將萃取室41和歧管30調(diào)定并保持在恒定溫度。在通過歧管30時(shí)CO2和助溶劑保持在一恒定溫度。接著，在萃取器41中，隨著CO2和助溶劑的進(jìn)入開始原料的萃取。萃取期間，通過增壓泵11和21將CO2和助溶劑的流速保持恒定，同時(shí)通過儲(chǔ)器51控制流速最高值。在萃取室41中萃取之后，通過儲(chǔ)器51將所得含有CO2和助溶劑的萃取物轉(zhuǎn)移到收集箱60。此時(shí)，萃取物經(jīng)受可以使溫度降低的壓力降。這種溫度降低能夠?qū)е聝?chǔ)器51堵塞。然而，等溫限定器箱50防止了溫度降低和儲(chǔ)器51的堵塞。
通過儲(chǔ)器51的萃取物經(jīng)受壓力降，由此CO2蒸發(fā)并以氣體排出。將剩余助溶劑和萃取物收集到收集小瓶61中。
收集小瓶61中的助溶劑和萃取物經(jīng)受真空蒸發(fā)以除去所有溶劑組分。獲得含有紫杉醇的萃取物，將其溶于少量甲醇中并進(jìn)行定量分析用的HPLC分析。在此之前，可以將紅豆杉的甲醇萃取物通過一過濾器，如沃特斯(Waters)(美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德市)的C18sep-pak過濾，以便提高定量分析的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明人用于本試驗(yàn)的HPLC系統(tǒng)是HP-1090M，可從惠普公司(美國(guó))獲得，其中包括一個(gè)可在228nm下定量檢測(cè)紫杉醇的紫外線檢測(cè)器，和一個(gè)與Curosil PFP(30×4.6mm，Phenomenex公司，美國(guó)加州托蘭斯市)保護(hù)柱固定在一起的Curosil PFP HPLC柱(250×4.6mm，5μm)。所述Curosil PFP HPLC柱僅用于紫杉醇分析。所用的含有乙腈和水的移動(dòng)相以梯度方式變化，其中在頭40分鐘乙腈的體積比從早先的25％增加到65％，接著在其后的10分鐘內(nèi)增加到80％。
用作標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇及其衍生物從Sigma-Aldrich(美國(guó)密蘇里州圣路易斯市)獲得，它們是半合成紫杉醇(semi-synthetic paclitaxel)(非細(xì)胞培養(yǎng))(Taxol)、漿果赤霉素III、得自歐洲紅豆杉的10-去乙酰基-漿果赤霉素III、9-二氫-13-乙?；鶟{果赤霉素III)和三尖杉寧(cephalomannine)。
所用HPLC級(jí)洗脫劑包括甲醇、氯仿、正己烷、乙腈和去離子水；所有這些都得自J.T Baker(美國(guó)新澤西州Philipsburg市)。也使用試劑級(jí)洗脫劑如得自DAI-JUNG Chemical Co.(韓國(guó)仁川)的甲醇、氯仿和二氯甲烷。
在步驟(a)中，CO2與助溶劑的優(yōu)選比例是70∶30-90∶10。當(dāng)使用醇和水的混合物作為助溶劑時(shí)，醇占最小50％-最大100％v/v。所述醇涉及控制超臨界二氧化碳的極性并且水負(fù)責(zé)破壞紫杉醇與植物的弱化學(xué)鍵。
為了處理大批量的原料，可以將圖1的超臨界CO2萃取設(shè)備用于本發(fā)明的方法中。
本發(fā)明也可以用圖1的設(shè)備如下所述進(jìn)行。步驟(a)將填充有原料的吊籃插入萃取器300中，迫使儲(chǔ)器100中所盛的液體CO2流過熱交換器120。儲(chǔ)器100中的CO2以液體存在。熱交換器120將CO2冷卻以便CO2可以保持為液態(tài)。憑借熱交換器120的這種作用，可以避免CO2增壓泵110產(chǎn)生氣穴現(xiàn)象，盡管CO2可能發(fā)生的蒸發(fā)也能導(dǎo)致該現(xiàn)象的發(fā)生。接下來通過增壓泵將CO2壓縮并通過熱交換器130加熱CO2來使之發(fā)生相轉(zhuǎn)變而成為超臨界流體狀態(tài)。在第一階段，連續(xù)地將CO2加入到萃取器300中直到萃取器300中的CO2的壓力與儲(chǔ)器100中的相同。萃取器300中的CO2的壓力也通過背壓調(diào)節(jié)器301控制。當(dāng)CO2向萃取器300中的加入結(jié)束時(shí)，CO2增壓泵110開始操作并升高CO2的壓力。與此操作的同時(shí)，儲(chǔ)器210中的助溶劑(或以某一比例混合的助溶劑)通過增壓器210增壓。壓力升高的助溶劑經(jīng)過熱交換器220(用作助溶劑的加熱器)加熱至所需萃取溫度。助溶劑然后與超臨界CO2一起流入萃取器300。在萃取器300的溫度和壓力調(diào)整至所需條件之后開始原料的萃取。萃取器300中的壓力通過背壓調(diào)節(jié)器301加以控制。當(dāng)超臨界流體和助溶劑通過萃取器300時(shí)，其流速分別受增壓泵110和210的調(diào)節(jié)。從萃取器300出來的超臨界流體和助溶劑將含有從原料中萃取的紫杉醇及其衍生物，然后將它們流入第一分離容器400。第一分離容器400選擇性地蒸發(fā)含有紫杉醇及其衍生物的流體和助溶劑的混合物中的超臨界流體。將存在的CO2氣體回收到儲(chǔ)器100中。背壓調(diào)節(jié)器403控制第一分離容器400中的CO2的壓力以迫使CO2氣體送到儲(chǔ)器100。在回收操作期間，熱交換器140將CO2氣體轉(zhuǎn)變成液體CO2。在第一分離容器400中，連續(xù)地收集溶解有紫杉醇及其衍生物(即萃取物)的剩余CO2和助溶劑直到它們達(dá)到一定的液面。然后通過熱交換器410和控制閥401迫使這些萃取物移入第二分離容器500中?？刂崎y401調(diào)節(jié)第一分離容器400中液面。熱交換器410將萃取物的溫度控制為恒定，在這種情況下助溶劑不應(yīng)被蒸發(fā)。
第二分離容器500將液體CO2完全蒸發(fā)并且蒸發(fā)的CO2回收到儲(chǔ)器100用于循環(huán)。背壓調(diào)節(jié)器502控制第二分離容器500的壓力。從第二分離容器出來的蒸發(fā)的CO2通過增壓器510加壓，然后與來自第一分離容器的CO2一起經(jīng)過熱交換器140回收到儲(chǔ)器100中。
第二分離容器中的液面受控制閥501的控制。如果萃取物(即，來自原料的助溶劑和紫杉醇萃取物)達(dá)到一定液位時(shí)，液位之上的萃取物被收集到醇蒸發(fā)器610中。這種收集步驟是連續(xù)進(jìn)行的。
在完成步驟(a)的操作之后，將留在萃取器300以及第一和第二分離容器400和500中的CO2通過背壓調(diào)節(jié)器502和增壓器510回收。完成超臨界流體萃取步驟之后，留在醇儲(chǔ)器600中的萃取物(若有的話)用醇循環(huán)泵602(圖中未顯示)供應(yīng)的醇洗滌。將洗滌物收集到醇儲(chǔ)器610中。洗滌操作之后，分離容器中的剩余的CO2必需如上所述回收。
該設(shè)備的特征在于超臨界流體(例如CO2)循環(huán)。該設(shè)備的特征還在于使用控制閥調(diào)節(jié)分離容器的液面(例如400和500)。閥與背壓調(diào)節(jié)器(例如402和502)合作用于降低分離容器的總含量。背壓調(diào)節(jié)器可以解決分離容器的容量有限的問題。步驟(b)該步驟是以助溶劑和含紫杉醇(或者含紫杉醇衍生物)的萃取物的混合物開始的。它可以與步驟(a)同時(shí)進(jìn)行。步驟(b)的作用是通過液-液分離從混合物中除去雜質(zhì)以減少經(jīng)受步驟(c)的混合物的量。優(yōu)選可以將正己烷和醇的混合物用于液-液分離。在下面，步驟(b)描述了使用正己烷和醇的混合物作為有機(jī)溶劑。
從步驟(a)轉(zhuǎn)移到步驟(b)的含紫杉醇的萃取物的重量為原料的7％(w/w)，并且以萃取物重量為基礎(chǔ)計(jì)，萃取物中紫杉醇的含量是0.55％。
紫杉醇含量(％w/w)與“萃取選擇性”有關(guān)。術(shù)語“萃取選擇性”顯示了從超臨界流體(或有機(jī)溶劑)萃取步驟獲得的萃取物中所含的紫杉醇的絕對(duì)量。假如在任何原料中的紫杉醇的含量相同并且其中所含的所有紫杉醇都能夠萃取，萃取物的量越大，萃取選擇性的越低。同樣，較少量的萃取物就意味著較高的萃取選擇性。即，概念“萃取選擇性”與除去的雜質(zhì)量相反。當(dāng)萃取物經(jīng)受柱色譜時(shí)，較高的萃取選擇性更有益于節(jié)約使用樹脂。較高的萃取選擇性需要使用少量的樹脂。
為了提高本文的萃取選擇性，將步驟(b)用于本發(fā)明。優(yōu)選將正己烷與醇一起使用以提高這一步的選擇性。
在步驟(b)中，醇儲(chǔ)器600、醇蒸發(fā)器610、己烷儲(chǔ)器700、己烷蒸發(fā)器710、醇/己烷混合器800(包括一攪拌器)、液-液分離器810(在醇層和己烷層之間將萃取物分開)和濃縮器820。濃縮器820將含紫杉醇的萃取物和助溶劑的混合物蒸發(fā)并濃縮。
步驟(b)是由來自洗滌醇儲(chǔ)器600的醇洗滌物開始的，如上所述，除了所述混合物之外。醇蒸發(fā)器610保持在助溶劑和醇可以蒸發(fā)的溫度之上。醇循環(huán)泵620將液體甲醇加入到蒸發(fā)器中以將這些溶劑濃縮。將濃縮物以1-5升的量轉(zhuǎn)移到醇/己烷混合器800中。蒸發(fā)的物料從醇蒸發(fā)器610的上面溢出，通過熱交換器630冷凝并流入醇儲(chǔ)器中。該步驟可以重復(fù)1次或2次以便完全除去可能仍然留在蒸發(fā)器610和轉(zhuǎn)移路徑中的所有萃取的組分。
接下來，將正己烷從己烷儲(chǔ)器700加入混合器800中的含萃取物的醇中。在己烷循環(huán)泵720的控制下以與醇的流量相同的量進(jìn)行正己烷的加入?；旌掀?00包括攪拌器，這促使醇與正己烷充分接觸?；旌系慕Y(jié)果使得可溶于己烷的物質(zhì)如蠟從醇中移到己烷中。然后將所有混合物轉(zhuǎn)移到液-液分離器810中并在醇和己烷層之間分開。接著將己烷層轉(zhuǎn)移到己烷蒸發(fā)器710，同時(shí)將醇層轉(zhuǎn)移到冷凝器820?；蛘撸?液分離器810中的醇可以被再次送回混合器800以再次進(jìn)行己烷萃取(圖中未顯示)。該步驟可以重復(fù)1次或2次。
己烷蒸發(fā)器710的操作與上面所述的醇蒸發(fā)器610的操作相似。己烷蒸發(fā)之后的剩余萃取物(若有的話)可以單獨(dú)貯存，然后進(jìn)行活性組分的分離。
加入到濃縮器820中的醇層經(jīng)受醇蒸發(fā)。將蒸發(fā)的醇回收到醇儲(chǔ)器600(圖中未顯示)。將濃縮的層層轉(zhuǎn)移到步驟(c)。
步驟(b)的特征是簡(jiǎn)單且顯著地減少了接下來經(jīng)受柱色譜步驟(c)的萃取物中雜質(zhì)的量。通過柱色譜技術(shù)純化通常需要大量溶劑和長(zhǎng)的操作時(shí)間。為了避免這些問題，正如本發(fā)明中的，減少待處理的物料量是非常重要的。
根據(jù)本發(fā)明，在步驟(a)中原料的重量減少約30％。從步驟(a)獲得的萃取物的量是原料的約5-7％(w/w)。與此同時(shí)，紫杉醇含量從原料中的約0.55％增加到萃取物中的0.82％。在萃取選擇性方面也獲得約30％的增加。
由步驟(a)和(b)的組合獲得的萃取物的重量為原料的約3.5％-5％(w/w)。當(dāng)進(jìn)行常規(guī)甲醇萃取時(shí)，萃取物的重量通常為原料的約15％(w/w)。因此，本發(fā)明的萃取選擇性比常規(guī)甲醇萃取的高約3-4.2倍。常規(guī)有機(jī)溶劑萃取，例如甲醇萃取，存在的缺陷是除了所需物質(zhì)之外有大量通過有機(jī)溶劑從原料萃取的葉綠素。因此，如果將本發(fā)明的己烷分離步驟用于常規(guī)有機(jī)溶劑萃取，需要大量的己烷。本發(fā)明通過使用步驟(b)避免了這種問題。步驟(c)用于步驟(c)的多柱色譜裝置可以包括至少2種柱樹脂(例如2、3、4或更多的柱樹脂)。優(yōu)選步驟(c)可以分成5個(gè)純化過程。
優(yōu)選用于每一柱的樹脂可以包括硅膠G(Typ 60，TLC；Merck公司，德國(guó)達(dá)姆施塔特市)、RP-18(40-63μm；Pharmacia Biotech公司，瑞典烏普薩拉市)、交聯(lián)葡聚糖LH-20(Pharmacia Biotech公司，瑞典烏普薩拉市)、LiChroprep Si 60(40-63μm Merck公司)、LiChroprep RP-18(Merck公司)和Curosil-PFP(五氟苯基)(Phenomenex公司，美國(guó)加州托蘭斯市)。
步驟(c)的操作的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例描述如下(1)第一次純化硅膠柱色譜得自步驟(b)的所得萃取物(優(yōu)選濃縮的醇層)經(jīng)過硅膠柱色譜。硅膠可以萃取物重量的10倍的量使用(例如，10g/1g萃取物)。所用移動(dòng)相可以是氯仿∶甲醇(1∶0→0∶1v/v)階式梯度系統(tǒng)。洗脫劑可以5ml/g萃取物分餾。移動(dòng)相在餾分25從100％氯仿到100％甲醇變化。紫杉醇及其衍生物可以在餾分45-52獲得。
術(shù)語“階式梯度”是指一移動(dòng)相在某一點(diǎn)，而不是連續(xù)地迅速被另一移動(dòng)相代替的梯度系統(tǒng)。氯仿∶甲醇(1∶0→0∶1(v/v))的階式梯度是指在所需時(shí)間點(diǎn)或者所需量的洗脫劑通過時(shí)作為移動(dòng)相的100％氯仿用100％甲醇替代。
(2)第2次純化RP-18柱色譜來自上面第一次純化的所得物可以經(jīng)過RP-18柱色譜。樹脂可以所用樣品重量的10倍的量填充到柱中(例如10g/1g所用樣品)。所用移動(dòng)相是甲醇。所得洗脫劑可以2ml/1g所用樣品分餾。紫杉醇及其衍生物可以在餾分7-10獲得。
(3)第3次純化硅膠柱色譜這里可以使用填充有硅膠(40-63μm)的LiChroprep Si 60柱，并且樹脂可以所用樣品重量的33倍的量使用(例如33g/1g所用樣品)?？梢允褂枚燃淄椤眉状?85∶15v/v)溶液作為移動(dòng)相。所得洗脫劑可以33ml/1g所用樣品分餾。在餾分7-10中檢測(cè)紫杉醇及其衍生物。
(4)第4次純化交聯(lián)葡聚糖LH-20色譜交聯(lián)葡聚糖LH-20以所用樣品重量的55倍的量填充(例如55g/1g所用樣品)。所得洗脫劑分餾成120ml甲醇/1g加入的物料。在餾分15-18檢測(cè)紫杉醇及其衍生物。
(5)第5次純化LH-20色譜使用Curosil PFP柱。樹脂以待處理的樣品重量的133倍的量使用(例如133g/1g所用樣品)。作為移動(dòng)相，使用乙腈-水梯度系統(tǒng)，其中在40分鐘內(nèi)乙腈含量從60％到80％變化，然后在另外10分鐘內(nèi)增加至90％。停留14.0分鐘后可以得到紫杉醇及其衍生物。
以與上述相同的方式進(jìn)行下面的實(shí)施例9。
本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)一步地描述，但不打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)一步地描述，但是這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例這些實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例中所用的原料是東北紅豆杉的葉、莖和根，該東北紅豆杉取自韓國(guó)藥學(xué)院醫(yī)用草藥園(Medicinal Herb Garden，College of Pharmacy，Ilsan，Kyungi-Do，Korea)。
將東北紅豆杉的葉、莖和根在真空干燥爐中于50℃下干燥72小時(shí)，然后用研磨器研磨至低于0.7mm的大小。將所得物料用作比較本發(fā)明效果用的以下實(shí)施例和有機(jī)溶劑萃取中的原料。為了精確比較，將隨機(jī)選擇物料。
東北紅豆杉的紫杉醇含量比短葉紅豆杉的樹皮(紫杉醇的現(xiàn)有原料，正如人們從使用常規(guī)有機(jī)溶劑萃取的以下對(duì)比實(shí)施例中可以看到的)中的紫杉醇含量高2-4倍。對(duì)比實(shí)施例使用有機(jī)溶劑萃取的紫杉醇及其衍生物的量為了比較本發(fā)明和常規(guī)有機(jī)溶劑萃取技術(shù)中獲得的紫杉醇及其衍生物的量，進(jìn)行了本試驗(yàn)。
測(cè)定通過甲醇萃取的從東北紅豆杉的葉、莖和根獲得的紫杉醇及其衍生物的量。所用原料與下面給出的實(shí)施例中的相同。將原料加入到甲醇(100ml)中，在超聲波下萃取3小時(shí)，然后在減壓下濃縮。將濃縮的萃取物再溶于1ml甲醇中。將所得溶液回到Sep-pak(預(yù)先分別用10ml甲醇、水及其混合物(甲醇∶水＝55∶45v/v)洗滌過)。該Sep-pak用2ml的甲醇∶水(55∶45，v/v)、6ml的甲醇∶水(80∶20，v/v)和2ml的甲醇洗提。在減壓下將混合的6ml甲醇∶水(80∶20，v/v)餾分濃縮，然后再溶于1ml甲醇中。為了便于高壓液相色譜(HPLC)分析，將溶解的部分通過直徑為13mm且孔徑為0.45μm的PVDF膜過濾器(美國(guó)威斯康星州Lida Kenosha市)過濾。濾液用作HPLC分析的樣品以測(cè)定樣品中紫杉醇及其衍生物的含量。結(jié)果，在東北紅豆杉中，葉中有0.048％(0.48mg/g)的紫杉醇，莖中有0.013％(0.13mg/g)，根中有0.019％(0.19mg/g)。實(shí)施例1-助溶劑類型對(duì)紫杉醇在超臨界二氧化碳-助溶劑中的溶解度的影響本實(shí)施例涉及能夠提高紫杉醇溶解度的助溶劑的選擇。
與甲醇、乙醇、水、或助溶劑的組合和1％(v)輔助溶劑如醋酸或三乙胺一起在超臨界CO2中測(cè)定紫杉醇的溶解度。醋酸使超臨界CO2和助溶劑酸化，并且三乙胺使超臨界CO2和助溶劑堿化。結(jié)果示于下表1。
表1紫杉醇在超臨界CO2、助溶劑或它們二者中于80℃、350bar下的溶解度(溶解度＝紫杉醇的重量/CO2的體積，μg/ml)。 如表1所示，與僅在CO2中的紫杉醇溶解度比較(注意在80℃和350bar的壓力下從純超臨界流體萃取獲得13μg/ml的紫杉醇溶解度)，當(dāng)與這些助溶劑(1％，v/v)混合時(shí)，無論助溶劑的類型如何，在超臨界CO2中的紫杉醇的溶解度降低。然而，當(dāng)除水或水與其它溶劑的混合物之外的大于5％(v/v)的助溶劑加入到超臨界CO2的情況下紫杉醇的溶解度增加至少3倍。特別是，甲醇比乙醇和水呈現(xiàn)更好的提高紫杉醇溶解度的能力。同樣，當(dāng)使用10％(v/v)甲醇時(shí)，溶解度最高，即，比純CO2中的溶解度高25倍。據(jù)信甲醇增加紫杉醇溶解度是由于甲醇足夠溶解紫杉醇的良好能力引起的。
而且，紫杉醇在超臨界CO2和甲醇的組合系統(tǒng)中的溶解度與加入的甲醇的體積比成比例地增加。同樣，乙醇也增加紫杉醇的溶解度。因此，以上面的結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇醇組分作為本發(fā)明的主要助溶劑。
水不以加入的水的量成比例地增加紫杉醇的溶解度。與使用純超臨界CO2相比其溶解度略有降低。實(shí)施例2-原料基質(zhì)對(duì)紫杉醇萃取和助溶劑的選擇的影響除了萃取溶劑的溶解能力之外，認(rèn)為紫杉醇天然存在的基質(zhì)環(huán)境影響紫杉醇萃取的效率。必需打破紫杉醇與原料基質(zhì)的相互作用(如果存在的話)。為此，在萃取步驟中可以使用合適的助溶劑。如果在用超臨界CO2萃取原料之前通過這些助溶劑從原料基質(zhì)中將紫杉醇釋放，那么可以提高萃取效率。
實(shí)施例2涉及適用于避免基質(zhì)對(duì)紫杉醇萃取和從基質(zhì)中釋放紫杉醇及其衍生物的可能影響的助溶劑的選擇。
為此，設(shè)計(jì)一纖維素紙-紫杉醇模型。如果紫杉醇與纖維素紙不相互作用，那么可以僅以溶解紫杉醇及其衍生物的能力為基礎(chǔ)選擇助溶劑。然而，如果紫杉醇與纖維素紙相互作用，可以其破壞紫杉醇和纖維素紙的相互作用的能力及其溶解能力選擇助溶劑。
將紫杉醇吸收到纖維素紙中并用純超臨界CO2或超臨界CO2與各種助溶劑的組合萃取。測(cè)定紫杉醇的吸收回收率并示于下表2。
研究了紅豆杉樹基質(zhì)對(duì)超臨界流體中的紫杉醇萃取效率的影響。首先，將1g過濾紙片(Advantec No.2，Toyo株式會(huì)社，日本東京)切割成1.0cm大小，并放入一燒杯中。然后，向燒杯中加入給定量的紫杉醇的甲醇溶液(0.2mg/ml)并在真空爐中干燥24小時(shí)以用于本試驗(yàn)。萃取體積是溫度為80℃并且壓力為350bar。而且，超臨界CO2的流速是40kg/hr，限定器50的溫度是160℃。甲醇、乙醇或水以1-10％體積作為助溶劑使用。此外，制備包括比例分別為2∶8、5∶5和8∶2(v/v)的水-甲醇或水-乙醇的助溶劑混合物并以20％體積加入到超臨界CO2中以用于本試驗(yàn)。
根據(jù)上述方法，測(cè)定純CO2的紫杉醇的百分比吸收回收率(％)為0.46％wt。
術(shù)語“百分比吸收回收率”是指以過濾紙片上吸收的紫杉醇的重量為基礎(chǔ)從超臨界萃取獲得的紫杉醇的重量分?jǐn)?shù)。例如，如果在過濾紙片上吸收1mg紫杉醇并且萃取的紫杉醇的重量是0.5mg，那么百分比吸收回收率是50％。
表2
在80℃的溫度和350bar的壓力下以向超臨界CO2中不同地加入甲醇、乙醇和水為基礎(chǔ)的纖維素紙上吸收的紫杉醇的百分比吸收回收率
*百分比吸收回收率＝(在纖維素紙上吸收的紫杉醇的重量/通過萃取獲得的紫杉醇的重量)×100如表2所示，水最有效地將紫杉醇從纖維素紙中釋放。通常已知水不適宜用作超臨界流體萃取中的助溶劑。然而，表2中的數(shù)據(jù)說明，盡管水溶解紫杉醇的能力差，但是就紫杉醇和周圍基質(zhì)的相互作用而言水作為助溶劑可以提供益處。實(shí)施例3-使用純超臨界CO2的紫杉醇的百分比萃取回收率(％)將從東北紅豆杉中純超臨界CO2萃取(即，沒有如何助溶劑)紫杉醇與上面對(duì)比實(shí)施例中所述的甲醇萃取比較。在80℃和350bar的壓力下進(jìn)行超臨界CO2萃取以測(cè)定紫杉醇產(chǎn)量。發(fā)現(xiàn)在葉中有0.024％(0.24mg/g)紫杉醇，在莖中有0.0047％(0.13mg/g)，在根中有0.0022％(0.022mg/g)。
將上面的結(jié)果與上面的對(duì)比實(shí)施例的比較并顯示為下表3的百分比萃取回收率(即，用超臨界CO2獲得的紫杉醇的重量/1g用甲醇萃取獲得的紫杉醇)×100)。例如，如果用甲醇萃取獲得1mg紫杉醇并且萃取的紫杉醇的重量為0.5mg，那么百分比吸收回收率是50％。
表3與甲醇萃取相比在80℃的溫度和350bar的壓力下從東北紅豆杉的不同部分通過純超臨界CO2萃取的紫杉醇的百分比萃取回收率
*百分比萃取回收率＝(通過超臨界CO2萃取獲得的紫杉醇的重量/通過甲醇萃取獲得的紫杉醇的重量)×100如表3所示，通過純超臨界CO2萃取的回收率比通過對(duì)比實(shí)施例的甲醇萃取的低。實(shí)施例4-使用超臨界CO2-助溶劑從原料的百分比萃取回收率與常規(guī)有機(jī)溶劑萃取和純超臨界流體萃取比較，可以從實(shí)施例1-3的結(jié)果和發(fā)現(xiàn)推斷，使用助溶劑可以提高紫杉醇產(chǎn)量和超臨界流體萃取方法中的百分比萃取回收率(％)。
在實(shí)施例4中，測(cè)定紫杉醇在甲醇、乙醇和水作為助溶劑的超臨界CO2中的萃取效率并以百分比萃取回收率表示。所得數(shù)據(jù)示于下表4中。
表4在80℃的溫度和350bar的壓力下使用甲醇、乙醇和水作為助溶劑的不同超臨界CO2萃取中紫杉醇的百分比萃取回收率
*百分比萃取回收率＝(通過超臨界萃取獲得的紫杉醇的重量/通過甲醇萃取獲得的紫杉醇的重量)×100在萃取葉時(shí)，每種助溶劑以10％體積加入并且與上面實(shí)施例2中所述的常規(guī)甲醇萃取相比紫杉醇的百分比萃取回收率增加143％。尤其是加入1％體積的乙醇使得百分比萃取回收率增加110％。應(yīng)注意的是，這些試驗(yàn)中所有助溶劑都大大提高了紫杉醇的百分比萃取回收率，而上面實(shí)施例2的纖維素紙-紫杉醇模型顯示除水之外，沒有助溶劑呈現(xiàn)百分比萃取回收率增加40％或更多。就此而言，注意術(shù)語“百分比萃取回收率”與實(shí)施例2的“百分比吸收回收率”有關(guān)。因此，據(jù)信紫杉醇吸收到紅豆杉樹的周圍基質(zhì)上，但是并不以同樣強(qiáng)地吸收到實(shí)施例2中的纖維素紙上。因此，通過含羥基的溶劑(與超臨界CO2相比具有更強(qiáng)的離去力)可以大大提高萃取效率。
在上表4中，百分比萃取回收率的值為100％或更多，這意味著通過常規(guī)甲醇萃取沒有充分地從紅豆杉樹中將紫杉醇萃取出來。
在加入10％甲醇、乙醇或水的試驗(yàn)中測(cè)定莖的皮中的百分比萃取回收率大于100％。盡管在根中的超臨界流體萃取效率比葉和皮中的低，但是加入10％乙醇的百分比萃取回收率是100％。
與實(shí)施例3的純超臨界CO2相比，當(dāng)使用水作為助溶劑時(shí)，加入5％或10％水顯著地增加了回收率，而加入1％水略有降低。正如實(shí)施例3中解釋的，這顯然是由于水不增加紫杉醇在超臨界流體中的溶解度，但是在加速紫杉醇從周圍基質(zhì)的釋放以提高紫杉醇萃取產(chǎn)量方面發(fā)揮了作用。這可以對(duì)加入少量水(即，1％)為什么不能增加回收率提供了一定的解釋。即，少量水既不能增加紫杉醇的溶解度也不能影響紫杉醇從原料基質(zhì)的釋放。實(shí)施例5-通過超臨界CO2-助溶劑萃取的紫杉醇的萃取選擇性和百分比萃取選擇性在本實(shí)施例中，使用常規(guī)甲醇萃取和本發(fā)明的超臨界流體-助溶劑萃取測(cè)定紫杉醇相對(duì)其它雜質(zhì)的萃取選擇性。同樣，以所得的紫杉醇的萃取選擇性為基礎(chǔ)確定百分比萃取選擇性。
術(shù)語“萃取物”是指從包括紫杉醇的原料中萃取的所有組分。由于接下來的分離和純化步驟直接受到所得萃取物中紫杉醇的含量的影響，因此如果能夠不含其它雜質(zhì)地選擇性地萃取紫杉醇的話，這將是優(yōu)選的。
術(shù)語“萃取選擇性”定義為完成所有步驟之后最后獲得的紫杉醇的重量除以萃取物的總重量。萃取選擇性越高說明從萃取方法中獲得的萃取物中的紫杉醇的含量水平越高。
本發(fā)明中的術(shù)語“百分比萃取選擇性”定義如下百分比萃取選擇性＝(超臨界流體萃取的萃取選擇性)/(常規(guī)甲醇萃取的萃取選擇性)×100在本實(shí)施例中，在具有最好萃取產(chǎn)量的東北紅豆杉的部位，即葉中測(cè)定萃取選擇性，如實(shí)施例4的結(jié)果所示。將所得百分比萃取選擇性與對(duì)比實(shí)施例的甲醇萃取的進(jìn)行比較。結(jié)果示于下表5。
表5在80℃的溫度和350bar的壓力下超臨界CO2-助溶劑萃取時(shí)來自東北紅豆杉的葉的萃取物的萃取選擇性和百分比萃取選擇性
如表4所示，當(dāng)將甲醇、乙醇或水以10％體積加入到超臨界CO2中時(shí)，葉中紫杉醇的％萃取選擇性增加400-600％。這些數(shù)據(jù)說明，根據(jù)本發(fā)明，分離的紫杉醇的量比甲醇萃取中的線性地增加約4-6倍。實(shí)施例6-建立超臨界萃取條件的助溶劑組分比在本實(shí)施例中，當(dāng)使用水和醇作為助溶劑時(shí)，測(cè)定超臨界流體萃取的產(chǎn)量并將結(jié)果示于下表6。
表6根據(jù)助溶劑的不同組成在東北紅豆杉中萃取(80℃，350bar)的紫杉醇的產(chǎn)量
如表6所示，甲醇、乙醇或水比水和甲醇或乙醇的組合(1∶1v/v)使得萃取效率提高得更多。特別是當(dāng)以1∶1體積含有水和乙醇的助溶劑混合物以20％體積加入到CO2中時(shí)，與甲醇萃取相比萃取的紫杉醇含量增加150％或更多。實(shí)施例7-水與醇的組成比對(duì)通過超臨界流體萃取的萃取產(chǎn)量的影響當(dāng)使用水和醇的混合物作為助溶劑時(shí)，為了確定最佳配比，研究了水與醇的組成比與萃取產(chǎn)量的關(guān)系。將甲醇或乙醇用作本試驗(yàn)的醇。
水與甲醇或乙醇的混合比從2∶8增加到8∶2，并將每一混合助溶劑以20％體積加入到超臨界CO2中。然后測(cè)定紫杉醇產(chǎn)量的變化。結(jié)果示于圖3。如圖3所示，當(dāng)將水∶醇為2∶8的混合物以20％體積加入到超臨界CO2中時(shí)，獲得萃取的最高產(chǎn)量。
原料是東北紅豆杉的葉，采于1999年10月。用采于1998年8月的葉進(jìn)行另一與如上所述相似的試驗(yàn)。同樣，水∶醇以2∶8體積比的助溶劑混合物提供了最高產(chǎn)量。結(jié)果示于圖4。
實(shí)施例8-使用超臨界萃取法萃取紫杉醇用本發(fā)明的超臨界流體萃取法萃取紫杉醇。萃取條件確定如下超臨界CO2-乙醇-水＝80∶16∶4；超臨界流體的流速是40-80kg/hr；溫度為80℃且壓力為350bar。該條件是以上面實(shí)施例1-7的結(jié)果為基礎(chǔ)設(shè)定的。在總共6小時(shí)內(nèi)以20分鐘的間隔獲取測(cè)定產(chǎn)量用的樣品。
紫杉醇產(chǎn)量和萃取物產(chǎn)量分別示于圖5和6。如圖5和6所示，從萃取開始的1小時(shí)內(nèi)沒有萃取到紫杉醇。這是由于助溶劑與原料充分接觸需要一段時(shí)間并且超臨界CO2和助溶劑通過萃取器花費(fèi)一段時(shí)間。例如，如果超臨界流體以40kg/hr的流速通過萃取器，那么助溶劑從萃取器的底部通過到其上部花費(fèi)約10分鐘。而且，超臨界流體的流動(dòng)也受其角度的影響。液體的移動(dòng)可能受到與其方向垂直放置的任何障礙物的阻礙。實(shí)施例9-通過液-液分離增加超臨界流體萃取物的萃取選擇性在本實(shí)施例中，將己烷用于從超臨界流體萃取獲得的萃取物的液-液分離中。在液-液分離之前萃取物中的紫杉醇的含量是0.55％，在液-液分離之后增加到0.82％。這說明使用己烷通過液-液分離可以將除紫杉醇之外的33％的雜質(zhì)除去。實(shí)施例10-甲醇萃取物和超臨界流體萃取物的HPLC分析實(shí)施例9中經(jīng)過液-液分離的萃取物通過HPLC分析以測(cè)定紫杉醇及其衍生物的含量。其結(jié)果與甲醇萃取物的結(jié)果一起示于圖7。
如圖7所示，每一峰代表①紫杉醇峰、②三尖杉寧、③漿果赤霉素III和④10-二乙酰漿果赤霉素III。使用萃取物和標(biāo)準(zhǔn)樣品以混合物(每個(gè)量相等)采用共注射法進(jìn)行峰的鑒定。
在圖7和8中看到，與超臨界流體萃取物比較(圖7b)，在停留時(shí)間的早期甲醇萃取物(圖7a)產(chǎn)生許多雜質(zhì)峰，它們必需除去。這顯示根據(jù)本發(fā)明分離和純化步驟更簡(jiǎn)單。實(shí)施例11-使用色譜法制備紫杉醇及其衍生物在本實(shí)施例中，通過柱色譜法由實(shí)施例9的萃取物制備了純度高的紫杉醇。
首先，將萃取物經(jīng)過硅膠色譜。結(jié)果，萃取物中的紫杉醇的含量增加到1.58％。硅膠在用甲醇和氯仿洗滌之后可以重新使用。在第一次純化步驟中除去了規(guī)則結(jié)構(gòu)酸的峰。
接下來，使用RP-18樹脂對(duì)純化過的產(chǎn)物進(jìn)行第二次純化步驟。通過HPLC分析證實(shí)萃取物中紫杉醇含量增加至15％。HPLC分析的結(jié)果示于圖8a。RP-18樹脂在用異丙醇沖洗掉非極性物料并用甲醇洗滌之后可以重新使用。
使用硅膠柱將第二次純化過的產(chǎn)物再次經(jīng)過第三次純化步驟。結(jié)果，萃取物中的紫杉醇含量增加至43％，并且由HPLC分析顯示漿果赤霉素III的峰消失。因此，由這一步可以獲得漿果赤霉素III。通過與第一次純化步驟相似的過程可以使硅膠重新使用。
使用LH-20過濾器對(duì)第三次純化過的產(chǎn)物經(jīng)過第四次純化步驟。結(jié)果，紫杉醇含量增加至84％，并且停留時(shí)間與紫杉醇相近的三尖杉寧(cephaloman)被除去。
最后，使用RFP HPLC柱(Phenomenex公司)將第四次純化過的產(chǎn)物經(jīng)過第五次純化。所述純化過的產(chǎn)物用水∶甲醇(1∶1，v/v)重結(jié)晶得到純度為99％的紫杉醇。所得紫杉醇的HPLC分析示于圖8b。
正如前面所解釋的，根據(jù)本發(fā)明，可以制備高純度的紫杉醇并且獲得紫杉醇衍生物的餾分。
權(quán)利要求
1.一種從原料中分離紫杉醇或其衍生物的方法，所述方法包括(a)用超臨界流體和助溶劑萃取所述原料以獲得一萃取物；(b)用有機(jī)溶劑將所述萃取物液-液分離以獲得一溶劑層；和(c)通過柱色譜從所述溶劑層中分離出紫杉醇或其所述衍生物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述超臨界流體是超臨界二氧化碳。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述超臨界流體與所述助溶劑之比是75∶25-85∶15。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述助溶劑是水與至少一種醇的混合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種醇是甲醇或乙醇。
6.權(quán)利要求4的方法，其中水與至少一種醇的體積比是30∶70-5∶95。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述體積比是20∶80。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述超臨界流體萃取步驟是在60-100℃的溫度和300-400bar的壓力下進(jìn)行的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述溫度是80℃并且所述壓力是350bar。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述超臨界流體萃取步驟是所述超臨界流體的溫度為75-85℃、壓力為330-370bar且流速為30-50kg/hr下進(jìn)行的。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括正己烷。
12.權(quán)利要求11的方法，其中正己烷與所述助溶劑的體積比是1∶1并且所述所述液-液分離步驟進(jìn)行1-3次。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述萃取和所述液-液分離步驟是連續(xù)或非連續(xù)地進(jìn)行的。
14.權(quán)利要求1的方法，其中柱色譜包括使用多個(gè)柱分離紫杉醇或所述衍生物，其中所述多個(gè)柱各自包括一柱樹脂。
15.權(quán)利要求14的方法，其中柱色譜是連續(xù)或非連續(xù)地進(jìn)行的。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述柱樹脂包括硅膠、RP-18或交聯(lián)葡聚糖柱樹脂。
17.權(quán)利要求14的方法，其中含有五氟苯基樹脂的柱是所述多個(gè)柱的最后柱。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述硅膠樹脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的10倍并且使用氯仿∶甲醇的階式梯度系統(tǒng)作為洗脫劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中從所述硅膠樹脂洗脫紫杉醇和所述衍生物。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述RP-18樹脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的10倍，并且使用甲醇作為洗脫劑。
21.權(quán)利要求20的方法，其中由所述RP-18樹脂洗脫漿果赤霉素III。
22.權(quán)利要求16的方法，其中所述硅膠樹脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的33倍，并且其中使用二氯甲烷∶甲醇溶液作為洗脫劑。
23.權(quán)利要求16的方法，其中所述交聯(lián)葡聚糖樹脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的65倍，并且其中使用甲醇作為洗脫劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中從所述交聯(lián)葡聚糖樹脂洗脫三尖杉寧。
25.權(quán)利要求17的方法，其中所述五氟苯基樹脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的133倍，并且其中使用乙腈∶水梯度系統(tǒng)作為洗脫劑。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述乙腈含量從60％到90％變化。
27.權(quán)利要求14的方法，其中所述方法還包括將所述分離的紫杉醇及其衍生物重結(jié)晶。
28.一種從原料中分離紫杉醇及其衍生物的設(shè)備，所述設(shè)備包括超臨界流體的儲(chǔ)器、加入原料的萃取器、將超臨界流體與萃取混合物分離的分離容器、液-液分離器、和至少一種柱色譜儀，所有都聯(lián)機(jī)放置。
29.權(quán)利要求28的設(shè)備，包括至少一個(gè)分離容器，他將超臨界流體與萃取混合物以連續(xù)形式分離。
30.權(quán)利要求28的設(shè)備，除了轉(zhuǎn)移到柱色譜儀中的溶劑之外，使液-液分離器中所用的全部量的溶劑回收并循環(huán)。
全文摘要
描述了分離具有高純度的紫杉醇及其衍生物的方法。該方法包括超臨界流體和助溶劑萃取步驟、液－液分離步驟和柱色譜步驟。還描述了使該方法的步驟聯(lián)機(jī)進(jìn)行的分離紫杉醇及其衍生物的設(shè)備。
文檔編號(hào)C07D305/14GK1406235SQ01805533
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2001年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月25日
發(fā)明者金鎮(zhèn)雄, 崔永海, 柳基豐, 盧敏正, 韓株熙 申請(qǐng)人:韓華石油化學(xué)株式會(huì)社