專利名稱：桑黃菌中吡喃酮的分離技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
桑黃，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚1. 5-10厘米，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細(xì)微絨毛，后變無毛，有同心環(huán)棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側(cè)無子實層.菌肉深咖啡色，硬，木質(zhì).菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個.孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。目前，真菌產(chǎn)物的純化方法較多，主要有分級沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等 幾種方法。而其中應(yīng)用最多的當(dāng)屬柱層析法，分為兩類一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質(zhì)酸等，多數(shù)分離后得到的產(chǎn)物為混合物。本發(fā)明使用多種層析技術(shù)相結(jié)合，分離度高，應(yīng)用此發(fā)明可以精致到純品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木層孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中卩比喃酮的分離技術(shù)。首先制備桑黃粗提物，然后進(jìn)行正相硅膠層析，采用氯仿與甲醇梯度洗脫，進(jìn)行TLC檢測，再次使用正相硅膠層析，然后是氯仿甲醇凝膠層析，經(jīng)TLC檢測后，進(jìn)行重結(jié)晶操作，即得甲基-3 -羥基-4-吡喃酮。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20 35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2. 5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；(4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60 90% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。分離吡喃酮的方法
桑黃菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測一正相硅膠層析一氯仿甲醇凝膠層析一TLC檢測一重結(jié)晶一TLC檢測一減壓蒸干一甲基-3 -羥基-4 -吡喃酮。具體方法為
(1)制備桑黃菌粗提物；
(2)將步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液；
(3)將步驟(2)中得到的最后一次洗脫液減壓蒸干，等體積硅膠拌樣，進(jìn)行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；
(4)收集上述步驟(3)得到的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿甲醇=1:1溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (5)將步驟(4)中得到的產(chǎn)物使用甲醇或者丙酮溶解；
(6)將步驟(5)中得到的溶液進(jìn)行重結(jié)晶操作，結(jié)晶即為吡喃酮。本發(fā)明由桑黃菌中吡喃酮的分離技術(shù)的顯著優(yōu)勢本方法采用多種層析技術(shù)相結(jié)合，可以精致到結(jié)構(gòu)明確，純度大于95%的吡喃酮。技術(shù)路線成熟明確，高效精確。

圖1為本發(fā)明的甲基-3 -羥基-4 -吡喃酮的結(jié)構(gòu)式；
圖2為甲基-3 -羥基-4 -吡喃酮的一維核磁共振H譜 具體實施方式
實例1:
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 O. 1%酵母膏 O. 1%
硫酸鎂 O. 1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力O.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量O. 5-1. lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。將上述粗提物稱取300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1，分別洗脫2，3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，F(xiàn)r-2。將Fr_2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200—300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析，洗脫劑為氯仿甲醇=1:1。使用TLC檢測收集的洗脫液適當(dāng)合并，減壓蒸干，使用甲醇溶解，進(jìn)行重結(jié)晶操作，進(jìn)行ID-HNMR核磁共振分析,頻率為400MHZ,分析結(jié)果為δ 7. 72 (d, J = 5.5 Hz, 5H)，7. 26 (s, 1H)，6. 44 (d, J = 5. 5 Hz, 5H)，2. 37 (s,14H).證明其為甲基-3 -羥基-4 -吡喃酮。
實例2
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸鎂 0.5%磷酸二氫鉀0.05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接 種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以30°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為180r/min，pH6條件下，震動培養(yǎng)15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2. 5時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度30°C，發(fā)酵罐壓力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通氣量O. 5-1.1vvm,攪拌速度180轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(4)用體積百分比為90%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到70% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/10 ;
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。將上述粗提物稱取200g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高O. 8m，直徑15cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1，分別洗脫3，4個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，F(xiàn)r-2。將Fr_2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200—300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析，洗脫劑為氯仿甲醇=1:1。使用TLC檢測收集的洗脫液適當(dāng)合并，減壓蒸干，使用甲醇溶解，進(jìn)行重結(jié)晶，進(jìn)行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為δ 7. 72(d, J = 5. 5 Hz, 5H)，7. 26 (s, 1H)，6. 44 (d, J = 5. 5 Hz, 5H)，2. 37 (s, 14H) ·證明其為甲基-3 -羥基-4 -吡喃酮。`
權(quán)利要求
1.桑黃菌中吡喃酮的分離方法，其步驟順序如下 (1)制備桑黃粗提物； (2)將步驟(I)所得的乙醇沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液； (3)將步驟(2)中得到的最后一次洗脫液減壓蒸干，等體積硅膠拌樣，進(jìn)行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (4)收集上述步驟(3)得到的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿甲醇=1:1溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (5)將步驟(4)中得到的產(chǎn)物使用甲醇或者丙酮溶解； (6)將步驟(5)中得到的溶液進(jìn)行重結(jié)晶操作，結(jié)晶即為吡喃酮。
2.如權(quán)利要求1所述的一種從桑黃菌中分離苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05% (2)如權(quán)利要求1所述桑黃粗提物的發(fā)酵培養(yǎng)方法是，將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20 35 °C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2. 5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ； (4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60 90% ； (5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。
3.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中吡喃酮的分離技術(shù)，其特征在于所述的吡喃酮為2-甲基-3 -羥基-4 -吡喃酮。
4.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中吡喃酮的分離技術(shù)，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠。
5.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中吡喃酮的分離技術(shù)，其特征在于，步驟(2)中所述的層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
6.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中吡喃酮的分離技術(shù)，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為石油醚丙酮=20:1-40:1。
7.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中吡喃酮的分離技術(shù)，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex LH-20,洗脫劑為氯仿甲醇=1:1。
8.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中吡喃酮的分離技術(shù)，其特征在于，步驟(5)所述溶解劑為甲醇。
9.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中吡喃酮的分離技術(shù)，其特征在于，步驟(6)所述的操作為重結(jié)晶，次數(shù)為3-4次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種桑黃菌(火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中吡喃酮的分離技術(shù)。首先制備桑黃菌粗提物，然后進(jìn)行正相硅膠層析，采用氯仿與甲醇梯度洗脫，進(jìn)行TLC檢測，再次使用正相硅膠層析，然后是氯仿甲醇凝膠層析，經(jīng)TLC檢測后，進(jìn)行重結(jié)晶操作，既得甲基-3-羥基-4-吡喃酮。
文檔編號C07D309/40GK103044376SQ20121054610
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月15日
發(fā)明者趙晨, 宋愛榮, 孫效樂, 黃芳, 梁大勇 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)