專利名稱：一種提取和純化紫杉醇和其它紫杉烷類衍生物的制備液相色譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用紅豆杉科植物及其變種的樹皮、葉、樹桿或根中選擇性地提取紫杉醇(Taxol)和其它紫杉烷類衍生物的方法。
紫杉醇和一些紫杉烷類衍生物如Taxotere，具有明顯抗癌和抗白血病性，已制成治療各種癌如乳腺、前列腺、結(jié)腸、胃、腎、睪丸癌，尤其是卵巢癌的療效顯著的化療劑。
許多紅豆杉科植物如短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)、云南紅豆杉(T.yun-nanensis)、東北紅豆杉(T.cuspidata)、漿果紅豆杉(T.baccata)西藏紅豆杉(T.wallichiana)、加拿大紅豆杉(T.chinenis)和美麗紅豆杉(T.floridana)等植物的樹皮、枝葉中含有紫杉醇(Taxol)，也含有其它紫杉烷類衍生物，如10-脫乙?；鶟{果赤霉素III(10-deacetylbaccatin III)，10-脫乙酰基-7-表-漿果赤霉素III(10-deacetyl-7-epi-baccatin III)、漿果赤霉素III(baccatin III)、10-脫乙?；仙即?10-deecetyl taxol)、Cephalomannine，10-脫乙?；?7-表-紫杉醇等化合物。上述含有紫杉醇和紫杉烷類衍生物的植物在本申請書中稱為紫杉植物(Taxus sp.)。
紫杉醇在植物體內(nèi)含量普遍很低，即使公認(rèn)含量最高的短葉紅豆杉樹皮中僅有0.06％。若干植物的枝葉中也含有0.002-0.008％的紫杉醇。其它紫杉烷類衍生物中，10-deacetyl baccatin III作為半合成法制紫杉醇和Taxotere的原料，也是一種有價(jià)值的資源被受重視。
現(xiàn)已報(bào)道的從各種植物體中提取紫杉醇的方法需經(jīng)過十分繁冗的分離程序，不僅費(fèi)時(shí)，且耗費(fèi)高，回收率低。例如0.C.H Huang等，在J.Nat.prod.49 665(1986)揭示的分離法為用甲醇浸出粉碎后的短葉紫杉樹皮，將提取液濃縮，用二氯甲烷萃取濃縮物，再度濃縮后將剩余物分散在己烷-丙酮中，用填充有Florisil硅膠的色譜柱，以正相色譜法將可溶部分提純得紫杉醇粗制品，用甲醇-水和己烷-丙酮混合物順序重結(jié)晶后再經(jīng)色譜提純，再泡結(jié)晶，這樣提取的紫杉醇量為所用植物部分的0.005-0.017％，其回收率僅為20-40％。EP0553780A1中揭示的分離法與上法相近，用不同比例的環(huán)己烷-乙酸乙酯混合物作洗脫劑，以硅膠為固定相，以正相色譜法分離出紫杉醇。E.R.M.weikremesinhe，R.N.Arteca等。在J.Liq.Chromatogr.16(15)3263(1993)上揭示，用鍵合有十八烷基的鍵合硅球作固定相，以不同濃度的甲醇水溶液作洗脫劑，以反相色譜法從濃縮物中分離出含有紫杉醇的粗產(chǎn)品。再用高效鍵合十八烷基硅球固定相，經(jīng)反相色譜法在制備高效液相色譜儀上分離出紫杉醇純品。此法分離效率高，回收率較好。但鍵合硅球固定相價(jià)格昂貴，且其化學(xué)穩(wěn)定性較差，一旦中毒很難再生，不能適應(yīng)大規(guī)模制備的需要。饒暢、劉欣等在藥學(xué)學(xué)報(bào)26(7)510(1991)中揭示，在用硅膠作固定相的正相色譜法柱層析和低壓柱層析制得含紫杉醇濃縮物后，用高速逆流色譜法進(jìn)行濃縮物的分離，但最后結(jié)論是Taxol與Cephalomennine和baccatin III不能完全分開，需要再次進(jìn)行制備高效液相色譜法分離。
綜上所述，已報(bào)道的從浸出物中分離提取紫杉醇的色譜方法均有所不足，最通用的以硅膠為固定相的正相色譜法，因硅膠的不可逆吸附使樣品損失大，且硅膠固定相通常只能使用一次，操作十分不便，以鍵合硅球?yàn)楣潭ㄏ嗟姆聪嗌V法，雖然分離選擇性好，柱效率高，但固定相昂貴，易中毒，不能適應(yīng)大規(guī)模分離的要求?，F(xiàn)有的高速逆流色譜法，分離提取紫杉醇的選擇性較差，不能滿足提取和純化的要求。
作為本發(fā)明的主題，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了可以用廉價(jià)的、效率高、化學(xué)穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用的多孔高分子填料作固定相，以反相色譜方法，從紫杉植物的各部分，尤其是從樹皮、葉、枝中，以極高的選擇性和優(yōu)異的回收率提取和純化紫杉醇和其它的紫杉烷類衍生物。
本發(fā)明的方法包括1.用乙醇或甲醇或甲醇和二氯甲烷混合液或乙醇、丙酮和氯仿的混合液來浸出研磨后的紫杉植物體，得到的浸出液濃縮至干，用二氯甲烷或氯仿溶解殘余物，加入水與二氯甲烷(或氯仿)進(jìn)行相分配。分出二氯甲烷層(或氯仿層)，加入硅藻土或多孔高分子填料，將此混合物減壓蒸餾，除去溶劑，得到固定有浸出物的固體吸附劑。
2.將固定有浸出物的固體吸附劑置于填充有多孔高分子填料作固定相的色譜柱頂端，分步地用不同濃度的含有適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑的水溶液對色譜柱進(jìn)行洗脫，即用反相液相色譜法進(jìn)行分離。最先是有色雜質(zhì)從柱出口餾出，接著10-deacetylbaccatin III，10-deacetyl-7-epi-baccatin III，baccatin III，10-deacetyltaxol，cephalomannine，10-deacetyl-7-epi-taxol和taxol順次餾出，分別收集餾出的紫杉醇及其它的紫杉烷類衍生物餾出，進(jìn)行減壓濃縮、干燥后得到富集有紫杉醇和富集有其它紫杉烷類衍生物的濃縮物。
4，再用填充有多孔高分子填料作固定相的反相色譜法，分別對得到的紫杉醇濃縮物，或其它紫杉烷類衍生物濃縮物進(jìn)行分離純化，可得到純度較高的紫杉醇或純度較高的其它紫杉烷類衍生物。
5.可用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑體系對得到的紫杉醇制品或其它紫杉烷類衍生物制品分別進(jìn)行選擇性結(jié)晶，獲得紫杉醇純品，或其它紫杉烷衍生物的純品。
本發(fā)明可用各類紫杉植物的任何適宜部分，如樹皮、葉、枝、根部來制備紫杉醇和其它紫杉烷類衍生物。本發(fā)明。由于本發(fā)明操作較簡單，回收率高，可以實(shí)現(xiàn)從含紫杉醇僅0.002％的葉中，高回收率地制備紫杉醇。這種提取方法不會破壞紫杉植物資源，其葉在每一生長循環(huán)后又可再利用。本法亦適用于從紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞中制取紫杉醇。
本發(fā)明方法的特征在于用多孔高分子填料作固定相的反相液相色譜方法來提取和純化紫杉醇及其它的紫杉烷類衍生物。本發(fā)明方法與以相同粒度鍵合硅膠球?yàn)楣潭ㄏ嗟姆聪嘁合嗌V法的選擇性和柱效率相當(dāng)，但多孔高分子填料容易制備，化學(xué)穩(wěn)定性好、柱壽命長、價(jià)格低廉。產(chǎn)品回收率高，更宜用于大規(guī)模制備。本發(fā)明方法克服了正相液相色譜法中硅膠填料對樣品的不可逆吸附造成的回收率低，硅膠柱壽命短等缺點(diǎn)。
本發(fā)明所述的多孔高分子填料其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征是一類多孔型聚苯乙烯一二乙烯基苯高分子微粒，或多孔型交聯(lián)聚丙烯酸酯型或聚甲基丙烯酸酯型高分子微粒，或多孔型交聯(lián)聚丙烯腈型高分子微粒，或多孔型交聯(lián)聚丙烯酰胺型高分子微粒，或多孔型交聯(lián)聚醋酸乙烯酯型高分子微粒等；其孔特征為1.在濕態(tài)下外觀多呈乳白色；2.比孔體積大于0.1ml/g；3.比表面積大于0.5m2/g；4.平均孔徑大于30A，其粒度特征為在粒徑范圍為250um至5um內(nèi)，一窄粒度分布范圍的顆粒群，粒度分布的分散度愈小愈好，在粒度分布范圍窄的條件下，粒徑愈小，分離的柱效率愈高。
本發(fā)明所述的反相液相色譜方法其特征是采用含有適當(dāng)有機(jī)溶劑的水溶液作淋洗劑。所述的水溶液是指去離子水與有機(jī)溶劑的混合溶液，或是含有鹽類的水緩沖溶液與有機(jī)溶劑混合得到的溶液。本發(fā)明所述的有機(jī)溶劑可以是低碳醇類，如甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇；也可以是低碳酮類，如丙酮、丁酮、甲基乙基酮也可以是乙腈、丙腈、四氫呋喃；也可以是兩種以上有機(jī)溶劑可溶于水的混合物。
本發(fā)明所述的以多孔高分子填料為固定相的反相液相色譜方法，可以在5-60℃之間進(jìn)行。在20-35℃之間進(jìn)行較適宜。
本發(fā)明所述的方法適用于分離毫克級至公斤級的物料。
以下實(shí)施例詳述本發(fā)明實(shí)例1取10kg云南紅豆杉樹皮粉碎至粒徑小于20目，加入20L95％乙醇，在室溫下強(qiáng)烈攪拌1 6小時(shí)，過濾、收集濾液。再加入20L95％乙醇，攪拌浸出16小時(shí)，過濾、收集濾液。合并濾液，在45℃下，減壓蒸出溶劑。用5L二氯甲烷溶解殘余物，加入5L水與二氯甲烷液進(jìn)行萃取，收集二氯甲烷層。在此有機(jī)相中加入500g硅藻土(100-200目)，將懸浮液在40℃減壓蒸發(fā)去除溶劑，得到負(fù)載有浸出物的硅藻土。
將此負(fù)載有浸出物的硅藻土加至填充多孔聚苯乙烯一二乙烯基苯高分子微球(核工業(yè)北京化冶院產(chǎn)品，粒徑150-100um，此表面積450m2/g，平均孔徑71A)的色譜柱柱頭，色譜柱直徑50mm，固定相層高1780mm。先后用40％，50％，60％，70％(v/v)的甲醇——水溶液來洗脫柱子。流速為20ml/min，定時(shí)對流出液取樣進(jìn)行HPLC(高效液相色譜)分析，測定餾出液中化學(xué)成分。有色雜質(zhì)、10-deacetylbaccatin III，10-deacetyl-7-epi-baccatin III，10-deacetyl taxol，cephalomannin，紫杉醇等成分，夾雜一些未知成分先后餾出。分別收集富10-deacetyl bacattinIII餾分(含10-deacetyl baccatin III約40％.其余為未知成分)；減壓蒸餾，干燥得殘余物2g，富baccatin III餾分(含bacattin III約30％，其余為cephalomannine及未知成分)；減壓蒸餾、干燥得殘余物富Cephalomannine餾分(含Cephalomannine60％，Taxol 10％，其余為其它雜質(zhì))；減壓蒸餾、干燥得殘余物2g；富紫杉醇餾分3克(含Taxol約68％，Cephalomannine約10％，其余為未知物)，減壓蒸餾、干燥得富紫杉醇的濃縮物3.8克。
富10-deacetyl bacattin III濃縮物在丙酮一水中重結(jié)晶，得10-deacetylbacattin III制品0.8克(含量76％)。
實(shí)例2取實(shí)例1所得到的富紫杉醇濃縮物，用20毫升甲醇溶解，分二次用注射針注入填充有多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯高分子微球作固定相的色譜柱柱頭，色譜柱尺寸為Φ40×300mm，填料為核工業(yè)北京化工冶金研究院產(chǎn)品，粒徑為20-25um，填料的其余性質(zhì)與實(shí)例1中的相同。淋洗液為70％甲醇-水溶液，采用的紫外光度檢測器的檢測波長為227nm，收集Taxol峰出現(xiàn)時(shí)的餾分，蒸發(fā)出溶劑，用在甲醇-水中重結(jié)晶，得到2.3g紫杉醇純品，經(jīng)HPLC分析純度＞98％。
實(shí)例3按實(shí)例1所方法用40L甲醇浸出10kg經(jīng)粉碎后的東北紅豆杉的針葉，經(jīng)二氯甲烷溶解后與500g硅藻土混合，蒸出溶劑后，得到負(fù)載有浸出物的硅藻土。將此硅藻土置于實(shí)例1所述的色譜柱柱頭。順序用50％，60％，70％(v/v)乙醇-水溶液洗脫柱子。按實(shí)例1的方法得到富10-deacetyl baccatin III濃縮物1.8克，富cephalomannine濃縮物0.4g，富紫杉醇的濃縮物0.6g(含Taxol 50％)。
實(shí)例4取實(shí)例3所得的富紫杉醇濃縮物，溶于5ml甲醇中，用注射針注入用多孔交聯(lián)聚丙烯酸甲酯型高分填料為固定相的色譜柱中，色譜柱尺寸為Φ40×300mm，填料為核工業(yè)北京化工冶金研究院產(chǎn)品，粒徑為20-30um，表面積120m2/g，平均孔徑180A，其余色譜條件與實(shí)例2同。收集Taxol餾分，蒸去溶劑后，在甲醇-水中重結(jié)晶得紫杉醇純品0.28g，HPLC分析純度＞98％。
權(quán)利要求
1.從紫杉植物(Taxus.SP)各部分的醇提取物中，或從紫杉培養(yǎng)細(xì)胞提取物中，采用一種制備液相色譜法來分離和從純化紫杉醇(Taxol)和其它的紫杉烷類衍生物，其特征是將提取物固化在固體吸附劑上，以固相引入方式進(jìn)樣，用多孔高分子填料為固定相的反相液相色譜法來進(jìn)行分離，用適當(dāng)有機(jī)溶劑的水溶液來進(jìn)行洗脫，紫杉醇和其它紫杉烷類衍生物按一定順序隨洗脫液從柱口餾出，分步收集富紫杉醇和富其它紫杉烷類衍生物的餾分，分別進(jìn)行濃縮，干燥，得到紫杉醇濃縮物和其它的紫杉烷類衍生物的濃縮物，得到的紫杉醇濃縮物，再以多孔高分子填料為固定相的反相液相色譜法進(jìn)行純化，從而獲得紫杉醇的純品(＞98％)。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征是所用作固定相的多孔高分子填料可選用一類多孔型聚苯乙烯--二乙烯苯高分子微粒，或多孔型交聯(lián)聚丙烯酸酯型或甲基丙烯酸酯型高分子微粒，或多孔型交聯(lián)聚丙烯酰胺型高分子微粒，或多孔型交聯(lián)聚醋酸乙烯型高分子微粒，這些填料的孔特征為(1)比孔體積大于0.1ml/g，(2)比表面積大于0.5m2/g，(3)平均孔徑大于30；其粒度特征為在粒徑范圍5--250un內(nèi)的一段窄粒度分布范圍的顆粒群，粒度分布的分散度愈小愈好，在粒度分布窄的條件下，粒徑愈小，柱效率愈高。
3.權(quán)利要求1方法，其特征是有機(jī)溶劑選自甲醇.乙醇.異丙醇.異丁醇.丁醇.乙腈.丙腈.丙酮.丁酮.四氫呋喃，或二種以上有機(jī)溶劑配成的可溶于水的混合物，或用上述一種或二種以上有機(jī)溶劑與去離子水或緩沖水溶液相混合配制成的洗脫液。有機(jī)溶劑與水的體積比為5--95％，最好用40--85％，可以用等度洗脫也可以用梯度洗脫方式。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征是分離可以在5--60攝氏度之間進(jìn)行，在20--35攝氏度之間較佳。
5.權(quán)利要求1的方法，其特征是本方法適用于分離毫克級至公斤級的物料。
全文摘要
本發(fā)明涉及用多孔高分子填料作固定相的反相液相色譜分離法，從紫衫植物(Taxus，SP)各部分的提取物中，或從紅豆衫培養(yǎng)細(xì)胞的提取物中，分離和純化紫衫醇和其它紫杉烷類衍生物，本方法選擇性好，回收率高。
文檔編號C07D305/14GK1140170SQ9610244
公開日1997年1月15日 申請日期1996年3月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月5日
發(fā)明者劉開錄, 楊雪峰 申請人:核工業(yè)北京化工冶金研究院