一種抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的ssr標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的SSR標(biāo)記及其應(yīng)用，所述SSR標(biāo)記的引物為：上游引物T5?F：5′?CAATCAATCGATGCACAAAACACC?3′；下游引物T5?R：5′?GACTGACTGCATTGGATTTGGCTT?3′。該標(biāo)記在CLN32120a?23中可以擴增出580bp的條帶，在Moneymaker中可以擴增出640bp的條帶，在F1中可以擴增出上述2條條帶，標(biāo)記結(jié)果與田間鑒定基本一致，證明該標(biāo)記能夠區(qū)分抗病材料、感病材料及雜合抗病材料，是與抗番茄黃化曲葉病毒病基因ty?5緊密連鎖的共顯性標(biāo)記。分子標(biāo)記檢測與田間檢測結(jié)果吻合率達90％。該標(biāo)記可用于番茄抗黃化曲葉病毒ty?5基因的PCR快速檢測，為ty?5分子標(biāo)記輔助選擇育種的應(yīng)用提供一定的理論和實踐依據(jù)。
【專利說明】
-種抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的SSR標(biāo)巧及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的SS財示記及利用SS財示記輔助選 擇抗TYLCV抗病品種的選育的PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 番茄黃化曲葉病毒病作為一種新型病毒病，具有毀滅性大、病害蔓延迅速等特點， 已成為威脅各國番茄生產(chǎn)的主要病害之一。目前，培育抗病品種仍是防治黃化曲葉病毒病 的最有效方法。目前現(xiàn)已挖掘的抗性基因包括了7-1^7-2^7-3^7-3曰^7-4、*7-5等。最早 鑒定出的抗番茄黃化曲葉病毒(1TLCV)基因 Ty-1源自智利番茄LA1969,其中VERLAAN等研究 表明，Ty-1和Ty-3是1對等位基因，它們編碼的RNA依賴的RNA聚合酶(RDR)屬于RDR 丫類型， 它有1個典型WDFDGD為主的催化結(jié)構(gòu)域。Ty-l/Ty-3運對基因完全掲示了一種新類型的抗 病基因。T廠2來自多毛番茄S.habrochaites B6013,位于第11條染色體上的TG36和TG393標(biāo) 記間；楊曉慧等構(gòu)建了Ty-2基因目的區(qū)域染色體片段內(nèi)高分辨率遺傳圖譜，將Ty-2基因定 位到分子標(biāo)記UP8和Ml之間，遺傳距離0.4cM，Ty-2基因為完全顯性遺傳。JI等在智利番茄 LA1932中獲得1個新的菜豆金黃花葉病毒抗性位點Ty-4,并被定位于3號染色體。Ty-巧日Ty- 4基因的重組自交系有著較高水平的TYLCV抗性。楊曉慧等研究結(jié)果表明，只含有Ty-2、Ty- 3、Ty-4基因的植株分別表現(xiàn)為抗、中抗和感病；同時含有Ty-2和Ty-3或者Ty-巧日Ty-4基因 的植株均表現(xiàn)抗??；同時含有Ty-3和Ty-4基因的植株表現(xiàn)中抗;不同基因之間的抗性表現(xiàn) 出累加效應(yīng)，含有運3個基因的材料抗病效果最好。
[0003] ANBINDER等最早發(fā)現(xiàn)ty-5基因來源于秘魯番茄的TY172品系，對黃化曲葉病毒有 很強的抗性，位于第4條染色體。皿TT0N等發(fā)現(xiàn)ty-5連鎖標(biāo)記S1NAC1與第4號染色體上的1個 隱性位點共分離。近年來，國內(nèi)研究者也通過不同的遺傳群體對番茄抗黃化曲葉病毒病ty- 5基因的遺傳規(guī)律做了一些研究，楊歡歡等對番茄6個世代進行遺傳規(guī)律分析，結(jié)果表明， ty-5為隱性遺傳基因。目前只有Ty-l/Ty-3被克隆。但不同抗病基因所調(diào)控的抗性機制仍然 存在差異，運使得番茄黃化曲葉病毒病抗病機制的研究仍較為重要。當(dāng)前國內(nèi)對ty-5分子 標(biāo)記輔助育種的研究較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的SS財示記及其應(yīng)用，利 用與番茄抗黃化曲葉病毒病ty-5連鎖較近的SSR標(biāo)記，對抗TYLCV番茄材料進行快速準(zhǔn)確的 PCR檢測，W期為ty-5分子標(biāo)記輔助選擇育種的應(yīng)用提供參考依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] -種抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的SSR標(biāo)記，其引物為：
[0007] 上游引物巧斗：5' -CAATCAATCGATGCACAAAACACC-3';
[000引 下游引物巧-R: 5' -GACTGACTGCATTGGATTTGGCTT-3'。
[0009] 上述SSR標(biāo)記可用于番茄抗黃化曲葉病ty-5基因的PC財夾速檢測，具體檢測方法如 下：
[0010] 上下游引物各1〇111〇1/1^，0臟模板0.1111旨，1'日9-]\1；[義（削13；[016證化；[]1日)祉1^，用無菌水 補足體系至20化，在94°C變性5111111，941：3〇3,551：3〇3,721：5〇3，擴增35個循環(huán)，最后72°(：終 延伸lOmin，即得PCR產(chǎn)物;PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電壓5V/cm條件下電泳40min，Bi〇- RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0011] 本發(fā)明W番茄抗病材料化N32120a-23(含ty-5基因）和感病材料Moneymaker (不含 抗病基因）為試材，通過雜交、自交獲得的Fi、F2代，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選出一個與抗病 性狀共分離的共顯性SSR標(biāo)記。研究表明：該標(biāo)記在化N32120a-23中可W擴增出58化P的條 帶，在Moneymaker中可W擴增出640bp的條帶，在Fi中可W擴增出上述2條條帶，標(biāo)記結(jié)果與 田間鑒定基本一致，證明該標(biāo)記能夠區(qū)分抗病材料、感病材料及雜合抗病材料，是與抗番茄 黃化曲葉病毒病基因 ty-5緊密連鎖的共顯性標(biāo)記。分子標(biāo)記檢測與田間檢測結(jié)果吻合率達 90%。該標(biāo)記可用于番茄抗黃化曲葉病毒ty-5基因的PC財夾速檢測，為ty-5分子標(biāo)記輔助選 擇育種的應(yīng)用提供一定的理論和實踐依據(jù)。
【附圖說明】
[0012] 圖1為SSR標(biāo)記在不同抗、感材料中的擴增條帶。
【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的保護范圍中。
[0014] 本發(fā)明提供了一種抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的SS財示記及其應(yīng)用，具體內(nèi)容 如下：
[001引謝料與方法
[0016] 1.1試驗材料
[0017] 供試番茄抗病親本化N32120a-23(亞洲蔬菜研究與發(fā)展中屯、提供）和感病親本 Moneymaker (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花弁研究所提供)均為番茄品種穩(wěn)定自交系。通過有性雜 交、自交和回交，獲得Fi、F2代。黃化曲葉病毒由江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供;用于PCR反 應(yīng)的試劑均購自北京華大科技生物技術(shù)有限公司。
[001引1.2試驗方法
[0019] 1.2.1田間發(fā)病情況統(tǒng)計
[0020] 利用網(wǎng)籠接種法進行病毒接種。8月中旬，將長至3~4片真葉的6個世代的幼苗轉(zhuǎn) 入飼養(yǎng)煙粉風(fēng)的溫室中，每天驅(qū)趕2次煙粉風(fēng)使其與番茄幼苗充分接觸，7d后將幼苗定植于 溫室內(nèi)。發(fā)病期間不噴施任何藥劑，4周后逐株調(diào)查發(fā)病情況，將病情分為0~4級:0級，無明 顯癥狀；1級，葉片只表現(xiàn)有黃色斑點或斑駁癥狀;2級，葉片黃化，比正常植株略微矮小且輕 微變形;3級，植株矮化，葉片變小、卷曲且邊緣黃化;4級，植株嚴(yán)重矮化，葉片皺縮、黃化、卷 曲并導(dǎo)致葉片面積大大減小。0~1級歸為抗病，2~4級歸為感病。
[0021] 1.2.2DNA提取及引物篩選
[0022] DNA提取參照蔡凌云等方法，利用CTAB法提取。番茄抗黃化曲葉病毒病ty-5基因引 物序列來源于化ttp://solgenomics.net/)，化t1:p://marke;r .kazusa.or.化/)網(wǎng)站已公布 的引物序列，并對選取的SSR引物進行篩選。
[0023] 1.2.3SSR 標(biāo)記的 PCR 擴增
[0024] 上下游引物各1〇111〇1/1^，0臟模板0.1111旨，1'日9-]\1;[義（削13；[016證化;[]1日)祉1^，用無菌水 補足體系至20化。最適反應(yīng)條件：94°C變性5111111，941：3〇3,551：3〇3,721：5〇3，擴增35個循 環(huán)，最后72°C終延伸lOminJCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電壓5V/cm條件下電泳40min，Bi〇- RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[002引2結(jié)果
[00%]經(jīng)過篩選，得到1個與抗病性狀共分離的SS財示記，引物序列見表1。該標(biāo)記在抗病 純合自交系Pi(CLN32120a-23)中可W擴增出1條580bp的條帶，在感病純合自交系P2 (Moneymaker)中可W擴增出1條640bp的條帶，而在化N32120a-23 XMoneymaker Fi中則可 W同時擴增出58化p和64化p左右的條帶（圖l)D580bp和64化p 2個片段能將抗病材料和感 病材料加 W區(qū)分，是與ty-5抗病基因連鎖的標(biāo)記。
[0027]表1鑒定引物序列 [002引
[0029] 3結(jié)論
[0030] 該試驗利用大量SSR分子標(biāo)記篩選出1個與抗病性狀共分離的共顯性SS財示記。該 標(biāo)記在CLN32120a-23中可W擴增出大小為58化P的條帶，在Moneymaker中可W擴增出64化P 的條帶，在Fi中可W擴增出上述2條條帶，標(biāo)記結(jié)果與田間鑒定基本一致，證明該標(biāo)記能夠 區(qū)分抗病材料、感病材料及雜合感病材料，是與抗番茄黃化曲葉病毒病基因 ty-5緊密連鎖 的共顯性標(biāo)記，可W應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。
【主權(quán)項】
1. 一種抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的SSR標(biāo)記，其特在于所述SSR標(biāo)記的引物為： 上游引物T5-F: 5' -CAATCAATCGATGCACAAAACACC-3'; 下游引物T5-R: 5' -GACTGACTGCATTGGATTTGGCTT-3'。2. 如權(quán)利要求1所述的抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的SSR標(biāo)記用于番茄抗黃化曲葉 病ty-5基因的PCR快速檢測。3. 如權(quán)利要求2所述的抗番茄黃化曲葉病性狀共分離的SSR標(biāo)記用于番茄抗黃化曲葉 病ty-5基因的PCR快速檢測，其特征在于所述PCR快速檢測的具體方法如下： 上下游引物各l〇mol/L，DNA模板0. lmg，Taq_Mix8yL，用無菌水補足體系至20yL，在94°C 變性5111丨11，941€3〇8,551€3〇8,721€5〇8，擴增35個循環(huán)，最后72°(：終延伸1〇111丨11，即得？0?產(chǎn) 物;PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電壓5V/cm條件下電泳40min，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照。
【文檔編號】C12Q1/70GK106048089SQ201610416502
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】楊歡歡, 許向陽, 李景富, 趙婷婷, 姜景彬, 劉冠
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)