一種熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及DNA聚合酶及其制備方法，尤其設(shè)及一種熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] PCR反應(yīng)（PolymeraseChainReaction)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò) 增技術(shù)。它的目的是使得DNA片斷在短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)增，具有特異，敏感，產(chǎn)率高，快速，簡(jiǎn) 便，重復(fù)性好，易于自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)，使它在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迅速得到了廣泛的實(shí) 際應(yīng)用。被許多科學(xué)家視為近幾十年來(lái)分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項(xiàng)技術(shù)突破。
[0003] PCR技術(shù)在生命科學(xué)中掀起了一場(chǎng)革命，它可W使人們通過(guò)幾個(gè)小時(shí)的試管內(nèi)的 DNA聚合反應(yīng)，就可將DNA擴(kuò)增109倍。通過(guò)PCR技術(shù)不僅可W擴(kuò)增存在于樣品中的DNA， 也可W富集混合DNA分子中的任一種。PCR的重要價(jià)值在于擴(kuò)增存在微量而特殊的DNA序 列。運(yùn)項(xiàng)技術(shù)是由KaryMullis于1985年發(fā)明的，為此他獲得了 1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
[0004] PCR的原理： 陽(yáng)0化]DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可W變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣 的兩分子拷貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可W發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可W復(fù) 性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加人DNA 聚合酶、dNTP就可W完成特定基因的體外復(fù)制。
[0006] 標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為Ξ步：
[0007] 1.DNA變性（90°C-96°C):雙鏈DNA模板在熱作用下，氨鍵斷裂，形成單鏈DNA。 陽(yáng)00引 2.退火（8°C-65°C):系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。
[0009] 3.延伸（70°C-75°C):在耐熱性DNA聚合酶（在72°C左右最佳的活性）的作用 下，WdNTP為原料，從引物的3'端向5'端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。
[0010] 在PCR技術(shù)中，耐熱的TAQDNA聚合酶是一個(gè)關(guān)鍵。耐熱性DNA聚合酶的應(yīng)用價(jià) 值依賴(lài)于它的功能特性，主要功能特性有： W11] (1)耐熱性：耐熱DNA聚合酶是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)得W實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的關(guān) 鍵。它使PCR過(guò)程中高溫（90°CW上）解鏈、低溫（60°C左右）退火和中溫（約70°C)延長(zhǎng) 均可在酶一次性加入的情況下反復(fù)循環(huán)。
[0012] 似聚合活性和效率：是指酶分子對(duì)模板和底物的親和性W及酶的催化效率，一 般W轉(zhuǎn)換數(shù)和最高比活表示。反應(yīng)體系中模板和底物濃度、緩沖體系和二價(jià)離子及擴(kuò)增目 標(biāo)DNA的長(zhǎng)度對(duì)聚合活性和催化效率也有較大的影響。 陽(yáng)01引 （3) 3' - 5'外切酶活性：有的DNA聚合酶具有3' - 5'外切活性，使TAQDNA聚 合酶具有校讀或更正復(fù)制或修復(fù)過(guò)程中的3'末端錯(cuò)誤。
[0014] (4)5' - 3'外切酶活性：有的DNA聚合酶具有5' - 3'外切活性，它可用在PCR 產(chǎn)物檢測(cè)系統(tǒng)，W產(chǎn)生特異性的可檢測(cè)的擴(kuò)增的信號(hào)。但對(duì)模板特別是環(huán)狀DNA的質(zhì)粒模 板的水解作用會(huì)影響PCR的擴(kuò)增效率。
[0015] (5)反轉(zhuǎn)錄活性：有的DNA聚合酶具有反轉(zhuǎn)錄活性，特別是耐熱的具有反轉(zhuǎn)錄活性 的DNA聚合酶，可用于cDNA文庫(kù)的單酶法構(gòu)建和擴(kuò)增，可克服mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程 的抑制作用，簡(jiǎn)化構(gòu)建和擴(kuò)增過(guò)程。
[0016] (6)保真度：主要是與酶對(duì)模板和底物的親和性及識(shí)別能力有關(guān)。其次是3'-5'外切的校正作用可大大提高DNA聚合酶的保真度。高保真度有利于擴(kuò)增長(zhǎng)片斷DNA，保 真度較低時(shí)容易在出錯(cuò)處中止擴(kuò)增。
[0017] Taq酶是一種耐熱性單亞基酶，分子量為93909Da，由832個(gè)氨基酸組成，含有有7 個(gè)結(jié)構(gòu)域，功能區(qū)域被定位在287-832氨基酸之間。酶學(xué)分類(lèi)為EC1. 7. 7.7,具有5'-3' 端聚合酶特性，最適溫度為72-80°C，95°C半衰期為40min，100°C半衰期為5min。高于DNA 變性溫度，因此能夠用于PCR擴(kuò)增。化qDNA聚合酶是至今發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶中活性最 高的一種，每分子酶每秒鐘可延伸150個(gè)核醉酸，是所有嗜熱DNA聚合酶中延伸速度是最 快的，擴(kuò)增的DNA長(zhǎng)度可達(dá)20化。
[0018] 熱啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)化otstartPCR)是一種改良的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，主 要用來(lái)避免操作過(guò)程中產(chǎn)生非特異性序列的擴(kuò)增。將DNA聚合酶與其他反應(yīng)物隔絕，或是 使用在高熱狀況下才會(huì)活化的聚合酶，避免在未達(dá)到設(shè)定溫度前就開(kāi)始反應(yīng)。目前實(shí)現(xiàn)PCR 熱啟動(dòng)方法包括：手工熱啟動(dòng)方法、蠟防護(hù)層包裹法、抗體修飾法W及化學(xué)修飾法等幾種。 商業(yè)化熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶還包括抗體修飾法和化學(xué)修飾法等為主。手工熱啟動(dòng)操作繁 瑣，在實(shí)際應(yīng)用中不可行，蠟防護(hù)層包裹法非常不穩(wěn)定無(wú)法商業(yè)化，抗體法使用的抗體是通 過(guò)動(dòng)物免疫得到的抗體，制備過(guò)程復(fù)雜，價(jià)格昂貴。
[0019] 如何提供一種簡(jiǎn)單、有效的制備具有穩(wěn)定增強(qiáng)PCR反應(yīng)效率的熱啟動(dòng)化qDNA聚 合酶的方法成為有待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 本發(fā)明提供一種熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶，所述化qDNA聚合酶由化qDNA聚合酶 與醒基化多聚糖結(jié)合獲得，所述結(jié)合通過(guò)化qDNA聚合酶的氨基與醒基化多聚糖的醒基反 應(yīng)形成酷胺鍵實(shí)現(xiàn)，所述酷胺鍵能在95°C溫度下5分鐘W上斷開(kāi)，從而釋放化qDNA聚合酶 的聚合活性，同時(shí)多聚糖對(duì)蛋白有保護(hù)作用，既抑制了化qDNA聚合酶在低溫下3'到5'的 聚合活性，又作為化qDNA聚合酶的保護(hù)劑有利于增強(qiáng)PCR反應(yīng)的效率。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種制備熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶的方法，通過(guò)所述方法能簡(jiǎn)單、有 效的制備具有穩(wěn)定增強(qiáng)PCR反應(yīng)效率的熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶。 陽(yáng)02引本發(fā)明提供的一種熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶，所述化qDNA聚合酶由化qDNA聚合 酶與醒基化多聚糖結(jié)合獲得，所述結(jié)合通過(guò)化qDNA聚合酶的氨基與醒基化多聚糖的醒基 反應(yīng)形成酷胺鍵實(shí)現(xiàn)，所述酷胺鍵能在95°C溫度下5分鐘W上斷開(kāi)，所述多聚糖由下式表 示，其中η為40-200，
[0023]
[0024] 在本申請(qǐng)的方案中，用于制備本申請(qǐng)熱啟動(dòng)化qDM聚合酶的化qDM聚合酶可 W選自本領(lǐng)域常規(guī)使用的、可商購(gòu)獲得的普通化qDNA聚合酶、快速化qDNA聚合酶、高保 真化qDNA聚合酶和長(zhǎng)片段擴(kuò)增化qDNA聚合酶等。進(jìn)一步的，酶活力單位可W大于150U/ mg。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述醒基化多聚糖由氧化劑氧化多聚糖獲得， 所述氧化劑為化1〇4。
[00%] 在本申請(qǐng)的方案中，所述多聚糖為葡聚糖或殼聚糖。進(jìn)一步的，所述多聚糖為葡聚 糖40、葡聚糖70或殼聚糖50。
[0027] 進(jìn)一步的，所述氧化劑氧化多聚糖的條件為：將Ig-lOg所述多聚糖溶解于lOOmL 的0. 02M-0. 2M的化1〇4的醋酸鹽緩沖液中，該緩沖液的抑為4-6,然后在4°C-8°c避光反 應(yīng)20h-4她，反應(yīng)結(jié)束后用蒸饋水透析3-4次，經(jīng)濃縮干燥得到粉末狀的醒基化多聚糖。
[0028] 更進(jìn)一步的，所述氧化劑氧化多聚糖的條件為：將2-5g所述多聚糖溶解于lOOmL 的0. 1M-0. 15M的化1〇4的醋酸鹽緩沖液中，該緩沖液的抑為4-6,然后在4°C-8°C避光反 應(yīng)20h-4她，反應(yīng)結(jié)束后用蒸饋水透析3-4次，經(jīng)濃縮干燥得到粉末狀的醒基化多聚糖。
[0029] 更進(jìn)一步的，所述化qDNA聚合酶與醒基化多聚糖結(jié)合的條件為：將所述醒基化 多聚糖加入濃度為50mg/L的化qDNA聚合酶的水溶液中形成氧化混合物，其中所述醒基化 多聚糖與化qDNA聚合酶的摩爾比為100-150:1，4°C-8°C避光反應(yīng)20h-4她，基于反應(yīng)后混 合物的總重，加入l-5wt%濃度為lOwt%的牛血清蛋白度SA)，然后在4°C-8°C下避光反應(yīng) 封閉20h-4她，分離產(chǎn)生的獲得熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶。所述分離可W使用本領(lǐng)域常規(guī)手段 進(jìn)行，例如透析，柱分離或超濾等。進(jìn)一步的，在本發(fā)明的方案中，所述醒基化多聚糖與化q DM聚合酶的摩爾比為100-130:1。
[0030] 本發(fā)明提供的一種制備熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶的方法，將化qDNA聚合酶由化q DM聚合酶與醒基化多聚糖結(jié)合獲得熱啟動(dòng)化qDM聚合酶，所述結(jié)合通過(guò)化qDM聚合酶 的氨基與醒基化多聚糖的醒基反應(yīng)形成酷胺鍵實(shí)現(xiàn)，所述酷胺鍵能在95°C溫度下5分鐘W 上斷開(kāi)，所述多聚糖由下式表示，其中η為40-200，
[0031]
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述醒基化多聚糖由氧化劑氧化所述多聚糖獲 得，所述氧化劑為化1〇4。
[0033] 進(jìn)一步的，所述多聚糖為葡聚糖或殼聚糖。
[0034] 進(jìn)一步的，所述氧化劑氧化多聚糖的條件為：將Ig-lOg所述多聚糖溶解于lOOmL 的0. 02M-0. 2M的化1〇4的醋酸鹽緩沖液中，該緩沖液的抑為4-6,然后在4°C -8°c避光反 應(yīng)20h-4她，反應(yīng)結(jié)束后用蒸饋水透析3-4次，經(jīng)濃縮干燥得到粉末狀的醒基化多聚糖。
[0035] 更進(jìn)一步的，所述氧化劑氧化多聚糖的條件為：將2-5g所述多聚糖溶解于lOOmL 的0. 1M-0. 15M的化1〇4的醋酸鹽緩沖液中，該緩沖液的抑為4-6,然后在4°C-8°C避光反 應(yīng)20h-4她，反應(yīng)結(jié)束后用蒸饋水透析3-4次，經(jīng)濃縮干燥得到粉末狀的醒基化多聚糖。
[0036] 更進(jìn)一步的，所述化qDNA聚合酶與醒基化多聚糖結(jié)合的條件為：將所述醒基化 多聚糖加入濃度為50mg/LTaqDNA聚合酶的水溶液中形成氧化混合物，其中所述醒基化 多聚糖與化qDNA聚合酶的摩爾比為100-150:1，4°C-8°C避光反應(yīng)20h-4她，再基于反應(yīng) 后混合物的總重，加入l-5wt%濃度為lOwt%的牛血清蛋白在4°C-8°C下避光反應(yīng)封閉 20h-4她，分離產(chǎn)生的熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶。
[0037] 本發(fā)明方案具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0038] 1)本發(fā)明的熱啟動(dòng)化qDNA聚合酶中的酷胺鍵能在95°C高溫作用下5分鐘W上 斷開(kāi)，從而釋放化qDNA聚合酶的聚合活性，由于在初始循環(huán)的熱變性之前它沒(méi)有活性，從 而抑制了低溫條件下由引物非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)具有