專利名稱：Hla結合肽，以及編碼所述hla結合肽的dna片段和重組載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及HLA結合肽，以及編碼該HLA結合肽的DNA片段和重組載體。
背景技術：
對癌細胞具有特異性的癌癥抗原呈遞在癌細胞表面上時，當癌細胞被識別為自體外來物質，結果進行天然免疫反應，并且隨后誘發(fā)特異性免疫反應時，是有機會因此引起消滅癌細胞的反應。
誘發(fā)特異性免疫反應時，體液中癌細胞衍生的片段等被中和抗體消滅，癌細胞本身被細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)所消滅。即，CTL特異性識別存在于癌細胞表面上HLA I類分子中的、由8-11個氨基酸組成的癌癥抗原(CTL表位)，并通過破壞癌細胞消滅癌。因此，為了開發(fā)癌癥的治療用疫苗，鑒定這樣的癌癥特異性CTL表位是很關鍵的。
這種技術從專利公開1中已知。專利公開1陳述了由特異性氨基酸序列形成的寡肽具有與HLA結合的性質。
日本專利申請公開No.H8-151396(1996)發(fā)明內容但是，上述公開中記述的傳統(tǒng)技術考慮到以下幾點有改進的空間。
首先，尚不清楚上述公開的HLA結合肽是否與HLA分子有效結合，根據(jù)HLA-結合的性質，仍有改進的空間。
其次，已證明上述公開的HLA-結合肽具有與HLA-DQ4結合的性質。但是，尚不清楚其是否與常見于歐美人中的HLA-A2分子(HLA-A*0201基因等的產(chǎn)物)，以及常見于日本人中的HLA-A24分子(HLA-A*2402等的產(chǎn)物)相結合。
本發(fā)明在上述情況下完成，其目的是提供表現(xiàn)出與特異型HLA分子高親和力結合的HLA-結合肽。
根據(jù)本發(fā)明，提供了與HLA-A型分子結合的HLA-結合肽，該HLA-結合肽含有至少一種類型的選自SEQ ID NOS1至60的氨基酸序列，并由不少于8個并且不超過11個氨基酸殘基組成。
此外，根據(jù)本發(fā)明，提供了HLA-結合肽，包含至少一種類型的選自SEQ ID NOSI、2、3、4、5、6、7、10、14、29、30、31、33、38、39、40、43、44、49和51的氨基酸序列。
此外，根據(jù)本發(fā)明，提供了與HLA-A型分子結合的HLA-結合肽，該HLA-結合肽含有通過對包含在上述HLA-結合肽中的氨基酸序列的一或兩個氨基酸殘基進行缺失、置換或添加而形成的氨基酸序列，并由不少于8個且不超過11個氨基酸殘基組成。
以這種方法，含有通過對具有與HLA-A型分子結合性質的特異性氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸殘基進行缺失、置換或添加而形成的氨基酸序列的構建體，也能表現(xiàn)與上述HLA-結合肽相似的作用。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供了含有編碼上述HLA-結合肽的DNA序列的DNA片段。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供了含有編碼上述HLA-結合肽的DNA序列的重組載體。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供了在哺乳動物體內轉變?yōu)樯鲜鯤LA-結合肽的HLA-結合肽前體。
上文說明了本發(fā)明的構建體，但是這些構建體的任何組合作為本發(fā)明的實施方案也有效。此外，將本發(fā)明的表達方式轉化為另一種類別(category)作為本發(fā)明的實施方案也有效。
根據(jù)本發(fā)明，由于其包括特異性氨基酸序列，可以得到與HLA-A型分子具有優(yōu)異的結合性質的HLA-結合肽。


上述目的、其它目的、特征和優(yōu)勢根據(jù)下文說明的優(yōu)選實施方案參考附圖將變得更為顯見。
說明用于實施方案中的主動學習實驗設計的示意圖。
實施發(fā)明的最佳方式實施本發(fā)明的方式在下文通過參考

。在所有的附圖中，同樣的構件用同樣的參考數(shù)字和符號表示，從而不用重復解釋。
實施方案1在本實施方案中，一種含有與HLA分子結合的氨基酸序列的肽，通過用主動學習實驗方法(日本專利申請公開No.H11-316754(1999))得到的假設預測，-log Kd值是3或更高，由不少于8并且不超過11個氨基酸殘基組成，用來作為HLA-結合肽的候選物。結合試驗的結果證實這些肽實際上是HLA-結合肽。
結果，可以有效得到大量具有與HLA-A型分子結合的優(yōu)異性質的HLA-結合肽，由于它們含有的氨基酸序列與HLA分子結合的-logKd值為3或更高。
具體而言，與本實施方案有關的HLA-結合肽是與HLA-A型分子結合的HLA-結合肽，含有至少一種類型選自將在下文中描述的SEQ ID NOS1至60的氨基酸序列，并由不少于8并不超過11個氨基酸殘基組成。
在人HLA-A型中，大約50％的日本人具有HLA-A24型。很多歐美人如德國人具有HLA-A2型。
本文提到的所有這些序列是由包含在癌癥抗原WT1的某個基因組蛋白中的9個氨基酸殘基組成的序列。
SEQ ID NOS1至30的序列在下面的表1中給出表1HLA-A24-結合肽

SEQ ID NOS1至30的序列是由包含在癌癥抗原WT1的某個基因組蛋白中的9個氨基酸殘基組成。SEQ ID NOS1至30的序列是由上述方法預測具有與HLA-A24分子優(yōu)異結合的序列。SEQ ID NOS1至30按照結合等級降低排列。即，SEQ ID NO1是據(jù)預測具有最佳結合的序列。預測的與HLA-A24分子的結合分值和每個序列的結合實驗數(shù)據(jù)以-log Kd值的形式表達。
SEQ ID NOS31至60的序列在下面的表2中給出。
表2HLA-A2-結合肽

SEQ ID NOS31至60的序列是由包含在癌癥抗原WT1的某個基因組蛋白中的9個氨基酸殘基組成的序列。SEQ ID NOS31至60的序列是由上述方法預測具有與HLA-A24分子優(yōu)良結合的序列。SEQ ID NOS31至60按照結合等級降低排列。即，SEQ ID NO31是據(jù)預測具有最佳結合的序列。預測的與HLA-A2分子結合的記分和每個序列的結合實驗數(shù)據(jù)以-log Kd值的形式表示。
雖然詳細資料在后文描述，但是很清楚在預測記分和結合實驗數(shù)據(jù)之間有相關性。即，雖然有輕微誤差，但是可以說上述方法預測的與HLA-A分子高度結合的肽在實驗中發(fā)現(xiàn)與HLA-A分子有高水平結合。
由于沒有傳統(tǒng)技術通過利用所述實驗設計方法發(fā)現(xiàn)HLA-結合肽，所以只有很少量的HLA-結合肽被實驗證實具有HLA-結合特性。為此，甚至在通過傳統(tǒng)方法隨機合成9個氨基酸殘基組成的肽，并進行實驗以發(fā)現(xiàn)其是否與HLA分子結合時，僅僅有約1/100的概率發(fā)現(xiàn)一個-log Kd值超過6的結合。
根據(jù)本實施方案，由于采用了如上所述的利用實驗設計方法發(fā)現(xiàn)HLA-結合肽的技術，發(fā)現(xiàn)了多達60個HLA-結合肽的序列。此外，當某些得到的HLA-結合肽的結合性得到實驗檢測時，證實了經(jīng)受實驗的所有序列都顯示了與HLA的極好結合，等于或高于預測的水平。
這些序列中，含有至少一種類型選自SEQ ID NOS1、2、3、4、5、6、7、10、14、29、30、31、33、38、39、40、43、44、49和51的氨基酸序列的HLA-結合肽，被實驗證實與人HLA-A型分子結合。因此可以肯定地說，它是在與人HLA-A型分子結合方面具有優(yōu)良特性的HLA-結合肽。
本實施方案相關的與HLA-結合肽的HLA分子的結合的-log Kd值為3或更高，尤其優(yōu)選5或更高，更優(yōu)選5.4或更高。
在生化領域，已知結合能力，根據(jù)-log Kd值約為3是肽實際上是否與MHC結合的閾值水平。因此，如果與HLA分子的結合根據(jù)-log Kd值為3或更高，就可以說其為HLA-結合肽。
此外，如果與HLA分子的結合根據(jù)-log Kd值為5或更高，由于所得的肽在與HLA分子結合上具有優(yōu)良的性質，其適合用于開發(fā)免疫疾病等的有效治療藥、預防藥等。
另外，如果與HLA分子的結合根據(jù)-log Kd值為5.4或更高，所得的肽在與HLA分子結合上具有優(yōu)良的性質，其適合用于開發(fā)免疫疾病等的更為有效的治療藥、預防藥等。
此外，可以將與本實施方案有關的HLA-結合肽設置成由不少于8個且不超過11個氨基酸殘基組成。
以這種方式，如果肽由不少于8個并且不超過11個氨基酸殘基組成，其在與HLA分子的結合上具有優(yōu)良的性質。此外，細胞毒性T淋巴細胞(CTL)特異性識別對癌細胞特異的癌癥抗原(CTL表位)，并通過只破壞癌細胞消滅癌細胞，所述癌癥抗原由8-11個氨基酸組成、存在于癌細胞表面上的HLA I類分子中。這對于制備所述由8-11個氨基酸組成的、對癌細胞等特異的CTL表位，以便制備治療或預防癌癥等的疫苗是很重要的。
例如，上述HLA-結合肽可以是單獨由氨基酸殘基組成的肽，但是并不特別受此限制。例如，只要本發(fā)明的效果不受損，它可以是任選用糖鏈或脂肪酸基團修飾的HLA-結合肽前體。所述前體經(jīng)過在活哺乳動物體內如人類消化器官中被消化酶等消化，改變成為HLA-結合肽，進而表現(xiàn)出與上述HLA-結合肽所顯示的相似的作用。
此外，上述HLA-結合肽可以是與人HLA-A24分子結合的肽。
根據(jù)這樣的組成，由于所得的肽與常見于亞洲人如日本人的HLA-A24分子結合，其可以用于開發(fā)對亞洲人如日本人特別有效的治療藥、預防藥等。
另外，上述HLA-結合肽可以是與人HLA-A2分子結合的肽。
根據(jù)這樣的組成，由于所得的肽與常見于歐美人的HLA-A2分子結合，其可以用于開發(fā)對歐美人特別有效的治療藥、預防藥等。
含在上述HLA-結合肽的氨基酸序列可以是來自癌癥抗原WT1蛋白的氨基酸序列，但是并不特別受此限制。例如，其可以是來自HIV蛋白的氨基酸序列，或來自雪松花粉蛋白等的氨基酸序列。而且，它可以含有來自具有其他致病性或致敏性的蛋白的氨基酸序列。
實施方案2根據(jù)本實施方案，提供了與HLA-A型分子結合，含有通過對包含在上述HLA-結合肽中的氨基酸序列的一個或兩個氨基酸殘基進行缺失、置換或添加而形成的氨基酸序列，并由不少于8個并且不多于11個氨基酸殘基組成的HLA-結合肽。
如在后文所描述，即使組成中包括了通過對與HLA-A型分子結合的特定氨基酸序列的一個或數(shù)個氨基酸殘基進行缺失、置換或添加而形成的氨基酸序列，仍表現(xiàn)出與上述實施方案1有關的HLA-結合肽相似的作用。
即，可以預測，即使氨基酸序列是通過對顯示在SEQ ID NOS1至50中、具有與HLA-A24分子的優(yōu)良結合性的氨基酸序列的一個或兩個氨基酸殘基進行缺失、置換或添加而形成，仍將以相似的方式表現(xiàn)出優(yōu)良的HLA-結合性。
從另一個觀點來看，可以預測，即使氨基酸序列是通過對上述方法預測的、具有與HLA-A24分子優(yōu)良結合性的氨基酸序列的一個或數(shù)個氨基酸殘基進行缺失、置換或添加而形成，仍將以相似的方式表現(xiàn)出優(yōu)良的HLA-結合性。被置換的氨基酸殘基優(yōu)選彼此具有相似性質的氨基酸殘基，如二者均為疏水氨基酸殘基。
此外，實施方案1和實施方案2中描述的HLA-結合肽可以利用本領域技術人員已知的方法生產(chǎn)。例如，它們可以通過固相法或液相法人工合成。或者，這些HLA-結合肽可以通過編碼這些HLA-結合肽的DNA片段或重組載體對其進行表達而生產(chǎn)。這樣得到的這些HLA-結合肽可以通過本領域技術人員已知的方法鑒定。例如，可能通過使用Edman降解法、質譜法等鑒定。
實施方案3根據(jù)本實施方案，提供了含有編碼上述HLA-結合肽的DNA序列的DNA片段。由于本實施方案有關的DNA片段含有特異性DNA序列，其可以表達上述HLA-結合肽。
當上述HLA-結合肽通過使用本實施方案有關的DNA片段表達時，可以通過將該DNA片段摻入細胞進行表達，或者可以通過使用市售人工蛋白表達盒進行表達。
另外，持續(xù)的表達可以通過將上述DNA片段摻入例如人類細胞進行。因此，HLA-結合肽可以制成在細胞內持久存在，方法是通過將編碼HLA-結合肽的DNA片段摻入細胞，而不是將HLA-結合肽本身摻入細胞。當HLA-結合肽用作疫苗時，所述持續(xù)表達的能力在提高疫苗有效性方面是有利的。
此外，本實施方案有關的DNA片段可以通過本領域技術人員已知的方法生產(chǎn)。例如，可以依靠市售DNA合成儀等人工合成。或者，可以通過使用限制型酶等從HCV基因組切割片段?；蛘?，可以通過用引物進行PCR法從HCV基因組擴增。這樣得到的DNA片段可以用本領域技術人員已知的方法鑒定。例如，可以通過市售DNA測序儀鑒定。
實施方案4根據(jù)本實施方案，提供了含有編碼上述HLA-結合肽的DNA序列的重組載體。由于本實施方案有關的重組載體含有特異性的DNA序列，可以表達上述HLA-結合肽。
當上述HLA-結合肽通過使用本實施方案有關的重組載體表達時，可以通過將該重組載體摻入細胞進行表達，或者可以通過使用市售人工蛋白表達盒進行表達。
此外，持續(xù)的表達可以通過將上述重組載體摻入例如人類細胞進行。因此，HLA-結合肽可以通過將編碼HLA-結合肽的重組載體摻入細胞，而不是將HLA-結合肽本身摻入細胞制成在細胞內持久存在。當HLA-結合肽用作疫苗時，所述持續(xù)表達的能力在提高疫苗有效性方面是有利的。
另外，在上述重組載體中，HLA-結合肽的表達量，可以通過使用在參與轉錄和表達的調節(jié)區(qū)中的某個序列，如編碼上述HLA-結合肽的DNA序列的上游啟動子區(qū)，進行高精確度的控制。而且，重組載體在細胞中的拷貝數(shù)，可以使用參與復制的調節(jié)區(qū)的某個序列，如重組載體的復制起始點(origin)區(qū)進行高精確度的控制。
此外，上述重組載體可以自由地包含除編碼上述HLA-結合肽的DNA序列以外的序列。例如，可以包含標記基因如耐藥基因。
另外，本實施方案有關的重組載體可以用本領域技術人員已知的方法生產(chǎn)。例如，可以通過在某個限制型酶切位點，裂解市售載體如pBR322或pUC19的多克隆位點，將上述DNA片段插入該位點，并進行連接獲得。此外，這樣得到的重組載體可以利用本領域技術人員已知的方法鑒定。例如，其可以通過瓊脂糖凝膠電泳證實被預先的限制酶裂解的DNA片段的長度是否符合市售載體如pBR322或pUC19的限制性圖譜，此外，它可以通過DNA測序儀等鑒定上述DNA序列是否包含在從多克隆位點上切下來的DNA序列中。
以上說明了本發(fā)明的組成，但是這些組成的任何組合，作為本發(fā)明的實施方案也有效。此外，將本發(fā)明的表達轉化為另一個類型，作為本發(fā)明的實施方案也是有效的。
例如，在上述實施方案中，HLA-結合肽含有來自癌癥抗原WT1的某個基因組蛋白(SEQ ID NO61)的氨基酸序列，但是不同于WT1的病原體如HIV病毒的HLA-結合肽也可使用，并且含有來自蛋白質如雪松花粉過敏原等的氨基酸序列的HLA-結合肽也可使用。
這樣，如果含有上述方法預測的具有優(yōu)良HLA-結合性質的氨基序列，可以預期，當用實驗進行證實時，其將以相似的方式表現(xiàn)出優(yōu)良的HLA-結合性質。因此，這些HLA-結合肽能主要適用于治療或預防感染性疾病(流感，SARS，HIV，HCV等)，并也能用于癌癥免疫療法、過敏性疾病(花粉過敏(干草熱(hay fever))，風濕、遺傳性過敏癥、哮喘等)、自身免疫疾病等。
(實施例1)參考實施例在下面進一步說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不限于此。
具體而言，本實施例中預測、實驗和評價過程基于主動學習實驗設計進行，并且大體上重復了下列步驟。這里采用的主動學習實驗設計的示意圖示于圖1中。
(1)進行一次后文描述的低階學習算法(lower-order learningalgorithm)的試驗。即，從累積的數(shù)據(jù)中隨機抽樣產(chǎn)生多個假設，至于隨機表達的候選查詢點(肽)，選擇表現(xiàn)出預測值最大分布的點作為進行實驗的查詢點。
(2)所選的查詢點的肽以合成和提純的方法制備，后文加以描述，實際結合能力以將在后文描述的實驗測定，并添加到累積的數(shù)據(jù)中。
在本實施例中，作為低階學習算法，運用了隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model)的監(jiān)督學習算法，用223種類型的肽作為初始資料開始，每個實驗預測和選擇20-30類型的肽；上述步驟重復四次，總共得到341個數(shù)據(jù)點。
更具體說，在本實施例的主動學習方法中，每個實驗設計并合成了20-30種類型的含有氨基酸序列的肽，其中設置(arrange)了20類型的氨基酸中9類。測定其與HLA分子的結合強度(結合力)。得到結合力(在摩爾濃度中的Kd值)為實驗結果。當結合力高時，該肽被選擇作為能用作疫苗材料的HLA-結合肽的候選物。
這樣得到的結果輸入配有采用隱馬爾可夫模型作為數(shù)學算法的學習機的學習系統(tǒng)中，并創(chuàng)建規(guī)則。學習機從不同結果取樣，準備規(guī)則。學習機表達的規(guī)則有不同的組成。這樣得到的規(guī)則和實驗數(shù)據(jù)根據(jù)需要保存作為累積數(shù)據(jù)。
從超過5000億(＝209)的肽序列中，用規(guī)則選擇后續(xù)實驗的候選物，重復上述過程。在此階段，不同的規(guī)則用于實驗候選物，實驗結果的預測有分歧的候選物接受實驗。這樣，由于實驗結果的預測有分歧的候選物接受隨后實驗，就提高了預測的最終精確度。
這樣，多個學習機進行選樣，其中選擇會給出不同預測的樣本作為實驗候選物，能夠得到有效信息，并得到高精確度的假設(規(guī)則)。如后文實施例所述，重復上述過程四次，給出了極好的結果。重復七次或更多次給出了更好的結果。
根據(jù)這樣的主動學習方法，可以減少對9個氨基酸殘基組成的肽的結合實驗的重復次數(shù)，否則不得不對HLA-結合肽的所有候選物的5000億或更多組合進行實驗。在主動學習方法中，通過實驗形成規(guī)則，對用規(guī)則預測的數(shù)十個序列候選物重復進行實驗。因此，可以削減實驗次數(shù)，并且大幅減少起始篩選的時間和成本。
此外，通過用主動學習方法得到的規(guī)則預測的肽與HLA結合的命中率(hit rate)可達到70-80％，而其它已知技術如錨法(anchormethod)的命中率則低達約30％。
<肽的合成和提純>
以Merrifield固相法用Fmoc氨基酸手工合成肽。在脫保護后，用C18柱進行反相HPLC提純，純度為95％或更高。肽的鑒定和其純度的確定用MALDI-TOF質譜(Voyager DE RP，PerSeptive)進行。肽的定量分析以Micro BCA分析(Pierce Corp.)用BSA作為標準蛋白進行。
<肽與HLA-A24分子的結合實驗>
肽與HLA-A*2402基因產(chǎn)物的HLA-A24分子的結合力，用表達HLA-A24分子的C1R-A24細胞測定(細胞由在Ehime大學MasakiYasukawa助教的許可下供應Kumamoto大學的Masafumi Takiguchi教授制備)。
C1R-A24細胞首先暴露在pH 3.3的酸性條件下30秒，從而解離并脫去通常與HLA I類分子結合的輕鏈β2m，以及原來與HLA-A*2402分子結合的內源肽。中和后，在C1R-A24細胞中加入純化的β2m，將所得的產(chǎn)物加入肽的系列稀釋液中，在冰上孵育4小時。用熒光標記的單克隆抗體17A12進行染色，所述抗體能識別三個組成部分的結合體(MHC-pep)，即HLA-A*2402分子、肽和β2m，它們在孵育期間再結合。
隨后，每個C1R-A24細胞的MHC-pep計數(shù)(與上述熒光抗體的熒光強度成比例)用FACScan熒光激活細胞分類器(BectonDickinson Biosciences)進行定量測定。HLA-A24分子和肽之間的結合解離常數(shù)Kd值從每個細胞的平均熒光強度通過已發(fā)表的方法(Udakaet al.，Immunogenetics，51，816-828，2000)計算。
<肽與HLA-A2分子的結合實驗>
肽與HLA-A*0201基因產(chǎn)物的HLA-A2分子的結合能力用表達HLA-A*0201的JY細胞株進行測定。
JY細胞首先暴露在pH 3.8的酸性條件下30秒，從而解離并脫去與HLA-A*0201分子非共價結合的輕鏈β2m和內源肽。中和后，進行再結合實驗。
上述JY細胞和純化的β2m加至要測定結合力的肽的梯級稀釋液中，在冰上孵育4小時。在該點再結合的HLA-A*0201分子用結合型特異性熒光標記的單克隆抗體BB7.2染色。
隨后，每個細胞的熒光量用流式細胞儀測定，并通過已發(fā)表的方法計算在摩爾濃度中的解離常數(shù)Kd值(Udaka et al.，Immunogenetics，51，816-828，2000)。
<結果評價>
得到了示于上文中表1和2中的預測結果和實驗結果。
表1中SEQ ID NOS1-30的序列是由包含在GENEBANK登記的某個WT1蛋白的全長序列中的9個氨基酸殘基組成的序列。此外，SEQ ID NOS1-30的序列如實施方案1所述的實驗設計方法得到的假設所預測，是與HLA-A24分子有優(yōu)異結合的序列。SEQ ID NOS1-30以結合力降序排列。即，SEQ ID NO1是預測的具有最佳結合力的序列。WT1的確定的基因組蛋白的全長氨基酸序列顯示在SEQID NO61中。
表1顯示了用上述預測程序、預測分數(shù)和相應的結合實驗數(shù)據(jù)得到的預測結果中，分數(shù)優(yōu)異的30個氨基酸序列。所有的結合實驗數(shù)據(jù)，通過上述的合成方法，以人工合成WT1肽序列獲得。
此外，表2中的SEQ ID NOS31-60的序列是包含在GENEBANK登記的WT1的某個蛋白全長序列中的9個氨基酸殘基組成的序列。此外，SEQ ID NOS31-60的序列如實施方案1所述的實驗設計方法得到的假設所預測，是與HLA-A2分子有優(yōu)異結合的序列。SEQ ID NOS31-60以結合力降序排列。即，SEQ ID NO31是預測具有最佳結合力的序列。
WT1的某個蛋白的全長序列顯示在SEQ ID NO61中。(MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL)。
表2顯示了用上述預測程序、預測分數(shù)和相應的結合實驗數(shù)據(jù)得到的預測結果中，分數(shù)優(yōu)異的30個氨基酸序列。所有的結合實驗數(shù)據(jù)，通過上述的合成方法，以人工合成的WT1肽序列獲得。
可以預測，由一個或兩個氨基酸殘基彼此置換形成的任何肽序列，將顯示出與HLA-分子優(yōu)異的結合?？傊词拱被嵝蛄型ㄟ^顯示在SEQ ID NOS1-60、與HLA-A分子有優(yōu)異結合性的氨基酸序列的一個或幾個氨基酸殘基的缺失、置換或添加而形成，可以預測會同樣顯示優(yōu)異的HLA-結合性質。
從另一個觀點來看，即使氨基酸序列是通過如實施方案1所述的實驗設計方法獲得的假設所預測的、具有與HLA-A分子優(yōu)異結合力的氨基酸序列的一個或幾個氨基酸殘基的缺失、置換或添加而形成，可以類似地說顯示了優(yōu)異的HLA-結合性質。置換的氨基酸殘基優(yōu)選彼此性質相似的氨基酸殘基，如兩個疏水氨基酸殘基。
發(fā)明人之一的Udaka等人已報告，即使通過置換肽序列中的一個或兩個氨基酸殘基而形成的肽序列，也將類似地顯示與抗原遞呈分子的優(yōu)異結合性質。
1.″Decrypting the structure of MHC-I restricted CTL epitopeswith complex peptide libraries.″Keiko Udaka，Karl-Heinz Wiesmuller，Stefan Kienle，Gunter Jung and Peter Walden.J.Exp.Med.181，2097-2108(1995).
2.″Tolerance to amino acid variations in peptides binding to theMHC class I protein H-2Kb.″Keiko Udaka，Karl-Heinz Wiesmuller，Stefan Kienle，Gunter Jung and Peter Walden.J.Biol.Chem.270，24130-24134(1995).
3.″Self MHC-restricted peptides recognized by all alloreactive Tlymphocyte clone.″Keiko Udaka，Karl-Heinz Wiesmuller，Stefan Kienle，Gunter Jung and Peter Walden.J.Immunol.157，670-678(1996).
因此，可以預測，即使本發(fā)明所述的癌癥抗原WT1衍生的肽，甚或上述通過置換肽序列中一個或兩個氨基酸殘基形成的肽序列，將類似地顯示與HLA-A分子的優(yōu)異結合性。
本發(fā)明參考實施例進行上述說明。這些實施例僅作為實施例的示例，本領域的技術人員應當了解可能有多種修改的實施例，并且這樣的修改的實施例包括在本發(fā)明的范圍內。
序列表<110>日本電氣株式會社(NEC Corporation)國立大學法人高知大學(Kochi University)<120>HLA結合肽，以及編碼所述HLA結合肽的DNA片段和重組載體(HLA binding peptides，DNA fragment encoding the same and recombinant vector)<130>SCT071173-66<160>61<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe1 5
<210>4<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile1 5
<210>8<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>11Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu1 5
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Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala435 440 445Leu
權利要求
1.一種與HLA-A型分子結合的HLA-結合肽，所述HLA-結合肽包括至少一種類型選自SEQ ID NOS1至60的氨基酸序列，并且不少于8個且不超過11個氨基酸殘基。
2.權利要求1所述的HLA-結合肽，包括至少一種類型選自SEQID NOS1，2，3，4，5，6，7，10，14，29，30，31，33，38，39，40，43，44，49和51的氨基酸序列。
3.一種與HLA-A型分子結合的HLA-結合肽，所述HLA-結合肽包括通過對權利要求1或2所述的HLA-結合肽中包含的所述氨基酸序列的一個或兩個氨基酸殘基進行缺失、置換或添加而形成的氨基酸序列，并且不少于8個且不超過11個氨基酸殘基。
4.權利要求1至3任一項所述的HLA-結合肽，其中所述HLA-結合肽與人HLA-A24分子結合。
5.權利要求1至3任一項所述的HLA-結合肽，其中所述HLA-結合肽與人HLA-A2分子結合。
6.包括編碼權利要求1至5任一項所述的HLA-結合肽的DNA序列的DNA片段。
7.包括編碼權利要求1至5任一項所述的HLA-結合肽的DNA序列的重組載體。
8.在哺乳動物體內改變?yōu)闄嗬?至5任一項所述的HLA-結合肽的HLA-結合肽前體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與HLA－A型分子結合的HLA－結合肽，所述HLA－結合肽包括至少一種類型選自SEQ ID NOS1至60的氨基酸序列，并且不少于8個且不超過11個氨基酸殘基。由預測程序，利用圖1所示的主動學習實驗方法預測，所有的氨基酸序列都具有與人HLA－A24分子或人HLA－A2分子結合的性質。
文檔編號C07K7/06GK101031648SQ20058003156
公開日2007年9月5日 申請日期2005年9月13日 優(yōu)先權日2004年9月17日
發(fā)明者宮川知也, 宇高惠子 申請人:日本電氣株式會社, 國立大學法人高知大學