專利名稱：雜交瘤細胞株1c8及其產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素g1單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜交瘤細胞株1C8及其產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是能引起人畜各種損害的天然有毒化合物。黃曲霉毒素目前已發(fā)現(xiàn)20余種，主要包括黃曲霉毒素BI (AFB1)、B2 (AFB2)、AFG和Ml (AFMl)等。其中AFBl的毒性最強，它的毒性是氰化鉀的10 倍，砒霜的68倍，AFG的毒性次之，這些毒素具有很強的致癌性，其中AFG在我國胃癌、食管癌高發(fā)區(qū)居民飲食中的檢出率很高。為此，世界各國都在食品安全領(lǐng)域限定了 AFG在食品等中的含量。我國屬于黃曲霉毒素污染較重的地區(qū)，因此加強農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素G的檢測、特別是速測，及時了解和掌握農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi)生信息，對保障我國食品消費安全具有重要意義。 現(xiàn)有黃曲霉毒素的檢測方法包括薄層層析法、精密儀器分析法和免疫學(xué)分析法。 其中薄層層析法是較早用于檢測黃曲霉毒素最常用的檢測方法，該法不需要特殊的儀器設(shè)備，一般實驗室都可進行，但試劑用量大、操作繁瑣、其它組分干擾嚴重、準(zhǔn)確性差，不能準(zhǔn)確定量，且對實驗人員和周圍環(huán)境污染危害較大，不適于現(xiàn)場快速檢測。精密儀器分析法主要包括熒光分光光度法和高效液相色譜法，這些方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，但又有儀器昂貴，要求黃曲霉毒素樣品純化程度高，樣品前處理過程繁瑣，耗時長，對實驗環(huán)境要求高等不足，難以實現(xiàn)快速檢測。免疫分析技術(shù)克服了前兩者的缺點，具有特異性強、靈敏度高、樣品前處理簡單、成本低、對實驗人員和周圍環(huán)境的污染危害小、適于現(xiàn)場批量檢測等優(yōu)點， 已應(yīng)用于食品、醫(yī)療等多個領(lǐng)域。免疫分析是利用抗原和抗體的特異性的結(jié)合反應(yīng)和抗體、 抗原上的標(biāo)記物的生物、物理或化學(xué)放大作用來對超微量殘留物進行定性、定量檢測，而抗體的特異性、靈敏度等直接影響檢測結(jié)果，所以要研究建立針對黃曲霉毒素Gl的免疫學(xué)檢測技術(shù)，必須先制得高質(zhì)量的抗黃曲霉毒素Gl抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供雜交瘤細胞株1C8及其產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體。本發(fā)明提供了雜交瘤細胞株1C8，該細胞株已于2010年7月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO. C201017，分類命名為小鼠雜交瘤細胞1C8。其具有序列表中SEQ ID NO. I所示的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體輕鏈可變區(qū)編碼基因序列和序列表中SEQ ID NO. 2所示的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體重鏈可變區(qū)編碼基因序列。抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體，它由保藏編號為CCTCC C201017的雜交瘤細胞株 1C8分泌產(chǎn)生。其輕鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。該抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體可以識別黃曲霉毒素Gl，對黃曲霉毒素Gl的50%抑制濃度IC5tl為13. 92 ng/mL?？裹S曲霉毒素Gl單克隆抗體在黃曲霉毒素Gl測定中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的雜交瘤細胞株1C8是采用兩步篩選法獲得的，其具體步驟為將BALB/c小鼠經(jīng)黃曲霉毒素完全抗原AFGl-BSA (見CN101270146. X公開的AFGl-BSA完全抗原)免疫4-6次后,用2倍于第一次免疫劑量的黃曲霉毒素完全抗原AFGl-BSA作最后一次加強免疫，3天后進行細胞融合，采用ELISA方法分兩步進行融合細胞篩選第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性克隆培養(yǎng)液進行檢測，用黃曲霉毒素Gl作為競爭原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔，采用有限稀釋法進行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步篩選法進行檢測，如此重復(fù)克隆2-3次后,最終篩選獲得雜交瘤細胞株1C8。本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體的制備方法，步驟如下將獲得的雜交瘤細胞株1C8注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化 即得抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體。按上述方案，所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體操作為用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°c，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30 35 μ L,室溫混合30 60min，4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為O. lmol/L和pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH值至7. 4,4 °C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為O. 277g/mL, 4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體，將抗體置_20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0. 29g醋酸鈉，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0. 02g，加水定容至IOOmL所得。
本發(fā)明的有益效果在于
(I)本發(fā)明提供的雜交瘤細胞株1C8可以用于制備高效價抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體，抗黃曲霉毒素Gl鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測得的效價可達8. 19X105。(2)本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體靈敏度高、特異性較好，對黃曲霉毒素Gl的50%抑制濃度IC5tl為13. 92ng/mL,與黃曲霉毒素BI，B2及Ml沒有交叉反應(yīng)。
(3)本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體可應(yīng)用于測定黃曲霉毒素G1。
具體實施例方式實施例I :雜交瘤細胞株1C8的制備 I.抗原合成及動物免疫
購買市售黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)CN101270146.X中的具體實施方式
的實施例I中公開的AFGl-BSA的合成方法進行AFGl-BSA完全抗原的合成；購買6周齡雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的黃曲霉毒素Gl完全抗原AFG1-BSA。第一次免疫將完全抗原AFGl-BSA與等量福氏完全佐劑混合乳化，然后小鼠頸背部皮下多點注射。第二次免疫于首免4周后進行，采用福氏不完全佐劑與等體積完全抗原AFGl-BSA乳化，小鼠腹腔注射。第三次免疫與第二次免疫間隔時間4周，免疫方式及劑量與第二次相同，第四次免疫于第三次免疫3周后進行，免疫方式及免疫劑量與第二次免疫相同，每次免疫劑量為每鼠50 μ g。前3次每次免疫后一周，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測小鼠血清抗體效價。第4次免疫后一周，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測小鼠血清抗體效價，并用間接競爭ELISA法測定小鼠血清靈敏度，選擇效價、靈敏度均相對較高的血清對應(yīng)的小鼠進行最后一次加強免疫，免疫劑量為之前的2倍。2.細胞融合
于最后一次加強免疫3天后，采用50%(重量百分數(shù))的聚乙二醇即PEG(分子量為1450) 作融合劑，按常規(guī)方法進行細胞融合，具體步驟無菌條件下殺死免疫小鼠，分離脾細胞，與鼠源骨髓瘤細胞SP2/0以5 : I的個數(shù)比混合，用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細胞，用50%PEG融合，融合I分鐘，然后加滿RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，移去上清，小鼠脾細胞和鼠源骨髓瘤細胞SP2/0形成的融合細胞用72mLRPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，將重懸起來的細胞滴加到96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，2滴/孔，置37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所述的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有20% (體積百分數(shù))胎牛血清，2% (重量百分數(shù))生長因子和1% (重量百分數(shù))次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0購于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液購于Hyclone公司；1%次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即 HAT 購于 Sigma-Aldrich 公司。3.細胞株的篩選及克隆
待細胞融合后第12天左右，細胞集落長到占孔底1/2大小，培養(yǎng)液變黃，即可進行抗體檢測。采用ELISA方法對有雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)孔進行篩選，篩選分兩步進行，第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素Gl而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性孔進行檢測，用黃曲霉毒素Gl作為競爭原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競爭原為O的孔即陽性對照孔的最終測定值較高，靈敏度較高指抑制率為50%時的競爭原濃度亦即IC5tl值較小)，采用有限稀釋法進行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步法進行檢測，如此重復(fù)克隆2-3次后，獲得雜交瘤細胞株1C8。實施例2 :抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體雜交瘤細胞株系1C8抗體可變區(qū)序列測定
(1)提取總RNA:采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說明書提取可產(chǎn)生雜交瘤細胞株系1C8的總RNA ；
(2)合成cDNA:以步驟I獲得的總RNA為模板，oligo(dT) 15為引物，按照SuperScript -2 II反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一鏈；引物oligo (dT) 15由Invitrogen 購得；
(3)PCR法克隆可變區(qū)基因根據(jù)GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點設(shè)計引物，以cDNA為模版擴增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。PCR程序為94°C 30s,55°C lmin、72°C Imin，擴增30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1% (重量百分數(shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收DNA片段，連接到載體PMD18-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進行測序。其中引物的序列分別為重鏈可變區(qū)引物為 5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3’(22mer)和 5'-TGA GGA GACGGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中 S、M、R 和 W 為兼并堿基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，輕鏈可變區(qū)引物為 5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC _3’(24mer)和 5’-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。得到的基因序列結(jié)果輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長332bp，序列如SEQ ID NO: I所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由110個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:3所示。重鏈可變區(qū)編碼基因序列長362bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由120個氨基酸組成，序列如 SEQ ID NO:4 所示。實施例3 :抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定
將實施例2獲得的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體雜交瘤細胞株系1C8注射預(yù)先用福氏 不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 μ L，室溫混合30min，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為O. lmol/L和pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH值至7. 4，4°C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為O. 277g/mL, 4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的O. Olmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體，將抗體置_20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為O. 29g醋酸鈉，O. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液為O. 8g氯化鈉，O. 29g十二水磷酸氫二鈉，O. 02g氯化鉀，磷酸二氫鉀O. 02g，加水定容至IOOmL所得。用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細胞株1C8分泌的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體的亞型為IgG2a。用常規(guī)非競爭酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測得1C8的鼠腹水抗體的效價可達8. 19X105，即鼠腹水抗體稀釋8. 19X IO5倍時的溶液測定結(jié)果為陽性。用常規(guī)間接競爭ELISA法鑒定其對黃曲霉毒素Gl的靈敏度(IC5tl)為13. 92ng/mL，與黃曲霉毒素B1，B2及Ml沒有交叉反應(yīng)。實施例4 :抗體應(yīng)用
將雜交瘤細胞株1C8分泌的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體用于黃曲霉毒素Gl的添加回收試驗，具體包括以下步驟
(1)以2.5 μ g/mL人工抗原AFGl-BSA包被酶標(biāo)板，每孔100 μ L，4 °C過夜，(λ 01 mol/L pH 7. 4 PBST洗滌扣干；
(2)5%脫脂奶粉封閉，每孔200 μ L，37°C 2 h，洗滌扣干；
(3)配制0,0. 03125,0. 3125,3. 125，6. 25，12. 5，25，50，100，200 ng/mL 的黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)溶液(含20%甲醇的磷酸鹽緩沖液，)，第一排每孔依次加入待測AFGl標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μ L，其它孔作為檢測孔，每個樣品三個重復(fù)，每孔抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體(稀釋4000倍)50yL，37°C孵育2 h，洗滌扣干;
(4)每孔加I2000羊抗鼠IgG-HRP 100μ L，37°C 2h，洗滌扣干；
(5)底物顯色反應(yīng)每孔加底物顯色液100μ L (所述底物顯色液的配制I mg/mL四甲基聯(lián)苯胺I. OmL,底物緩沖液10 mL, 1% H2O2 25 μ L，現(xiàn)配現(xiàn)用)，37°C避光反應(yīng)15min，每孔50 μ L 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，5 min后以空白對照孔調(diào)零，450nm測吸光值；
(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算黃曲霉毒素Gl對抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率在50%時的濃度(150)。(7)添加回收試驗分別稱取25g粉碎樣品置于三角瓶中，加入75mL含有4%NaCl(質(zhì)量/體積)的80%的甲醇水溶液混合均勻，超聲波處理lOmin。靜置30min，使其完全分層，吸取上清，將上清用雙層濾紙進行過濾。將濾液用含有1%BSA的PBS溶液稀釋五倍后， 向其中分別準(zhǔn)確添加Ing/mL、10ng/mL和40ng/mL AFGl的標(biāo)準(zhǔn)品，采用間接競爭ELISA方法進行添加回收試驗，并測定花生樣品的添加回收率，依次為86%，92%, 90%οELISA所需溶液配制
磷酸鹽緩沖液(pH7. 4 PBS) : Na2HPO4. 12H20 8. 7g ；NaCl 24g ；KC1 0. 6g, KH2PO4 0. 6g,加純水定容至3000mL。包被緩沖液(PH9. 6碳酸鹽緩沖液)1.59g Na2CO3 ；2. 93g NaHCO3 ;加純水定容至IOOOmL01% 吐溫 20 的 PBS 溶液(PBST 溶液)=Na2HPO4. 12H20 8. 7g ；NaCl 24g ；KC1 0. 6g，KH2PO4 0. 6g, Tween20 I. 5mL，定容至 3000mL。封閉液0.IgOVA 溶于 IOOmL PBST。底物緩沖液=Na2HPO4.12H20 I. 843g，檸檬酸 0. 933g，純水 100mL。
權(quán)利要求
1.雜交瘤細胞株1C8，其特征在于它保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為 CCTCC NO. C201017。
2.黃曲霉毒素Gl單克隆抗體，其特征在于它由保藏編號為CCTCCNO. C201017的雜交瘤細胞株1C8分泌產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃曲霉毒素Gl單克隆抗體在黃曲霉毒素Gl測定中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體的制備方法，其特征在于它是將獲得的雜交瘤細胞株1C8注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化即得抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及雜交瘤細胞株1C8及其產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素G1單克隆抗體。本發(fā)明提供的雜交瘤細胞株1C8(CCTCC NOC201017)可以用于制備高效價抗黃曲霉毒素G1單克隆抗體，抗黃曲霉毒素G1鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測得的效價可達8.19×105。(2)本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素G1單克隆抗體靈敏度高、特異性較好，對黃曲霉毒素G1的50%抑制濃度IC50為13.92ng/mL，與黃曲霉毒素B1，B2及M1沒有交叉反應(yīng)，可應(yīng)用于測定G1黃曲霉毒素。
文檔編號C07K16/14GK102719405SQ201210117620
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者丁小霞, 張兆威, 張奇, 張文, 李冉, 李培武, 李鑫 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所