專利名稱：：含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(aoz)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(A0Z)的li鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
：呋喃唑酮屬硝基呋喃類藥物，動(dòng)物服用呋喃唑酮后，原藥分子在動(dòng)物體內(nèi)迅速代謝，其在體內(nèi)的穩(wěn)定性不超過幾小時(shí)，代謝的部分化合物分子與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合成為結(jié)合態(tài)，結(jié)合態(tài)可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，從而延緩原藥在體內(nèi)的清除速度。而普通的食品加工方法(如燒烤、微波加工、烹調(diào)等)難以使蛋白結(jié)合態(tài)呋喃唑酮?dú)埩粑锎罅拷到?，食用含有該殘留物的肉制品?huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用。研究表明，蛋白結(jié)合態(tài)的呋喃唑酮?dú)埩粑锖蟹Q為3-氨基一2-唑酮(AOZ)的完整側(cè)鏈，在人胃的弱酸性條件下，側(cè)鏈可以從蛋白結(jié)合態(tài)的母體分子上解離下來，A0Z可以代謝成為0—輕乙基麟，該代謝物是致突變和致癌化合物。在獸藥殘留分析中，樣品基體涉及到各種動(dòng)、植物及加工食品。分析基體本身的差別使得在分析過程中不能簡(jiǎn)單地采用傳統(tǒng)的純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來校準(zhǔn)或進(jìn)行質(zhì)量控制，需要采用基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)兩類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以滿足要求，包括證明檢測(cè)工作與所要求的標(biāo)準(zhǔn)操作程序相符或參加能力驗(yàn)證中、校準(zhǔn)儀器、用于質(zhì)量控制、解決分析中遇到的問題以及保證結(jié)果的準(zhǔn)確。歐洲委員會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有明確定義，歐盟有關(guān)農(nóng)、獸藥殘留檢測(cè)的法規(guī)性文件均提到了要采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為質(zhì)量控制手段，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證；因此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于獸藥殘留分析是十分重要的。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種含呋喃哇酮代謝物3-氨基-2-唑酮(A0Z)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，制備科學(xué)合理，可操作性強(qiáng)，制備得到的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不需冷凍可在室溫條件下長(zhǎng)期保存，可作為實(shí)物標(biāo)樣在日常檢測(cè)工作中用于建立分析方法、確定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度與精密度及在檢測(cè)質(zhì)量控制，萆用方便廣泛，品質(zhì)好。本發(fā)明的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(A0Z)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備步驟為1)將含有濃度約57iig/kg左右呋喃唑酮代謝物AOZ的鰻鱺肌肉組織按約l:4重量比例加入不含呋喃唑酮代謝物A0Z的鰻鱺肌肉組織，勻漿；2)組織勻漿后的魚漿進(jìn)行低溫冷凍干燥、第一次粉碎；3)粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行脫脂、二次粉碎均質(zhì)，混勻，過篩后成所述的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(A0Z)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明獲得的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本發(fā)明采用含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2_唑酮(A0Z)的鰻鱺肌肉為原料，制備科學(xué)合理，可操作性強(qiáng)，制備得到的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不需冷凍可在室溫條件下長(zhǎng)期保存，可作為實(shí)物標(biāo)樣在日常檢測(cè)工作中用于建立分析方法、確定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度與精密度及在檢測(cè)質(zhì)量控制，運(yùn)用方便廣泛，品質(zhì)好。圖l是本發(fā)明的制備流程圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的A0Z標(biāo)準(zhǔn)溶液(上)與鰻鱺肌肉凍干粉(下)的MRM色譜圖。具體實(shí)施例方式制備步驟為采用藥浴給藥呋喃唑酮的方式，使呋喃唑酮藥物在鰻鱺體內(nèi)代謝，對(duì)其代謝曲線進(jìn)行測(cè)定，獲得肌肉中呋喃唑酮代謝物A0Z濃度在約57ug/kg左右的鰻鱺，將鰻鱺宰殺、放血、去骨、去內(nèi)臟，取得含有呋喃唑酮代謝物AOZ的鰻鱺肌肉；所述藥浴給藥呋喃唑酮為所述藥浴給藥呋喃唑酮約為0.16mg/L，全池潑灑方式藥浴給藥，養(yǎng)鰻池日換水率約95%，給藥后第10小時(shí)開始采集樣本，之后每24小時(shí)采集一次樣本，每次取樣隨機(jī)取6條鰻鱺，宰殺、去皮、去骨，洗凈，取肌肉一并勻漿作為一個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。按GB/T21311-2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法高效液相色it"串聯(lián)質(zhì)譜法》檢測(cè)，同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量。用藥15曰后經(jīng)檢測(cè)取呋喃唑酮代謝至一平臺(tái)，取全部鰻鱺，宰殺、去皮、去骨、洗凈，待制備。將呋喃唑酮代謝物A0Z的濃度約57ug/kg左右的鰻鱺肌肉組織按約l:4比例加入不含呋喃唑酮代謝物AOZ的鰻鱺肌肉組織，勻漿；將制得的樣品按GB/T21311-2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》檢測(cè)AOZ含量，同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量。以方差檢驗(yàn)法對(duì)勻漿的魚漿進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)；組織勻漿后的魚漿進(jìn)行低溫冷凍干燥、第一次粉碎；低溫冷凍干燥的條件為樣品先置于-7(TC冰箱中預(yù)凍7個(gè)小時(shí)，取出于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥56小時(shí)后取出。粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行脫脂、二次粉碎均質(zhì)，混勻，過篩后成所述的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。步驟3的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過鋁箔袋復(fù)合膜真空獨(dú)立包裝、輻照殺菌后制備成含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(M)Z)的鰻ig肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成品。制備的凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成品經(jīng)過均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)后進(jìn)行定值及不確定值計(jì)算，獲得了最終成品。本產(chǎn)品最終定值為3.71土0.686ug/kg，樣品數(shù)據(jù)400個(gè)，獨(dú)立包裝約3g，可置于室溫保存對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行了長(zhǎng)期穩(wěn)定性(有效期)與短期穩(wěn)定性(運(yùn)輸條件下材料的穩(wěn)定性)兩種類型的穩(wěn)定性。本項(xiàng)目的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為經(jīng)典穩(wěn)定性研究，即同時(shí)制備的樣品在相同條件下隨著時(shí)間的推移進(jìn)行測(cè)量。在第4個(gè)月測(cè)定時(shí)樣品模擬運(yùn)輸條件，置于-6(TC冰柜中放置60天后于室溫下放置30天，再于70'C烘箱放置48小時(shí)后測(cè)定。另外，由于測(cè)量是在(實(shí)驗(yàn)室內(nèi))再現(xiàn)性條件下進(jìn)行的，其中也包括了測(cè)量的不穩(wěn)定性。研究證明該產(chǎn)品十分穩(wěn)定，有效期長(zhǎng)，使用方便。制備得到的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可作為實(shí)物標(biāo)樣在日常檢測(cè)工作中用于建立分析方法、確定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度與精密度及在檢測(cè)質(zhì)量控制。以下是本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。采用本發(fā)明制得了鰻鱺肌肉中呋喃唑酮代謝物AOZ的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定值為3.71土0.686ug/kg,已用于從事相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析方法的確認(rèn)和質(zhì)量控制，并保證食品分析量值溯源鏈的有效性和不間斷性。實(shí)施例l采用藥浴給藥呋喃唑酮的方式，使呋喃唑酮藥物在鰻鱺體內(nèi)代謝，對(duì)其代謝曲線進(jìn)行測(cè)定，獲得呋喃哇酮代謝物A0Z的濃度約57ug/kg左右的鰻鱺，將鰻鱺宰殺、放血、去骨、去內(nèi)臟，取得含有呋喃唑酮代謝物AOZ的鰻鱺肌肉；所述藥浴給藥呋喃唑酮為O.16iig/L，全池潑灑方式藥浴給藥，養(yǎng)鰻池日換水率約95%，給藥后第10小時(shí)開始采集樣本，之后每24小時(shí)采集一次樣本，每次取樣隨機(jī)取6條鰻鱺，宰殺、去皮、去骨，洗凈，取肌肉一并勻漿作為一個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。按GB/T21311-2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》檢測(cè)，同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量。用藥15日后經(jīng)檢測(cè)取呋喃唑酮代謝至一平臺(tái)，取全部鰻鱺，宰殺、去皮、去骨、洗凈，待制備。將呋喃唑酮代謝物A0Z的濃度約57ug/kg左右的鰻鱺肌肉組織按約l:4重量比例加入不含呋喃唑酮代謝物AOZ的鰻鱺肌肉組織，勻漿，將制得的樣品按GB/T21311-2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》檢測(cè)AOZ含量，同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量。以方差檢驗(yàn)法對(duì)勻漿的魚漿進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)；組織勻漿后的魚漿進(jìn)行低溫冷凍干燥、第一次粉碎；低溫冷凍干燥的條件為樣品先置于-70'C冰箱中預(yù)凍7個(gè)小時(shí)，取出于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥56小時(shí)后取出。粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行脫脂、二次粉碎均質(zhì)，混勻，過篩后成所述的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。步驟3的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過鋁箔袋復(fù)合膜真空獨(dú)立包裝、輻照殺菌后制備成含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成品。實(shí)施例2含呋喃唑酮代謝物AOZ樣本的獲得用于研究的樣本為格每條大小約200g300g的鰻鱺，全池潑灑方式藥浴給藥，藥浴濃度約O.16mg/L。用藥15天后采集陽性樣本。將宰殺、去皮、洗凈后的肌肉組織于一20'C冷庫(kù)保存。養(yǎng)殖過程在福建省三明市梅列區(qū)華盛特種養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。均勻?qū)嶒?yàn)材料的獲得將魚肉樣本取出，置于4'C冰箱解凍后，去皮，取魚肌肉切成小塊，置于勻漿機(jī)中，充分勻漿，將勻漿后的樣本按四分法隨機(jī)取出1/4，分裝于潔凈的塑料離心管(容量為50mL)中，密閉，制成供試樣，置于-18'C冰柜中保存。鰻鱺肌肉中水分含量較高，為便于貯存、包裝、運(yùn)輸及使用，本項(xiàng)目將其制成凍干粉。鰻鱺肌肉中含有大量脂肪，為防脂肪可能在保存過程中析出以及可能酸敗變質(zhì)，本項(xiàng)目采用正己烷脫脂。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明正已垸脫脂不會(huì)造成AOZ損失。為延長(zhǎng)保存期，本文將樣品以鈷60輻照，接收劑量為9kGY，輻照后樣品按GB/T4789.2-2003檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，檢測(cè)值〈10CFU/g。均勻性檢驗(yàn)均勻性實(shí)驗(yàn)按GB/T21311-2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》檢測(cè)，同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量，用以定量的參數(shù)見表l,譜圖見圖2。表1保留時(shí)間、母離子和子離子序號(hào)化合物母離子(M+H)子離子碰撞能量(cv)1NPAOZ23610419134112NPd4-A0Z24013412注下劃線為定量離子碎片均勻性實(shí)驗(yàn)的總樣本數(shù)共100個(gè)，順序編號(hào)后按總樣本數(shù)N的3XN1/3隨機(jī)抽取14個(gè)樣品進(jìn)行樣品均勻性實(shí)驗(yàn)，其中l(wèi)個(gè)樣品(編號(hào)2)因取樣時(shí)污染棄用。以每個(gè)檢體3個(gè)重復(fù)性條件下檢測(cè)獲得的數(shù)據(jù)為一組，共獲得15組數(shù)據(jù)；計(jì)算每組內(nèi)的均方差和組間的均方差，以及各自的自由度，顯著性水平a，按方差檢驗(yàn)給定的方法計(jì)算統(tǒng)計(jì)量F。査F分布表，找出臨界值F，進(jìn)行比較判斷，作出結(jié)論。F值岣.703〈F。.。5(14，30)=2.31，樣本是均勻的。結(jié)果見表2。6表2凍干粉的均勻性檢驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表2可見，均勻性實(shí)驗(yàn)所得F值〈F。.。5(14，30)，表明樣品間不存在明顯差異，證明制得的樣本是均勻的。穩(wěn)定性考察根據(jù)GB/T15000.3-2008，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在進(jìn)行定值時(shí)，需考慮長(zhǎng)期穩(wěn)定性(如有效期)與短期穩(wěn)定性(如運(yùn)輸條件下材料的穩(wěn)定性)兩種類型的穩(wěn)定性。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性與fe^準(zhǔn)物質(zhì)在生產(chǎn)者的貯存條件下的行為有關(guān)，短期穩(wěn)定性與樣品運(yùn)輸過程中的外部因素有關(guān)。本項(xiàng)目的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為經(jīng)典穩(wěn)定性研究，即同時(shí)制備的樣品在相同條件下隨著時(shí)間的推移進(jìn)行測(cè)量。在第4個(gè)月測(cè)定時(shí)樣品模擬運(yùn)輸條件，置于-60'C冰柜中放置60天后于室溫下放置30天，再于70'C烘箱放置48小時(shí)后測(cè)定。另外，由于測(cè)量是在(實(shí)驗(yàn)室內(nèi))再現(xiàn)性條件下進(jìn)行的，其中也包括了測(cè)量的不穩(wěn)定性。穩(wěn)定性研究的基本模型可表示為；r-A+AY+e，其中A和A為回歸系數(shù)，s為隨機(jī)誤差分量。本項(xiàng)目中作為候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是由復(fù)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)材料研制過程所得的，因而穩(wěn)定性數(shù)據(jù)采用實(shí)驗(yàn)材料研制過程所進(jìn)行的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)見表3。表3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根據(jù)表10的相關(guān)數(shù)據(jù)，回歸參數(shù)可按下式計(jì)算得到斜率的計(jì)算6,=-=——=0.0139;截距的計(jì)算6。=f-6^=5.152;通過誤差分析可以計(jì)算、和6。的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按S()=式中一^1-=0.3536，w—20.3536估計(jì)^的標(biāo)準(zhǔn)偏差，4.24260.0833;自由度為n-2和口=0.95(95%置信水平)的學(xué)生分布t因子為2.35，由于|6」</Q95,,.故斜率是不顯著的，因而未觀測(cè)到不穩(wěn)定性。瓶),定值與不確定度評(píng)估定值根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15000.3-2008"標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法"中有關(guān)技術(shù)及要求，對(duì)呋喃唑酮代謝物殘留質(zhì)量控制樣品進(jìn)行定值。采用同位素稀釋質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定(n=3)。定值結(jié)果匯總于表4。表4定值結(jié)果實(shí)驗(yàn)室編號(hào)測(cè)定結(jié)果(yg/kg)標(biāo)準(zhǔn)偏差Si第一次第二次第三次平均值0014.094.183.914.0613.750023.553,823.673.6813.530034.003.553.743.7622.590043.283.753.653.5624.760054.053.293.263.5344.770063.893.943.903.912.6460073.513.643.553.576.6580083.703.453.563.5712.530093.733.693.923.7812.290103.493.743.783.6715.72平均值(ug/kg)3.71/標(biāo)準(zhǔn)偏差S/0.1721對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)分析，包括的步驟有(1)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室平均值之間顯著性差異以此來決定是否應(yīng)該求出單個(gè)數(shù)值的平均值或?qū)嶒?yàn)室平均值的均值；(2)檢驗(yàn)根據(jù)(1)中決定選取的數(shù)據(jù)組的正態(tài)性并找出異常值；(3)檢驗(yàn)全部數(shù)據(jù)組中異常的實(shí)驗(yàn)室的方差。檢驗(yàn)過程如下(1)先對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行柯克倫(Cochran)檢驗(yàn)。給定P個(gè)由相同的n次重復(fù)測(cè)試結(jié)果計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差Si，柯克倫(Cochran)檢驗(yàn)的定義為C二^L^，柯克倫的結(jié)果判定如下判定結(jié)果正確可疑值離群值值C與臨界值Co關(guān)系C《CoCo(5%)<C《Cou%)C>Coa在p二10，11=3時(shí)，柯克倫的臨界值為C。(1W=0.536，C。<5W=0.445，而10個(gè)實(shí)驗(yàn)室的柯克倫(Cochran)檢驗(yàn)的結(jié)果為0.4881，005實(shí)驗(yàn)室的Si值最大，結(jié)果可疑，需進(jìn)一步檢驗(yàn)決定是否采用該實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。(2)對(duì)005實(shí)驗(yàn)室的最大值和最小值進(jìn)行格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)單值格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)量C^則是檢驗(yàn)該單元中最大值、是否為離群值，其中Gn則檢驗(yàn)該單元中最小值^是否為離群值，其中(^=^-a)/S;單值格拉布斯檢驗(yàn)結(jié)果判定如下9判定結(jié)果正確值可疑值離群值^與臨界值G。關(guān)系Gi《G。(5%)Go(5%)<Gl《GoU%)&>Go(1在n=3時(shí)，單值格拉布斯(Grubbs)的臨界值G咖和G。(加均為1.155，而005實(shí)驗(yàn)室的格拉布斯檢驗(yàn)結(jié)果Gu=0.6105，Glp=l.1541,屬正確值，故該單元數(shù)據(jù)可保留以參加下一步檢驗(yàn)。(3)對(duì)10個(gè)單元的均值進(jìn)行單值格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)在11=10時(shí)，單值格拉布斯(Grubbs)的臨界值G。(1W=2.482，G。(5W=2.290，而單值格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)結(jié)果G=2.0375，Glp=1.0226，所有單元的均值均可保留以參加下一步雙值格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)。4、對(duì)10個(gè)單元的均值進(jìn)行雙值格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)雙值格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)量《p則是檢驗(yàn)最大的兩個(gè)值是否為離群值，《p=is(2p-^)/isc2其中《是原數(shù)組的方差，《P-^是p個(gè)數(shù)據(jù)去除最大兩值后的方差。檢驗(yàn)量《i是檢驗(yàn)最小兩值是否為離群值，e"-《""《其中《'"是p個(gè)數(shù)據(jù)去除最小兩值后方差。雙值格拉布斯檢驗(yàn)結(jié)果判定如上判定結(jié)果正確值歧離值離群值G2與臨界值G0關(guān)系G2》G0(5%)Go(1%)《G2<Go(5%)G2<Go(1在n二10時(shí)，雙值格拉布斯(Grubbs)的臨界值G,=0.1150，G。(5=0.1864，而雙值格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)結(jié)果G21=0.7505，G2p=0.2452，因此所有單元的數(shù)據(jù)均為正確值，均可以保留并參與定值。本項(xiàng)目定值最終是協(xié)同定值實(shí)驗(yàn)室提供結(jié)果的平均值。不確定度評(píng)估根據(jù)GB/T15000.3-2008，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值不確定度的確定應(yīng)考慮的因素包括4點(diǎn)(1)材料的測(cè)定過程伴隨的不確定度；(2)用戶一般每次只用一個(gè)樣品；(3)材料被生產(chǎn)者/銷售者在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)儲(chǔ)存；(4)材料必須運(yùn)送給用戶。這些因素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)被測(cè)量值(也就是標(biāo)準(zhǔn)值)的不確定度有顯著貢獻(xiàn)，可用式l來表示x隱=u+++<-(1)式中一特性值；AA。r—由批測(cè)定得到的特性值，或在測(cè)定單個(gè)制品時(shí)，由該制品得到的特性值；&M—瓶間差異引起的誤差項(xiàng)；&to—長(zhǎng)期不穩(wěn)定性引起的誤差項(xiàng)；—短期不穩(wěn)定性引起的誤差項(xiàng)。根據(jù)GB/T15000.7"標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作導(dǎo)則(7)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者能力的通用要求"中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方式的劃分，本項(xiàng)目中采用的定值方式屬由實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)，用特定方法測(cè)量，只給出該方法評(píng)定的特性值。參與協(xié)同定值的實(shí)驗(yàn)室給出的數(shù)據(jù)格式為每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)值。CCQM(國(guó)際物質(zhì)量咨詢委員會(huì))確定的基準(zhǔn)測(cè)量方法中包括同位素稀釋質(zhì)譜法，采用同位素稀釋質(zhì)譜法進(jìn)行定值，屬基準(zhǔn)測(cè)量方法，消除了由儀器不同、樣品前處理等過程對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響。不確定度計(jì)算過程如下(雖然所有的不確定度計(jì)算過程均給出了計(jì)算公式，但全部計(jì)算過程是由EXCEL所帶的統(tǒng)計(jì)軟件完成的)(1)由協(xié)同定值實(shí)驗(yàn)室所帶來的批測(cè)定的不確定度"^,的計(jì)算由于本項(xiàng)目中參與協(xié)同定值的所有數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)，均可采納進(jìn)行定值，即本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)材料的特性值是平均值的均值，即^=K，與平均值的均值有關(guān)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的主要分量是由式(2)得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差P—lS而合成不確度為"￡^=+，在這些公式中，P代表實(shí)驗(yàn)室數(shù)。由表ll所給的數(shù)據(jù)，s為O.1721，本項(xiàng)目中0.0544。(2)由瓶間均勻性所帶來的不確定度i^的計(jì)算在預(yù)實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的均勻性研究中，瓶間均勻性已被驗(yàn)證。因此，此時(shí)的統(tǒng)計(jì)方法采用的是單因素方差分析。表5均勻性研究的測(cè)量數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>瓶間方翻的計(jì)算《=巡。隱廣風(fēng)"0.歸-謹(jǐn)36=0扁8瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差是該方差的平方根&"0.0308=0.1755重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差^==V0.0136=0.1167由瓶間均勻性所帶來的不確定度"M=、^+<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(3)由穩(wěn)定性所帶來的不確定度^,的計(jì)算根據(jù)GB/T15000.3-2008,有效期與長(zhǎng)期穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的關(guān)系見式3，其基礎(chǔ)是穩(wěn)定性數(shù)據(jù)中無顯著趨勢(shì)。r(W,^)=;rfl(i+6'x)-(3)式中假設(shè)特性值y從初始值y。以一個(gè)常數(shù)6'線性降解，6'是相對(duì)降解速率，為時(shí)間x的函數(shù)。特性值的不確定度可通過將自變量K、z和6'的不確定度傳播給因變量y得到。在給定的有效期x沒有顯著降解的情況下，可采用式4估計(jì)樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性的不確定度。(4)作為候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是由復(fù)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)材料研制過程所得的，因而穩(wěn)定性數(shù)據(jù)采用實(shí)驗(yàn)材料研制過程所進(jìn)行的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)見表8。表8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)間(月)AOZ的含量(ug/kg)04.81815.56825.14035.40345.112由于沒有一種物理/化學(xué)模型能夠真實(shí)地描述該實(shí)驗(yàn)材料的降解機(jī)理，故采用直線作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。事?shí)上，對(duì)于鰻鱺肌肉凍干粉中的特性值(AOZ含量)而言，所希望的是截距(在不確定度內(nèi))等于測(cè)定得到的值，而斜率趨近于零。2(A-;c)(y-y)根據(jù)表15相關(guān)數(shù)據(jù)，斜率的計(jì)算——^~~=0.0139;截距的計(jì)算60=;r-V-5.152;直線上的點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算S=n—20.3536與斜率相關(guān)的不確定度的計(jì)算S(&,)=,^==0.0833;724.242J2A-"自由度為n-2和p^.95(95%置信水平)的學(xué)生分布t因子為4.30，由于1、hA^,"^^fe)，故斜率是不顯著的，因而未觀測(cè)到不穩(wěn)定性。根據(jù)式4，有效期t二4月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的不確定度為"to=&.,=0.0833x4=0.3332。(4)鰻鱺肌肉凍干粉中AOZ的擴(kuò)展不確定度綜上，鰻鱺肌肉凍千粉中AOZ的擴(kuò)展不確定度是通過合成測(cè)定、均勻性和穩(wěn)定性對(duì)特性值總不確定度的貢獻(xiàn)來估計(jì)的，按式5計(jì)算"，=+《+《+"i-(5)在置信水平為95%時(shí)，A=2。由于本項(xiàng)目采用的是協(xié)同定值，通過郵政網(wǎng)絡(luò)將候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分發(fā)給各參加協(xié)同定值的實(shí)驗(yàn)室，所得到的一系列測(cè)量值已包含了運(yùn)輸不穩(wěn)定性造成的附加不確定度，另外，在進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)時(shí)，第4個(gè)月測(cè)定時(shí)樣品模擬運(yùn)輸條件，置于-60。C冰柜中放置60天后于室溫下放置30天，再于7(TC烘箱放置48小時(shí)后測(cè)定，在穩(wěn)定性不確定度中也包括了運(yùn)輸不穩(wěn)定性造成的不確定度，因此，此處的^=0。由上述計(jì)算過程中得到的各不確定度值，根據(jù)式5，鰻鱺肌肉凍干粉中AOZ的擴(kuò)展不確定度計(jì)算如下"隱=2xV0.05442+0.05942+0.33322=0.686。該不確定度是根據(jù)3個(gè)月的有效期確定的。如果材料的穩(wěn)定性得到進(jìn)一步證明，則有效期還可延長(zhǎng)。測(cè)量結(jié)果本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最終確定標(biāo)準(zhǔn)值為3.71±0.686(ng/kg)。權(quán)利要求1.一種含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，其特征在于所述制備步驟為1)將呋喃唑酮代謝物AOZ的濃度5～7μg/kg的鰻鱺肌肉組織按重量比例1∶4加入不含呋喃唑酮代謝物AOZ的鰻鱺肌肉組織，勻漿；2)組織勻漿后的魚漿進(jìn)行低溫冷凍干燥、第一次粉碎；3)粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行脫脂、二次粉碎均質(zhì)，混勻，過篩后成所述的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮AOZ的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，其特征在于所述步驟3的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過鋁箔袋復(fù)合膜真空獨(dú)立包裝、輻照殺菌后制備成含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成品。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AQZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，其特征在于所述步驟1)的含有呋喃唑酮代謝物AOZ的鰻鱺肌肉的制備方法為采用藥浴給藥呋喃唑酮的方式，使呋喃唑酮藥物在鰻鱺體內(nèi)代謝，對(duì)其代謝曲線進(jìn)行測(cè)定，獲得肌肉中含呋喃唑酮代謝物AOZ的濃度57ug/kg的鰻鱺，將鰻鱺宰殺、放血、去骨、去內(nèi)臟，取得含有呋喃唑酮代謝物AOZ的鰻鱺肌肉。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，其特征在于所述藥浴給藥呋喃唑酮為0.16mg/L，全池潑灑方式藥浴給藥，養(yǎng)鰻池日換水率95%，給藥后第10小時(shí)開始釆集樣本，之后每24小時(shí)采集一次樣本，每次取樣隨機(jī)取6條鰻鱺，宰殺、去皮、去骨，洗凈，取肌肉一并勻漿作為一個(gè)樣本進(jìn)行檢觀ij，按GB汀21311-2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》檢測(cè)，同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量，用藥15日后經(jīng)檢測(cè)取呋喃唑酮代謝至一平臺(tái)，取全部鰻鱺，宰殺、去皮、去骨、洗凈，待制備。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含呋喃哇酮代謝物3-氨基-2-唑酮(A0Z)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，其特征在于所述步驟2)中低溫冷凍干燥的條件為樣品先置于-70'C冰箱中預(yù)凍7個(gè)小時(shí)，取出于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥56小時(shí)后取出。全文摘要本發(fā)明是提供一種含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，將含有預(yù)期濃度呋喃唑酮代謝物AOZ的鰻鱺肌肉組織勻漿；組織勻漿后的魚漿進(jìn)行低溫冷凍干燥、第一次粉碎；粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行脫脂、二次粉碎均質(zhì)，混勻，過篩后成所述的含呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)的鰻鱺肌肉凍干粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本發(fā)明制備科學(xué)合理，可操作性強(qiáng)，制備得到的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不需冷凍可在室溫條件下長(zhǎng)期保存，可作為實(shí)物標(biāo)樣在日常檢測(cè)工作中用于建立分析方法、確定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度與精密度及在檢測(cè)質(zhì)量控制，運(yùn)用方便廣泛，品質(zhì)好。文檔編號(hào)C07D263/26GK101504341SQ200910111188公開日2009年8月12日申請(qǐng)日期2009年3月10日優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日發(fā)明者方楊申請(qǐng)人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心