專(zhuān)利名稱(chēng)：桑黃菌中一種新的桉烷型倍半萜的分離技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
桑黃，子實(shí)體無(wú)柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚I. 5-10厘米，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時(shí)常龜裂，無(wú)皮殼，初期有細(xì)微絨毛，后變無(wú)毛，有同心環(huán)棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側(cè)無(wú)子實(shí)層.菌肉深咖啡色，硬，木質(zhì).菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿(mǎn)白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個(gè).孢子近球形，光滑，無(wú)色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無(wú)橫隔，直徑3-5微米。
目前，真菌產(chǎn)物的純化方法較多，主要有分級(jí)沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應(yīng)用最多的當(dāng)屬柱層析法，分為兩類(lèi)一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質(zhì)酸等，多數(shù)分離后得到的產(chǎn)物為混合物。本發(fā)明使用多種層析技術(shù)相結(jié)合，分離度高，應(yīng)用此發(fā)明可以精致到純品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種桑黃菌(火木層孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木層孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中 1，2_ 新的按燒型倍半職的分離技術(shù)。首先制備桑黃粗提物，然后是正相硅膠層析，使用氯仿與甲醇梯度洗脫，重復(fù)一次正相硅膠層析，接著進(jìn)行氯仿甲醇凝膠層析，再次進(jìn)行正相硅膠層析，最后減壓蒸干得到1，2-新的桉烷型倍半萜。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20 35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到
2.5 4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力
O.I O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 I. Ivvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得 桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；(4)用體積百分比為60 95%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60 90% ；
(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過(guò)二級(jí)過(guò)濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。
分離桉烷型倍半萜的方法
桑黃菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測(cè)一正相硅膠層析一氯仿甲醇凝膠層析一TLC檢測(cè)一正相硅膠層析一TLC檢測(cè)一減壓蒸干一無(wú)色油狀物(新的桉烷型倍半萜)。
具體方法為
(1)制備桑黃菌粗提物；
(2)將步驟(I)所得的沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進(jìn)行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液；
(3)將步驟(2)中最后一次洗脫液蒸干，等體積硅膠拌樣，進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；
(4)收集步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿甲醇=1:1溶解，進(jìn)行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；
(5)將步驟(4)中得到的產(chǎn)物進(jìn)行再次進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；
(6)收集步驟(5)得到的洗脫液，使用TLC檢測(cè)各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為1,2-桉燒型倍半職。


圖I為本發(fā)明的桉烷型倍半萜的結(jié)構(gòu)式；
圖2為桉烷型倍半萜的一維核磁共振H譜。
具體實(shí)施例方式 實(shí)例I :
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 O. 1%酵母膏 O. 1%
硫酸鎂 O. 1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到3時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力O. I公斤/平方厘米，pH 3，通氣量
O.5-1. lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到55% ；
(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過(guò)二級(jí)過(guò)濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。
將上述得物稱(chēng)取300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高lm，直徑15cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1-200:1，分別洗脫2，3個(gè)柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1，F(xiàn)r_2。將Fr_2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200— 300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析。使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液適當(dāng)合并，減壓蒸干，再次使用正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿甲醇=100:1-50:1，收集洗脫液，使用TLC檢測(cè)各洗脫液，合并收集出現(xiàn)斑點(diǎn)的洗脫液，展開(kāi)劑為石油醚丙酮=30 :1-35: I。減壓干燥，進(jìn)行ID-13CNMR核磁共振分析，頻率為 101 ΜΗζ，δ 80.14，75.46，69.61，54.26，51.95，39.88，39.43，30.86，30.46，30.37，30. 22, 29.65，25.78，23.77，22.61，14.89，14. 51.分析結(jié)果為證明是為新的桉烷型倍半萜。
實(shí)例2
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%` 硫酸鎂 0.5%磷酸二氫鉀0.05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以30°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為180r/min，pH6條件下，震動(dòng)培養(yǎng)15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2. 5時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度30°C，發(fā)酵罐壓力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通氣量O. 5-1. Ivvm,攪拌速度180轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(4)用體積百分比為90%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到70% ；
(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過(guò)二級(jí)過(guò)濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/10 ;
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。
將上述沉淀物稱(chēng)取200g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層
析固定相為200-300目正相硅膠，柱高O. Sm,直徑10cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1-200:1，分別洗脫2，3個(gè)柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1，F(xiàn)r_2。將Fr_2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，3-4倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200— 300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析。使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液適當(dāng)合并，減壓蒸干，再次使用正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿甲醇=100:1-50:1，收集洗脫液，使用TLC檢測(cè)各洗脫液，合并收集出現(xiàn)斑點(diǎn)的洗脫液，展開(kāi)劑為石油醚丙酮=30 :1-35: I。減壓干燥，進(jìn)行ID-13CNMR核磁共振分析，頻率為 101 ΜΗζ，δ 80.14，75.46，69.61，54.26，51.95，39.88，39.43，30.86，30.46，30.37，30. 22, 29.65，25.78，23.77，22.61，14.89，14. 51.分析結(jié)果為證明是為新的桉烷型倍半 萜。
權(quán)利要求
1.桑黃菌中新的桉烷型倍半萜的分離方法，其步驟順序如下 (1)制備桑黃粗提物； (2)將步驟(I)所得的沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進(jìn)行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液； (3)將步驟(2)中最后一次洗脫液蒸干，等體積硅膠拌樣，進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (4)收集步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿甲醇=1:1溶解，進(jìn)行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (5)將步驟(4)中得到的產(chǎn)物進(jìn)行再次進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (6)收集步驟(5)得到的洗脫液，使用TLC檢測(cè)各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為1,2-桉燒型倍半職。
2.如權(quán)利要求I所述的一種從桑黃菌中分離苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05% (2)如權(quán)利要求I所述桑黃粗提物的發(fā)酵培養(yǎng)方法是，將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20 35 °C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2. 5 4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力O. I O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 I. Ivvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ； (4)用體積百分比為60 95%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60 90% ； (5)對(duì)步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過(guò)二級(jí)過(guò)濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物； 如權(quán)利要求I所述的桑黃菌中新的桉烷型倍半萜的分離方法，其特征在于所述的桉烷型倍半萜為1，2-桉烷型倍半萜。
3.如權(quán)利要求I所述的桑黃菌中新的桉烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣娃膠為100-200目正相娃膠。
4.如權(quán)利要求I所述的桑黃菌中新的桉烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
5.如權(quán)利要求I所述的桑黃菌中新的桉烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為石油醚與丙酮。
6.如權(quán)利要求I所述的桑黃菌中新的桉烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex LH-20,洗脫劑為氯仿甲醇=1:1。
7.如權(quán)利要求I所述的桑黃菌中新的桉烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的層析硅膠為200-300目。
8.如權(quán)利要求I所述的桑黃菌中新的桉烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的洗脫劑為氯仿甲醇=100:1-50:1。
9.如權(quán)利要求I所述的桑黃菌中新的桉烷型倍半萜的分離方法，其特征在于，步驟(6)所述的檢測(cè)要點(diǎn)是出現(xiàn)斑點(diǎn) ，展開(kāi)劑為石油醚丙酮=30 :1-35: I。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種桑黃菌(火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中新的桉烷型倍半萜的分離技術(shù)。首先制備桑黃菌粗提物，然后是正相硅膠層析，使用氯仿與甲醇梯度洗脫，重復(fù)一次正相硅膠層析，接著進(jìn)行氯仿甲醇凝膠層析，再次進(jìn)行正相硅膠層析，最后減壓蒸干得到新的桉烷型倍半萜。
文檔編號(hào)A01G1/04GK103113194SQ20121054605
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2012年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月15日
發(fā)明者宋愛(ài)榮, 趙晨, 孫效樂(lè), 黃芳, 王光遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)