香豆素衍生物及其制備方法以及彈性蛋白酶活性檢測方法和檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種香豆素衍生物，該香豆素衍生物如式（1）所示，其中，R1為五氟乙基和七氟丙基中的一種，R2為三氟甲基、甲基、氰基、吡啶環(huán)和苯并噻唑環(huán)中的一種；本發(fā)明還提供了香豆素衍生物在檢測彈性蛋白酶的活性中的應(yīng)用，以及一種彈性蛋白酶的檢測方法，和一種彈性蛋白酶的活性的檢測試劑盒。本發(fā)明提供的香豆素衍生物熒光探針用于與彈性蛋白酶活性檢測有關(guān)的應(yīng)用時(shí)的靈敏度高、與酶的親和力高、原子利用率高，并且本發(fā)明的香豆素衍生物為非肽類的熒光探針，相比于肽類熒光探針穩(wěn)定性更高、使用更方便、價(jià)格更低廉。式（1）
【專利說明】香豆素衍生物及其制備方法以及彈性蛋白酶活性檢測方法和檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種香豆素衍生物及其制備方法和在檢測彈性蛋白酶的活性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)測定彈性蛋白酶(EC號:3.4.21.37)活性的方法主要有三種。第一種是傳統(tǒng)的高效液相色譜法(HPLC)，該方法可以直接用于檢測中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶介導(dǎo)的水解纖維蛋白原反應(yīng)。但是，高效液相色譜法實(shí)驗(yàn)過程繁瑣、周期長、并且很難做到彈性蛋白酶抑制劑或促進(jìn)劑的高通量篩選。第二種是紫外吸收光譜法，該方法操作簡單、反應(yīng)快速，目前已獲得廣泛的使用，但是這種方法存在以下兩方面的缺陷:首先，紫外吸收光譜法的背景干擾大導(dǎo)致分析的靈敏度低。其次，用于分析的底物均為多肽衍生物或蛋白質(zhì)，底物的制備成本高。目前普遍應(yīng)用的第三種彈性蛋白酶活性的檢測方法是熒光發(fā)射光譜法，該方法以多肽類為熒光探針，檢測的靈敏度高、操作方法簡單、并且可以用于高通量篩選。該方法的缺陷在于多肽類探針在常規(guī)條件下大都穩(wěn)定性差，儲存和運(yùn)輸條件苛刻，原子利用率低。
[0003]目前國內(nèi)外還沒有非肽熒光探針用于檢測彈性蛋白酶活性及其抑制劑或促進(jìn)劑篩選的報(bào)道。因此，設(shè)計(jì)開發(fā)基于非肽熒光探針的靈敏、性質(zhì)穩(wěn)定、操作簡便、成本低廉的檢測方法是非常迫切和必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有彈性蛋白酶活性檢測技術(shù)中存在的缺陷，提供一種靈敏度高、性質(zhì)穩(wěn)定、操作簡便、易于儲運(yùn)并且成本低廉的非肽彈性蛋白酶活性檢測熒光探針和彈性蛋白酶活性檢測方法。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種香豆素衍生物，該香豆素衍生物具有式(I)所示結(jié)構(gòu)，其中，R1為五氟乙基和七氟丙基中的一種，R2為三氟甲基、甲基、氰基、吡啶環(huán)和苯并噻唑環(huán)中的一種；
【權(quán)利要求】
1.一種香豆素衍生物，該香豆素衍生物如式(I)所示，其中，R1為五氟乙基和七氟丙基中的一種，R2為三氟甲基、甲基、氰基、吡啶環(huán)和苯并噻唑環(huán)中的一種；
2.權(quán)利要求1所述的香豆素衍生物的制備方法，其特征在于，該方法包括在親核反應(yīng)條件和縛酸劑存在下，在有機(jī)溶劑中，將式(2)所示的化合物與酰氯或酸酐接觸；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其中，相對于I毫摩爾的式(2)所示結(jié)構(gòu)化合物，所述酰氯或酸酐的用量為1-3毫摩爾，所述縛酸劑的用量為1-3毫摩爾，所述有機(jī)溶劑的用量為10-20毫升。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其中，所述親核反應(yīng)條件包括:溫度為零下5°C至 30°C，時(shí)間為 10-120min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其中，所述縛酸劑為三乙胺、二乙胺、二異丙基胺、吡唆、N，N-二甲氨基吡啶、2，6-二甲基吡唆、碳酸鉀、碳酸銫、碳酸鈉和碳酸氫鈉中的至少一種，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、四氫呋喃、氯仿、四氯化碳、乙腈、丙酮、乙二醇二甲醚、N, N-二甲基甲酰胺和1，2-二氯乙烷中的至少一種。
6.權(quán)利要求1所述的香豆素衍生物在檢測彈性蛋白酶的活性中的應(yīng)用。
7.一種彈性蛋白酶的活性的檢測方法，其特征在于，該方法包括: 將待測樣品與權(quán)利要求1中所述的香豆素衍生物接觸，得到接觸后的物料； 檢測接觸后的物料在激發(fā)光下發(fā)出的熒光強(qiáng)度的增加值，所述熒光強(qiáng)度的增加值指示了待測樣品中彈性蛋白酶的活性；所述激發(fā)光的波長為340-430nm，所述熒光的發(fā)射波長為 450_520nm。
8.權(quán)利要求7所述的檢測方法，其中，相對于Iμ M的彈性蛋白酶，所述香豆素衍生物的用量為1-100 μ Μ。
9.權(quán)利要求7或8所述的檢測方法，其中，接觸的條件包括:溫度為25-37°C，pH值為6-8，時(shí)間為 5-30min。
10.一種彈性蛋白酶的活性的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括:權(quán)利要求1所述的香豆素衍生物、彈性蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品以及反應(yīng)緩沖液。
【文檔編號】C07D311/18GK104031014SQ201310086356
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月8日
【發(fā)明者】楊光富, 楊文超, 李俊, 孫琦, 張春芳 申請人:華中師范大學(xué)