專利名稱：抗－ox40l抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及抗-OX40L抗體，并且特別地涉及不結(jié)合補(bǔ)體因子C1q的抗-OX40L抗體，涉及其藥物組合物及應(yīng)用。優(yōu)選地，這些抗體是人的或人源化的抗體。
當(dāng)CD40/CD40L連接時(shí)，人OX40L(gp34，SwissProt P23510)在活化的B細(xì)胞和樹突細(xì)胞上表達(dá)，并且在炎癥組織的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)(綜述Weinberg，A.D.，Trends Immunol.23(2002)102-109)。它首次從HTLV-1感染的人白血病細(xì)胞中分離出來(這些T細(xì)胞通過與OX40產(chǎn)生autokrine環(huán)而無限增殖)。例如，OX40L和針對(duì)其的抗體在下列各項(xiàng)中提及WO95/12673；WO 95/21915；WO 99/15200；Baum，P.R，等.，EMBO J.13(1994)3992-4001；Imura，A.，等.，Blood 89(1997)2951-2958；Imura，A.，等.，J.Exp.Med.183(1996)2185-2195；Kjaergaard，J.，等.，J.Immunol.167(2001)6669-6677；Lane，P.，J.Exp.Med.191(2000)201-206；Mallett，S.，和Barclay，A.N.，Immunol.Today 12(1991)220-223；Mallett，S.，等.，EMBO J.9(1990)1063-1068；Ndhlovu，L.C.，等.，J.Immunol.167(2001)2991-2999；Ohshima，Y.，等.，J.Immunol.159(1997)3838-3848；Rogers，P.R.，等.，Immunity 15(2001)445-455；Stüber，E.，和Strober，W.，J.Exp.Med.183(1996)979-989；Stüber，E，等.，Gastroenterology 115(1998)1205-1215；Takahashi，Y.，等.，J.Virol.75(2001)6748-6757；Takasawa，N.，等.，Jpn.J.Cancer Res.92(2001)377-382；Taylor，L.，和Schwarz，H.，J.Immunol.Meth.255(2001)67-72；Weinberg，A.D.，等.，Nature Medicine 2(1996)183-189；Weinberg，A.D.，等.，Semin.Immunol.10(1998)471-480；Weinberg，A.D.，Trends Immunol.23(2002)102-109；Wu，T.，等.，Transplant.Proc.33(2001)217-218；Higgins，L.M.，等.，J.Immunol.162(1999)486-493；和Yoshioka，T，等.，Eur.J.Immunol.30(2000)2815-2823。人OX40L是在活化的CD4+T細(xì)胞上瞬時(shí)表達(dá)的人OX40(CD134)的配體。其配體結(jié)合OX40引起T細(xì)胞活化的共刺激性信號(hào)。描述了產(chǎn)生雙向信號(hào)的OX40/OX40L相互作用(Matsumura，Y.，等.，J.Immunol.163(1999)3007-3011；Kotani，A.，等.，Immunol.Lett.84(2002)1-7)。此外，OX40/OX40L相互作用調(diào)控活化的T細(xì)胞與炎癥組織的內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。由于OX40L只是在活化的B細(xì)胞、DC和內(nèi)皮細(xì)胞上瞬時(shí)表達(dá)，所以，針對(duì)OX40L的抗體應(yīng)該在炎性應(yīng)答中選擇性地阻斷T細(xì)胞活化和內(nèi)皮細(xì)胞黏附，而使得未活化的、外周T細(xì)胞不受影響。Yoshioka，A.，等.(Eur.J.Immunol.30(2000)2815-2823)證明了中和抗-mOX40L mAb在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中的治療潛力。它的施用顯著地改善疾病的嚴(yán)重性。在其它相關(guān)疾病模型中，例如，炎性皮膚病、試驗(yàn)性自體免疫疾病(EAE)、GVHD、泌尿炎性腸病(urine inflammatory boweldisease)，這種抗體表現(xiàn)出相似的活性(Yoshioka，A.，等.，Eur.J.Immunol 30(1999)2815-2823；Salek-Ardakani，S.，等.，J.Exp.Med.198(2003)315-324；Burgess，J.K.，等.，J.Allergy Clin.Immunol.113(2004)683-689；Hoshino，A.，等.，Eur.J.Immunol.33(2003)861-869；Arestides，R.S.，等.，Eur.J Immunol.32 (2002)2874-2880；Nohara，C.，等.，J.Immunol.166(2001)2108-2115；Weinberg，A.D.，等.，J.Immunol.162(1999)1818-1826；Higgins，L.M.，等.，J.Immunol.162(1999)486-493；Humphreys，I.R.，等.，J.Exp.Med.198(2003)1237-1242；Akiba，H.，等.，J.Exp.Med.191(2000)375-380；Ishii，N.，等.，Eur.J.Immunol.33(2003)2372-2381；Blazar，B.R.，等.，Blood 101(2003)3741-3748；Tsukada，N.，等.，Blood 95(2000)2434-2439；Akiba，H.，等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.251(1998)131-136)。
已經(jīng)研究針對(duì)OX40L的抗體在各種疾病模型中的消炎作用(Sugamura，K.，等.，Nat.Rev.Immunol.4(2004)420-431)。
Tanaka，Y.，等，Int.J.Cancer 36，(1985)549-555；Tozawa，H，等.，Int.J.Cancer 41(1988)231-238；和Miura，S.，等.，Mol.Cell.Biol.11(1991)1313-1325描述了命名為TARM-34和TAG-34的小鼠單克隆抗體，其與攜帶人T細(xì)胞I型白血病毒(HTLV-I)的人淋巴細(xì)胞系的表面抗原反應(yīng)。TAG-34抗體可從MBL國際公司商購。TAG-34也與OX40L結(jié)合。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種抗體，優(yōu)選地一種單克隆抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，含有來自人源的Fc片段，并且不結(jié)合在NK細(xì)胞上的人補(bǔ)體因子C1q和/或人Fcγ受體。
本發(fā)明還涉及一種抗體，優(yōu)選地一種單克隆抗體，其特征在于所述抗體含有來自人源的Fc片段，在100ng的抗體濃度中與OX40L和變性的OX40L(在蛋白質(zhì)印跡中)結(jié)合。這一抗體結(jié)合到與單克隆抗體LC.001結(jié)合的相同表位的OX40L多肽表位上。這樣的抗體為，例如，LC.001、LC.033和LC.060。這些抗體優(yōu)選地為人IgG1型(野生型)，或不結(jié)合在NK細(xì)胞上的人補(bǔ)體因子C1q和/或人Fcγ受體。
本發(fā)明還涉及一種結(jié)合OX40L的抗體，其特征在于包括可變輕鏈和可變重鏈，特征在于所述可變重鏈包括CDR1、CDR2和CDR3，CDR3特征在于選自SEQ ID NOs33-38。特別優(yōu)選地，CDR1選自SEQ ID NOs21-25，CDR2選自SEQ ID NOs26-32以及CDR3選自SEQ ID NOs33-38。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地以包括可變輕鏈和可變重鏈為特征，特征在于所述可變輕鏈包括CDR1、CDR2和CDR3，CDR3特征在于選自SEQ IDNOs51-57。特別優(yōu)選地，CDR1選自SEQ ID NOs39-44，CDR2選自SEQID NOs45-50以及CDR3選自SEQ ID NOs51-57。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地以包括可變輕鏈和可變重鏈為特征，特征在于所述可變重鏈包括CDR1、CDR2和CDR3，CDR3特征在于重鏈的CDR3選自SEQ ID NOs33-38，和輕鏈的CDR3選自SEQ ID NOs51-57。特別優(yōu)選地，可變重鏈包括選自SEQ ID NOs21-25的CDR1，選自SEQ ID NOs26-32的CDR2以及選自SEQ ID NOs33-38的CDR3，并且可變輕鏈包括選自SEQ ID NOs39-44的CDR1，選自SEQ ID NOs45-50的CDR2以及選自SEQ ID NOs51-57的CDR3。
所有的CDRs都獨(dú)立地從彼此選擇，但是自然是以所述抗體結(jié)合OX40L的這樣的方式。因此，相同的LC抗體的輕鏈和重鏈的CDRs可以組合，或者LC.001的輕鏈CDRs與LC.001、LC.059或LC.063的重鏈CDRs組合。每條鏈上的CDRs由構(gòu)架氨基酸分離。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體包括獨(dú)立地選自由下列各項(xiàng)組成的組的CDRs
a)氨基酸序列SEQ ID NO1的輕鏈(VL)可變CDRs和SEQ ID NO2的重鏈(VH)可變CDRs；b)氨基酸序列SEQ ID NO3的輕鏈可變CDRs和SEQ ID NO4的重鏈可變CDRs；c)氨基酸序列SEQ ID NO5的輕鏈可變CDRs和SEQ ID NO6的重鏈可變CDRs；d)氨基酸序列SEQ ID NO7的輕鏈可變CDRs和SEQ ID NO8的重鏈可變CDRs；e)氨基酸序列SEQ ID NO9的輕鏈可變CDRs和SEQ ID NO10的重鏈可變CDRs；f)氨基酸序列SEQ ID NO11或16的輕鏈可變CDRs和SEQ ID NO12的重鏈可變CDRs；g)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈(VL)可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO17定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；h)由氨基酸序列SEQ ID NO18定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO19定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；i)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；或其OX40L-結(jié)合片段。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體包括獨(dú)立地選自由下列各項(xiàng)組成的組的可變區(qū)a)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈(VL)可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO2定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；b)由氨基酸序列SEQ ID NO3定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO4定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；c)由氨基酸序列SEQ ID NO5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO6定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；d)由氨基酸序列SEQ ID NO7定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；
e)由氨基酸序列SEQ ID NO9定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO10定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；f)由氨基酸序列SEQ ID NO11或16定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQID NO12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；g)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈(VL)可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO17定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；h)由氨基酸序列SEQ ID NO18定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO19定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；i)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；或其OX40L-結(jié)合片段。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于人輕鏈可變區(qū)包括獨(dú)立地選自由SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，16和18組成的組的氨基酸序列。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于人重鏈可變區(qū)包括獨(dú)立地選自由SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，17，19和20組成的組的氨基酸序列。
重鏈和輕鏈的CDR區(qū)在SEQ ID NO21-38和39-57中顯示。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體包括由氨基酸序列SEQID NO1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ ID NO2，17或20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于人重鏈恒定區(qū)包括獨(dú)立地選自由SEQ ID NO14和15組成的組的氨基酸序列或者SEQ ID NO58的重鏈恒定區(qū)。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體包括SEQ ID NO13的κ-輕鏈恒定區(qū)或者SEQ ID NO61，65或69的輕鏈恒定區(qū)。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明的抗體特征在于結(jié)合OX40L，并且是人IgG1種類(野生型)，并且包括γ重鏈SEQ ID NO58，62或66。特別優(yōu)選地是這樣的抗體，其包括a)γ重鏈SEQ ID NO58和κ輕鏈SEQ ID NO61，b)γ重鏈SEQ ID NO62和κ輕鏈SEQ ID NO65或c)γ重鏈SEQ ID NO66和κ輕鏈SEQ ID NO69。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)合OX40L的抗體，其特征在于它由細(xì)胞系hu-Mab<hOX40L>LC.001，hu-Mab<hOX40L>LC.005，hu-Mab<hOX40L>LC.010，hu-Mab<hOX40L>LC.019，hu-Mab<hOX40L>LC.029或hu-Mab<hOX40L>LC.033產(chǎn)生。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地是嵌合的、人的或人源化的抗體。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于以小于10-8M(10-12-10-8M)的KD值結(jié)合OX40L，更優(yōu)選地特征在于在BIAcore檢測(cè)中10-12-10-9M的KD范圍。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地在使用0.5μg/ml包被濃度的固定OX40L(優(yōu)選地為固定在鏈霉抗生物素蛋白表面上的生物素化的OX40L)的ELISA中抑制OX40L與OX40的相互作用，具有不大于4nM的IC50值。更優(yōu)選地，IC50值在1-4 nM范圍內(nèi)。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于，所述抗體與補(bǔ)體因子C1q的不結(jié)合是指這樣一種ELISA檢測(cè)，即，與抗體LC.001的Bmax相比較，其中濃度為10μg/ml的抗體與C1q的最大結(jié)合(Bmax)為30％或更低，優(yōu)選地20％或更低。
優(yōu)選地，所述抗體不結(jié)合人FcγRI，F(xiàn)cγRIIA和/或FcγRIIIA。特別優(yōu)選地，所述抗體不結(jié)合在NK效應(yīng)細(xì)胞上的人Fcγ受體。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于所述抗體與NK細(xì)胞上的Fcγ受體的不結(jié)合是指這樣的檢測(cè)，即，與抗體LC.001的Bmax相比較，其中濃度為20μg/ml的抗體與NK細(xì)胞的最大結(jié)合(Bmax)為20％或更低，優(yōu)選地10％或更低。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于，它不與FcγRI結(jié)合。這意味著，當(dāng)在檢測(cè)濃度為0.078-10μg/ml范圍內(nèi)的抗體與缺少FcγRIIA和FcγIIB但是表達(dá)重組FcγRI的B-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)合的檢測(cè)中，所述抗體的特征在于，與LC.001的EC50值相比較，所述抗體的EC50值是5倍或更高，優(yōu)選地7倍或更高，諸如8倍或更高。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于為一種IgG4抗體或IgG1抗體，其包括至少一個(gè)氨基酸突變，優(yōu)選地在人Fc片段，這使得不與補(bǔ)體因子C1q結(jié)合和/或不與NK細(xì)胞上的人Fcγ受體結(jié)合。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于它不活化補(bǔ)體因子C3。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于為人亞類IgG4。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體特征在于為任何IgG種類，優(yōu)選地為IgG1或IgG4，其包含在E233，L234，L235，G236，D270，N297，E318，K320，K322，A327，A330，P331和/或P329(按照EU索引進(jìn)行編號(hào))的至少一個(gè)突變。特別優(yōu)選的是IgG1突變PVA236，L234A/L235A和/或GLPSS331以及IgG4突變L235E。另外，優(yōu)選地，IgG4亞類抗體包含突變S228P或突變S228P和L235E(Angal，S.，等.，Mol.Immunol.30(1993)105-108)。
因此，按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地為人亞類IgG1的抗體，其含有一個(gè)或多個(gè)PVA236，GLPSS331和/或L234A/L235A(按照EU索引進(jìn)行編號(hào))的突變。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明的抗體特征在于與OX40L結(jié)合，是含有突變L234A/L235A的IgG1種類，并且包括γ重鏈SEQ ID NO59，63或67。
特別優(yōu)選地，抗體包括a)γ重鏈SEQ ID NO59和κ輕鏈SEQ ID NO61，b)γ重鏈SEQ ID NO63和κ輕鏈SEQ ID NO65或c)γ重鏈SEQ ID NO67和κ輕鏈SEQ ID NO69。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明的抗體特征在于是含有突變S228P的IgG4種類的抗體，包括γ重鏈SEQ ID NO60，64或68。
特別優(yōu)選地，抗體包括a)γ重鏈SEQ ID NO60和κ輕鏈SEQ ID NO61，b)γ重鏈SEQ ID NO64和κ輕鏈SEQ ID NO65或c)γ重鏈SEQ ID NO68和κ輕鏈SEQ ID NO69。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于，它不引發(fā)依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特征在于，它不引發(fā)依賴于抗體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。
因此，本發(fā)明包括抗-OX40L抗體或以它們的CDRs為特征的單一重鏈或輕鏈，可變區(qū)，完整氨基酸序列或雜交瘤，并且其不包括Fc片段或者包括任何類型的Fc片段，優(yōu)選地人IgG1 Fc或人IgG4 Fc，來自于人源未修飾的或者由上述提及的突變修飾的Fc片段。
因此，本發(fā)明還包括抗體，優(yōu)選地單克隆抗體，特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，包含人源Fc片段，并且不結(jié)合人補(bǔ)體因子C1q和/或NK細(xì)胞上的人Fcγ受體，特征在于為人IgG4型或者為由上述提及的突變修飾的人IgG1或人IgG4。
因此，本發(fā)明還包括抗體，優(yōu)選地單克隆抗體，特征在于所述抗體以100ng的抗體濃度與OX40L和變性的OX40L(在蛋白質(zhì)印跡中)結(jié)合。這一抗體結(jié)合到與單克隆抗體LC.001結(jié)合的表位相同的OX40L多肽表位上。所述抗體不包括Fc片段，或者包括任何類型的Fc片段，優(yōu)選地人IgG1或人IgG4，野生型的或者由上述提及的突變修飾的。
按照本發(fā)明的抗體具有新穎性和創(chuàng)造性特點(diǎn)，其給需要用針對(duì)OX40L的抗體治療的患者，特別為遭受炎癥疾病折磨的患者，特別是受類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性哮喘和移植中的GvHD折磨的患者帶來益處(還參見Sugamura，K.，等.，Nat.Rev.Immunol.4(2004)420-431)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種核酸分子，其編碼按照本發(fā)明的抗體分子、其可變鏈或CDR結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體是Fab、F(ab’)2或單鏈片段。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種載體，其包括按照本發(fā)明的核酸分子。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種宿主細(xì)胞，其包括按照本發(fā)明的載體。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種制備按照本發(fā)明的抗體的方法，所述方法包括在允許所述抗體分子合成的條件下，培養(yǎng)按照本發(fā)明的宿主細(xì)胞，并且從所述培養(yǎng)物中獲得所述抗體分子。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種組合物，優(yōu)選地是按照本發(fā)明的抗體的藥物或診斷組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種藥物組合物，其包括按照本發(fā)明的抗體和至少一種藥用賦形劑。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種治療需要治療的患者的方法，其特征在于給所述患者施用治療有效量的按照本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是按照本發(fā)明的抗體用于治療的應(yīng)用，其優(yōu)選地用于治療炎癥疾病，特別用于治療和/或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘和GvHD(移植物抗宿主病)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是按照本發(fā)明的抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于預(yù)防和/或治療炎癥疾病，優(yōu)選地用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘和GvHD。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種診斷試劑盒，其包括按照本發(fā)明的抗體、按照本發(fā)明的核酸分子、按照本發(fā)明的載體或按照本發(fā)明的宿主細(xì)胞。
發(fā)明詳述術(shù)語“OX40L”是指屬于TNF-配體家族的II型膜蛋白。其它的命名為ACT-4受體，CD134L，gp34或TNF4_人。它具有34 KDa的分子量，并且存儲(chǔ)在SwissProt中，登記號(hào)為P23510。
術(shù)語“OX40”是指與OX40L結(jié)合的受體。它是屬于TNF受體家族的I型膜蛋白。其它的命名為ACT-4，OX40L受體，CD134抗原，ACT35抗原，TNR4人。它具有50kDa的分子量，并且存儲(chǔ)在SwissProt中，登記號(hào)為P43489。
術(shù)語“抗體”包括各種形式的抗體，優(yōu)選地為單克隆抗體，其包括但不限于完整抗體、抗體片段、人抗體、嵌合抗體、人源化抗體和遺傳加工的抗體(變體或突變抗體)，只要保留按照本發(fā)明的特征性特點(diǎn)。特別優(yōu)選的是人或人源化的單克隆抗體，特別是重組人抗體。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單一氨基酸組合物的抗體分子的制劑。
術(shù)語“嵌合抗體”是指一種單克隆抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區(qū)，即，結(jié)合區(qū)，和來源于不同來源或物種的至少一部分恒定區(qū)，這種抗體通常通過重組DNA技術(shù)制備。優(yōu)選包括小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明所包括的其它優(yōu)選形式的“嵌合抗體”是，其中恒定區(qū)已經(jīng)從初始抗體的恒定區(qū)修飾或改變，以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于C1q結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合特性的那些。這樣的嵌合抗體也叫作“種類-轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是免疫球蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物，所述免疫球蛋白基因包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA片段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA片段。產(chǎn)生嵌合抗體的方法包括本領(lǐng)域公知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見，例如，Morrison，S.L.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；US Patent Nos.5,202,238和5,204,244。
術(shù)語“人源化抗體”是指這樣的抗體，與親本免疫球蛋白的CDR相比較，其中構(gòu)架或“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)已經(jīng)被修飾成包括不同特異性的免疫球蛋白CDR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將小鼠CDR移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)，以制備所述“人源化抗體”。參見，例如，Riechmann，L.，等.，Nature332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等.，Nature 314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDRs對(duì)應(yīng)代表識(shí)別上文提及的抗原序列的那些，所述抗原針對(duì)嵌合的和雙功能抗體。本發(fā)明包括的其它形式的“人源化抗體”是其中的恒定區(qū)已經(jīng)從初始抗體的恒定區(qū)另外修飾或改變，以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于C1q結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的特性的那些抗體。
術(shù)語“人抗體”，當(dāng)用于本文時(shí)，意欲包括具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。人抗體在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗體還可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)中產(chǎn)生，在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下，一旦免疫，所述動(dòng)物能夠產(chǎn)生人抗體的全部所有成分或所選擇的部分。當(dāng)抗原刺激時(shí)，將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這樣的種系突變小鼠中將導(dǎo)致人抗體的產(chǎn)生(參見，例如，Jakobovits，A.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等.，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等.，Year Immunol.7(1993)33-40)。人抗體還可以在噬菌體展示文庫中產(chǎn)生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D.，等.，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等.和Boemer等.的技術(shù)還可以用于制備人單克隆抗體(Cole等.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；和Boemer，P.，等，J.Immunol.147(1991)86-95)。由于已經(jīng)提及按照本發(fā)明的嵌合和人源化抗體，術(shù)語“人抗體”，當(dāng)用于本文時(shí)，還包括這樣的抗體，其在恒定區(qū)被修飾以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于C1q結(jié)合和/或FcR結(jié)合的特性，例如，通過“種類轉(zhuǎn)換”，即，F(xiàn)c片段的改變或突變(例如，從IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突變)。另外，本發(fā)明包括針對(duì)OX40L的單克隆人抗體，其結(jié)合C1q和/或FcR。這樣的人抗體特征在于相對(duì)小鼠OX40L而言對(duì)于人OX40L的高選擇性(與小鼠OX40L結(jié)合比與人OX40L結(jié)合低＞30倍)，并且在達(dá)到500nM濃度時(shí)，沒有表現(xiàn)出對(duì)TNFα或CD40L的非特異性結(jié)合。這樣的抗體有效用于產(chǎn)生不與C1q和/或FcR結(jié)合的抗體。
術(shù)語“重組人抗體”，當(dāng)用于本文時(shí)，意欲包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，諸如從宿主細(xì)胞如NS0或CHO細(xì)胞或從用人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)分離的抗體，或者應(yīng)用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。這樣的重組抗體具有重排形式的可變和恒定區(qū)。將按照本發(fā)明的重組人抗體進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此，盡管來源于并且與人種系VH和VL序列相關(guān)，所述重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列是不可能在體內(nèi)人抗體種系所有成分中天然存在的序列。
當(dāng)用于本文時(shí)，“可變區(qū)”(輕鏈(VL)的可變區(qū)，重鏈(VH)的可變區(qū))表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的常規(guī)結(jié)構(gòu)，并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，其序列普遍是保守的，由3個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)，CDRs)連接。構(gòu)架區(qū)采用β-片層構(gòu)象，并且CDRs可以形成連接β-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDRs在它們的三維空間結(jié)構(gòu)中由構(gòu)架區(qū)擁有，并且與其它鏈的CDRs一起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中起著特別重要的作用，并且因此提供了本發(fā)明的另一個(gè)目的。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“高變區(qū)”或“抗體的抗原-結(jié)合部分”是指負(fù)責(zé)抗原-結(jié)合的抗體氨基酸殘基。所述高變區(qū)包括“互補(bǔ)決定區(qū)”或″CDRs″的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或″FR″區(qū)是除本文定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N-到C-端包括結(jié)構(gòu)域FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，和FR4。每條鏈上的CDRs由這樣的構(gòu)架氨基酸分離。特別地，重鏈的CDR3是對(duì)抗原結(jié)合貢獻(xiàn)最大的區(qū)域。按照Kabat等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義，確定了CDR和FR區(qū)域。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“核酸或核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA。
當(dāng)它與另一核酸序列處于功能關(guān)聯(lián)中時(shí)，核酸是“可操作性連接的”。例如，如果它作為參與多肽分泌的前蛋白而表達(dá)，那么，將前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA可操作地連接到多肽的DNA上；如果它影響了所述序列的轉(zhuǎn)錄，那么將啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接到編碼序列上；或者，如果它位于促進(jìn)翻譯的位置，那么將核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接到編碼序列上。一般地，“可操作連接”意指，要連接的DNA序列是相鄰的，并且，在分泌性前導(dǎo)序列的情形中，是相鄰的并且在閱讀框內(nèi)。然而，增強(qiáng)子不必是相鄰的。連接通過在便利的限制性位點(diǎn)的連接而實(shí)現(xiàn)。如果不存在這樣的位點(diǎn)，按照常規(guī)慣例，使用合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。
當(dāng)用于本文時(shí)，表達(dá)“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”互換地使用，并且所有這樣的名稱都包括后代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化子”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括初級(jí)受試細(xì)胞和源于其的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)該理解，由于有意或無意的突變，所有的后代在DNA內(nèi)容物上可以不是精確地相同的。包括具有與在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中所篩選的相同的功能或生物活性的變體后代。在使用不同的名稱的情況下，從上下文中它將是清楚的。
“恒定結(jié)構(gòu)域”不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出不同的效應(yīng)器功能。取決于它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，將抗體或免疫球蛋白分成下列種類IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且這些中的幾個(gè)可以進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，IgA1和IgA2。與不同種類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別叫作α，ε，γ和μ。按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地為IgG型。
按照本發(fā)明的抗體包含F(xiàn)c片段，優(yōu)選地是源于人源的Fc片段，并且優(yōu)選地是人恒定區(qū)的所有其它片段?？贵w的Fc片段直接參與補(bǔ)體激活、C1q結(jié)合、C3活化和Fc受體結(jié)合。盡管抗體對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的影響取決于特定的條件，但是，與C1q的結(jié)合由Fc片段中定義的結(jié)合位點(diǎn)引起。這樣的結(jié)合位點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的，并且例如由Lukas，T.J.，等.，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton，D.R.，等.，Nature 288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等.，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等.，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等.，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等.，Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434進(jìn)行了描述。這樣的結(jié)合位點(diǎn)如L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(按照Kabat EU索引進(jìn)行編號(hào)，參見下文)。亞類IgG1、IgG2和IgG3的抗體通常表現(xiàn)出補(bǔ)體激活、C1q結(jié)合和C3活化，而IgG4不激活補(bǔ)體系統(tǒng)，不與C1q結(jié)合并且不激活C3。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“來源于人源并且不結(jié)合NK細(xì)胞上的人補(bǔ)體因子C1q和/或人Fcγ受體的Fc片段”表示這樣的Fc片段，即，其為亞類IgG4的人抗體Fc片段，或者亞類IgG1、IgG2或IgG3的人抗體Fc片段，其以這樣的方式進(jìn)行修飾，即不能檢測(cè)到下文定義的C1q結(jié)合、C3活化和/或FcR結(jié)合?！翱贵w的Fc片段”是技術(shù)人員公知的術(shù)語，并且是基于抗體的木瓜蛋白酶分解而定義。優(yōu)選地，所述Fc片段是人Fc片段，并且特別優(yōu)選地來自人IgG4亞類，優(yōu)選地在鉸鏈區(qū)突變(例如，S228P和/或L235E)，或者是來自人IgG1亞類的突變的Fc片段。最優(yōu)選地是包括這樣的重鏈恒定區(qū)的Fc片段，即，所述重鏈恒定區(qū)選自SEQ ID NO14和15顯示的區(qū)域，或者包含在SEQ ID NO58，59，60，具有突變L234A和L235A的SEQ ID NO14，或者具有突變S228P或突變S228P和L235E的SEQ ID NO15中。
本發(fā)明涉及與OX40L結(jié)合而不與補(bǔ)體因子C1q和/或Fc受體結(jié)合的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些抗體不引發(fā)依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)和/或依賴于抗體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。優(yōu)選地，這一抗體特征在于，它結(jié)合OX40L，包含來源于人源的Fc片段，并且不結(jié)合補(bǔ)體因子C1q。更優(yōu)選地，這一抗體是人的或人源化的單克隆抗體。
由所述抗體Fc區(qū)域的Fc片段介導(dǎo)的效應(yīng)器功能是指抗體與抗原結(jié)合后運(yùn)行的效應(yīng)器功能(這些功能包括Fc受體對(duì)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)和/或細(xì)胞活化的激活作用)。
補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的功能可以通過CH50檢測(cè)進(jìn)行評(píng)估。將用抗-紅細(xì)胞抗體(EA)致敏的綿羊紅細(xì)胞加入到檢測(cè)血清中，以激活導(dǎo)致紅血球溶解的經(jīng)典途徑。裂解50％紅細(xì)胞所需的血清體積確定CH50單位。AP-CH50測(cè)定備選的和末期途徑。除了使用兔紅細(xì)胞之外，流程是相似的。當(dāng)加入檢測(cè)血清時(shí)，備選途徑被激活。
C1q和兩種絲氨酸蛋白酶，C1r和C1s，形成復(fù)合物C1，是依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)途徑的第一個(gè)成分。為了激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)效應(yīng)，C1q結(jié)合附著到抗原性靶點(diǎn)上的至少兩分子的IgG1或一分子的IgM(Ward，E.S.，和Ghetie，V.，Ther.Immunol.2(1995)77-94)。Burton，D.R.，描述了(Mol.Immunol.22(1985)161-206)包括氨基酸殘基318-337的重鏈區(qū)域參與補(bǔ)體固定。Duncan，A.R.，和Winter，G.(Nature 332(1988)738-740)，使用定點(diǎn)誘變，報(bào)道了Glu318、Lys320和Lys322形成與C1q的結(jié)合位點(diǎn)。Glu318、Lys320和Lys322殘基在與C1q結(jié)合中的作用由含有這些殘基的合成的短肽抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解的能力而證實(shí)。
術(shù)語“依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)”是指，在補(bǔ)體存在下，按照本發(fā)明的抗體對(duì)表達(dá)OX40L的人內(nèi)皮細(xì)胞的裂解。優(yōu)選地，在補(bǔ)體存在下，通過用按照本發(fā)明的抗體處理表達(dá)OX40L的人內(nèi)皮細(xì)胞，而測(cè)定CDC。優(yōu)選地將細(xì)胞用鈣熒光素標(biāo)記。如果在30μg/ml的濃度，所述抗體誘導(dǎo)20％或更多的靶點(diǎn)細(xì)胞的裂解，那么可以發(fā)現(xiàn)CDC。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)于按照本發(fā)明的抗體的特性，在ELISA檢測(cè)中減少與補(bǔ)體因子C1q的結(jié)合是重要的。在這樣的檢測(cè)中，理論上將ELISA平板用不同濃度范圍的抗體包被，向平板中加入純化的人C1q或人血清。通過針對(duì)C1q的抗體，接著過氧化物酶-標(biāo)記的綴合物，檢測(cè)C1q的結(jié)合。結(jié)合的檢測(cè)(最大結(jié)合Bmax)作為對(duì)于過氧化物酶底物ABTS(2，2′-疊氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯(6)]在405nm的光學(xué)密度(OD405)進(jìn)行檢測(cè)。因此，本發(fā)明涉及一種抗體，其特征在于，所述抗體與補(bǔ)體因子C1q的不結(jié)合是指這樣的ELISA檢測(cè)測(cè)定，其中在10μg/ml的抗體濃度，C1q與按照本發(fā)明的抗體的最大結(jié)合(Bmax)是用抗體LC.001觀察到的Bmax的20％或更低，優(yōu)選地，10％或更低。
還優(yōu)選的是，按照本發(fā)明的抗體在ELISA檢測(cè)中表現(xiàn)出對(duì)補(bǔ)體因子C3減少的激活。所述檢測(cè)用同C1q檢測(cè)相同的方式進(jìn)行。在這樣的檢測(cè)中，理論上，將ELISA平板用不同濃度范圍的抗體包被，向其中加入人血清。通過針對(duì)C3的抗體，接著過氧化物酶-標(biāo)記的綴合物，檢測(cè)C3的結(jié)合。結(jié)合的檢測(cè)(最大結(jié)合Bmax)作為對(duì)于過氧化物酶底物ABTS在405nm的光學(xué)密度(OD405)進(jìn)行檢測(cè)。因此，本發(fā)明涉及一種抗體，其特征在于，所述抗體與補(bǔ)體因子C3的不結(jié)合是指這樣的ELISA檢測(cè)測(cè)定，其中在10μg/ml的抗體濃度，C3與所述抗體的最大結(jié)合(Bmax)是抗體LC.001的Bmax的10％，優(yōu)選地，5％或更低。
術(shù)語“依賴于抗體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)”是由Fc受體結(jié)合介導(dǎo)的功能，并且是指在效應(yīng)細(xì)胞存在下，按照本發(fā)明的抗體對(duì)表達(dá)OX40L的靶點(diǎn)細(xì)胞的裂解。優(yōu)選地，通過在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，諸如新鮮分離的PBMC(外周血單核細(xì)胞)或從暗黃覆蓋層(buffy coats)純化的效應(yīng)細(xì)胞，如單核細(xì)胞或NK(天然殺傷性)細(xì)胞，用按照本發(fā)明的抗體處理表達(dá)OX40L的類紅細(xì)胞(例如，表達(dá)重組人OX40L的K562細(xì)胞)制劑，而測(cè)量ADCC。將靶點(diǎn)細(xì)胞用51Cr標(biāo)記，并且隨后與抗體一起溫育。將標(biāo)記的細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞一起溫育，并且分析上層清液釋放的51Cr。對(duì)照包括用效應(yīng)細(xì)胞而不用所述抗體溫育靶點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞。通過測(cè)定它們與表達(dá)Fcγ受體的細(xì)胞諸如重組表達(dá)FcγRI和/或FcγRIIA的細(xì)胞或NK細(xì)胞(基本上表達(dá)FcγRIIIA)的結(jié)合，而研究抗體誘導(dǎo)調(diào)控ADCC的初始步驟的能力。優(yōu)選地測(cè)定與NK細(xì)胞上FcγR的結(jié)合。
Fc受體結(jié)合效應(yīng)器功能受到抗體的Fc區(qū)與Fc受體(FcRs)的相互作用的調(diào)控，F(xiàn)c受體是造血細(xì)胞上特有的細(xì)胞表面受體。Fc受體屬于免疫球蛋白超家族，并且已經(jīng)表明其介導(dǎo)通過免疫復(fù)合體的吞噬細(xì)胞溶解作用而將抗體-包被的病原體移除，和通過依賴于抗體的細(xì)胞調(diào)控的細(xì)胞毒性(ADCC)而將用相應(yīng)抗體包被的紅細(xì)胞和各種其它細(xì)胞目的物(例如，腫瘤細(xì)胞)的裂解。Van de Winkel，J.G，和Anderson，C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcRs由它們對(duì)免疫球蛋白同種型的特異性而定義；IgG抗體的Fc受體叫作FcγR，IgE的叫作FcεR，IgA的叫作FcαR，等等。例如，F(xiàn)c受體結(jié)合在Ravetch，J.V.，和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel，P.J.，等.，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas，M.，等.，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；和Gessner，J.E.，等.，Ann.Hematol.76(1998)231-248中描述。
對(duì)于IgG抗體Fc結(jié)構(gòu)域的受體(FcγR)的交聯(lián)引發(fā)了廣泛種類的效應(yīng)器功能，包括吞噬細(xì)胞溶解作用、依賴于抗體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性和炎性調(diào)控因子的釋放、以及免疫復(fù)合體清除和抗體產(chǎn)生的調(diào)控。在人中，已經(jīng)區(qū)分了3種FcγR，它們是-FcγRI(CD64)以高親和力結(jié)合單體IgG，并且在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)。IgG中E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329至少一種的修飾減少與FcγRI的結(jié)合。在位置233-236的IgG2殘基，代入IgG1和IgG4，將與FcγRI的結(jié)合減小103-倍，并且消除了對(duì)抗體-致敏的紅細(xì)胞的人單核細(xì)胞應(yīng)答(Armour，K.L.，等..Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。
-FcγRII(CD32)以中等到低親和力結(jié)合復(fù)合的IgG，并且廣泛地表達(dá)。這些受體可以分成2種主要類型，F(xiàn)cγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA在許多參與殺傷的細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞)上發(fā)現(xiàn)，并且似乎能夠激活殺傷過程。FcγRIIB似乎在抑制過程中起作用，并且在B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上以及肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)。在B細(xì)胞上，看起來它行使抑制其它免疫球蛋白產(chǎn)生和同種型轉(zhuǎn)換如向IgE種類轉(zhuǎn)換的功能。在巨噬細(xì)胞上，F(xiàn)cγRIIB作用抑制通過FcγRIIA調(diào)控的吞噬細(xì)胞溶解作用。在嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞上，b形式可以通過IgE與其獨(dú)立的受體結(jié)合而幫助抑制這些細(xì)胞的活化。例如，對(duì)于E233-G236，P238，D265，N297，A327，P329，D270，Q295，A327，R292和K414至少一種的IgG突變，發(fā)現(xiàn)減小了與FcγRIIA的結(jié)合。
-FcγRIII(CD16)以中等到低親和力結(jié)合IgG，并且以兩種類型存在。
FcγRIIIA在NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和一些單核細(xì)胞和T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，并且調(diào)控ADCC。FcγRIIIB在嗜中性粒細(xì)胞上高度表達(dá)。
例如，對(duì)于E233-G236，P238，D265，N297，A327，P329，D270，Q295，A327，S239，E269，E293，Y296，V303，A327，K338和D376至少一種的突變，發(fā)現(xiàn)減小了與FcγRIIIA的結(jié)合。
對(duì)于Fc受體在人IgG1上結(jié)合位點(diǎn)、上文提及的突變位點(diǎn)的定位和測(cè)定與FcγRI和FcγRIIA的結(jié)合的方法在Shields，R.L.，等.JBC 276(2001)6591-6604中描述。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“Fc受體”是指活化受體，其特征在于存在與所述受體相締合的胞質(zhì)(cytoplasmatic)ITAM序列(參見，例如，Ravetch，J.V.，和Bolland，S.，Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。這樣的受體是FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。按照本發(fā)明的受體優(yōu)選地表現(xiàn)出與Fcγ受體，優(yōu)選地與FcγIIIA減小的結(jié)合。優(yōu)選地，術(shù)語“不與FcγR結(jié)合”意指，在10μg/ml的抗體濃度，按照本發(fā)明的抗體與NK細(xì)胞的結(jié)合是對(duì)于抗體LC.001所發(fā)現(xiàn)的結(jié)合的10％或更少。
盡管IgG4表現(xiàn)出減少的FcR結(jié)合，但是其它IgG亞類的抗體表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合。然而，如果改變，Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(失去Fc碳水化合物)，Pro329和234，235，236和237，Ile253，Ser254，Lys288，Thr307，Gln311，Asn434和His435是也提供減小的FcR結(jié)合的殘基(Shields，R.L.，等.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund，J.，等.FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.，等.，Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434)。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的IgG1或IgG2亞類的抗體包括突變PVA236、GLPSS331和/或L234A/L235A。按照本發(fā)明的IgG4亞類的抗體優(yōu)選地包括突變L235E。其它優(yōu)選的IgG4突變是S228P或L235E和S228P(參見表1)。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“與OX40L結(jié)合”意指在BIAcore檢測(cè)(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden)中抗體與人OX40L的結(jié)合。為了進(jìn)一步證實(shí)，與OX40L的結(jié)合還在用純化的OX40L包被微量滴定平板的ELISA中確定，或者在FACS-檢測(cè)中確定，其中直接或間接標(biāo)記的抗體結(jié)合到表達(dá)OX40L的K562細(xì)胞上。
在BIAcore檢測(cè)中，抗體結(jié)合到表面，并且OX40L的結(jié)合通過表面胞質(zhì)基因共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)合的親和力通過術(shù)語ka(抗體與抗原締合的速率常數(shù))、kd(解離的速率常數(shù))和KD(kd/ka)進(jìn)行定義。按照本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出10-8或更小，優(yōu)選約10-12-10-9M的KD(參見實(shí)例)。因此，本發(fā)明涉及上文所述的抗體，其中所述抗體在BIAcore檢測(cè)中以小于10-8M的KD值與OX40L結(jié)合，優(yōu)選地其中KD的范圍是10-12-10-9M。
在OX40L-特異性結(jié)合ELISA中，將OX40L包被到微量滴定平板上，并且用HRP-綴合的抗人IgG和常規(guī)ELISA步驟檢測(cè)抗體與OX40L的結(jié)合。在這一檢測(cè)中的EC50值優(yōu)選地在3nM-8nM范圍內(nèi)。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“抑制OX40與OX40L結(jié)合”是指本發(fā)明所述的抗體與人OX40L的結(jié)合，由此抑制OX40/OX40L相互作用，并且由此抑制OX40L誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。
本發(fā)明的抗體抑制hOX40L/OX40的相互作用，優(yōu)選地i)在由ELISA檢測(cè)所示的體外水平上，通過在(固相)0.5μg/ml生物素化OX40L的包被濃度的抗體而阻滯生物素化的、固定的OX40L與可溶OX40的相互作用，具有1nM-4nM范圍的IC50值，ii)在由Biacore檢測(cè)所示的體外水平上，通過0.78-100nM抗體濃度的抗體而阻滯固定的OX40與可溶的OX40L(10nM，優(yōu)選地為hOX40L-His)的相互作用，具有1nM-10nM范圍的IC50值，iii)在由FACS-檢測(cè)所示的細(xì)胞水平上，其中所述抗體抑制表達(dá)OX40L的K562細(xì)胞(K562_OX40L)(濃度為2×105個(gè)細(xì)胞/樣品)與OX40的相互作用，具有4nM-20nM范圍的IC50值，iv)通過OX40-信號(hào)傳導(dǎo)檢測(cè)，其中所述抗體阻滯由K562_OX40L誘導(dǎo)的OX40信號(hào)傳導(dǎo)到每份樣品3×104個(gè)表達(dá)OX40的HeLa-細(xì)胞中，這導(dǎo)致NFκB活化的阻滯，具有1nM-5nM范圍的IC50值，v)通過T細(xì)胞活化檢測(cè)，其中通過在濃度為1.5×105個(gè)細(xì)胞/樣品的K562_OX40L和濃度為0.75μg/ml的PHA，所述抗體阻滯OX40L誘導(dǎo)的T細(xì)胞激活，具有1nM-10nM范圍的IC50值，和/或vi)通過T細(xì)胞活化檢測(cè)，其中通過在濃度為10μg/ml的抗體的活化的B細(xì)胞或樹突細(xì)胞(Tetanus檢測(cè))，所述抗體阻滯OX40L誘導(dǎo)的T細(xì)胞激活，得到40％-60％的抑制。
優(yōu)選這樣的抗體，即，其在ELISA檢測(cè)中表現(xiàn)出抑制，通過在0.5μg/ml OX40L的包被濃度阻滯固定的OX40L與可溶的OX40的相互作用而進(jìn)行抑制，具有1nM-4nM范圍的IC50值。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及一種抗體，其特征在于所述抗體由此抑制OX40/OX40L相互作用，并且由此抑制OX40L誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。
更優(yōu)選地，按照本發(fā)明的抗體在濃度達(dá)到500nM的TNFα或CD40L，不表現(xiàn)出與TNFα和CD40L的非特異性結(jié)合。
更優(yōu)選地，與人OX40L相比，按照本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出至少低于30倍的與小鼠OX40L的結(jié)合。
更優(yōu)選地，濃度為10μg/ml的按照本發(fā)明的抗體不誘導(dǎo)對(duì)OX40L在HUVEC細(xì)胞上表達(dá)的下調(diào)。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體特征在于，它們包括可變結(jié)構(gòu)域的組合，所述組合獨(dú)立地選自由下列組合組成的組a)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的抗體LC.001的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ ID NO2定義的抗體LC.001的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；b)由氨基酸序列SEQ ID NO3定義的抗體LC.005的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ ID NO4定義的抗體LC.005的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；c)由氨基酸序列SEQ ID NO5定義的抗體LC.010的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ ID NO6定義的抗體LC.010的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；d)由氨基酸序列SEQ ID NO7定義的抗體LC.029的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ ID NO8定義的抗體LC.029的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；e)由氨基酸序列SEQ ID NO9定義的抗體LC.019的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ ID NO10定義的抗體LC.019的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；f)由氨基酸序列SEQ ID NO11或16定義的抗體LC.033的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ ID NO12定義的抗體LC.033的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；g)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈(VL)可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO17定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；h)由氨基酸序列SEQ ID NO18定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO19定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；i)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體特征在于，它們包括獨(dú)立地選自由下列各項(xiàng)組成的組的恒定區(qū)k)由序列SEQ ID NO13定義的輕鏈/κ鏈；l)具有一個(gè)或多個(gè)選自L234A和L235A、PVA236或GLPSS331的突變的IgG1同種型SEQ ID NO14的重鏈/γ鏈；m)IgG4同種型SEQ ID NO15的重鏈/γ鏈；n)具有突變S228P或突變S228P和L235E的IgG4同種型SEQ IDNO15重鏈/γ鏈；o)包含在SEQ ID NO61，65或69中的輕鏈恒定鏈；p)包含在SEQ ID NO58，59，60，62，63，64，66，67或68中的重鏈恒定鏈。
更優(yōu)選地是每種可變抗體結(jié)構(gòu)域組合a)-i)與γ鏈l)、m)、n)或p)，并且優(yōu)選地與κ鏈k)或o)的所有組合。特別優(yōu)選地是下列抗體這樣的抗體，其包括抗體LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033，LC.059，LC.060或LC.063的可變鏈(其中每種抗體具有序列SEQ IDNO13定義的κ鏈)，或包含在SEQ ID NO61，65或69中的輕鏈恒定鏈和具有突變L234A和L235A的IgG1同種型SEQ ID NO14的重鏈/γ鏈，或包含在SEQ ID NO59，63或67中的重鏈恒定鏈；這樣的抗體，其包括抗體LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033，LC.059，LC.060或LC.063的可變鏈(其中每種抗體具有序列SEQ ID NO13定義的κ鏈)，或包含在SEQ ID NO59，63或67中的重鏈恒定鏈和IgG4同種型SEQ IDNO15的重鏈/γ鏈，或包含在SEQ ID NO60，64或68中的重鏈恒定鏈，所有這3種都沒有S228P突變；這樣的抗體，其包括抗體LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033，LC.059，LC.060或LC.063的可變鏈(其中每種抗體具有序列SEQ ID NO13定義的κ鏈)，或包含在SEQ ID NO61，65或69中的輕鏈恒定鏈和具有突變S228P的IgG4同種型SEQ ID NO15的重鏈/γ鏈，或包含在SEQ ID NO60，64或68中的重鏈恒定鏈。
優(yōu)選地，所述抗體包括氨基酸序列SEQ ID NO1的輕鏈可變CDR，和SEQ ID NO2，17或20的重鏈可變CDR，或氨基酸序列SEQ ID NO18的輕鏈可變CDR，和SEQ ID NO19的重鏈可變CDR。
優(yōu)選的抗體特征在于，所述抗體是人IgG4亞類或是其它的人亞類(優(yōu)選IgG1)，其包括至少一個(gè)引起不結(jié)合補(bǔ)體因子C1q和/或失去FCR結(jié)合的氨基酸突變。例如，這樣優(yōu)選的變體抗體包括具有突變L234A和L235A的氨基酸序列SEQ ID NO14，或者具有或沒有突變S228P的SEQID NO15。
按照本發(fā)明的優(yōu)選抗體是定義為IgG1v1(PVA-236；表示為E233P的GLPSS331；L234V；L235A；△G236；A327G；A330S；P331S)，IgG1v2(L234A；L235A)和IgG4v1(S228P；L235E)和IgG4x(S228P)的抗體。
根據(jù)用于專利程序目的的微生物保藏國際承認(rèn)的布達(dá)佩斯公約，按照本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞系hu-Mab<hOX40L>LC.001于2004年7月27日保藏在德國的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)，保藏號(hào)DSM ACC2672。
根據(jù)用于專利程序目的的微生物保藏國際承認(rèn)的布達(dá)佩斯公約，按照本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞系hu-Mab<hOX40L>LC.005(DSM ACC 2685)，hu-Mab<hOX40L>LC.010(DSM ACC 2686)，hu-Mab<hOX40L>LC.019，hu-Mab<hOX40L>LC.029(DSM ACC 2688)和hu-Mab<hOX40L>LC.033(DSM ACC 2689)于2004年9月2日保藏在德國的德意志微生物保藏中心(DSMZ)。
可從所述細(xì)胞系得到的抗體是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，并且特別有效用作中間物質(zhì)，用于產(chǎn)生不結(jié)合補(bǔ)體因子C1q和/或不結(jié)合人Fcγ受體的按照本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案是分離的抗-OX40L抗體，其結(jié)合OX40L，并且與由所保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體LC.005，LC.010或LC.029也與之結(jié)合的相同的OX40L-表位結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于產(chǎn)生針對(duì)OX40L的抗體的方法，所述針對(duì)OX40L的抗體不結(jié)合人補(bǔ)體因子C1q和/或人Fcγ受體，其特征在于，編碼以小于10-8M的KD值結(jié)合OX40L的抗體的重鏈的核酸序列以這樣的方式進(jìn)行修飾，以致所述修飾的抗體不結(jié)合NK細(xì)胞上的補(bǔ)體因子C1q和/或人Fcγ受體，將所述修飾的核酸和編碼所述抗體輕鏈的核酸插入到表達(dá)載體中，將所述載體插入到原核或真核宿主細(xì)胞中，所編碼的蛋白得以表達(dá)并且從宿主細(xì)胞或上層清液回收。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于產(chǎn)生按照本發(fā)明的不結(jié)合補(bǔ)體因子C1q和/或不結(jié)合人Fcγ受體的抗體的方法，特征在于，可從所述細(xì)胞系之一得到的抗體通過“種類轉(zhuǎn)換”而進(jìn)行修飾，即，改變或者突變優(yōu)選地定義為IgG1v1(PVA-236；表示為E233P的GLPSS331；L234V；L235A；ΔG236；A327G；A330S；P331S)，IgG1v2(L234A；L235A)和IgG4v1(S228P；L235E)和IgG4x(S228P)的Fc片段(例如，從IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突變)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些抗體還包括選自由Fab、F(ab’)2和單鏈片段組成的組的抗體片段。
因此，“變體”抗-OX40L抗體在本文是指這樣一種分子，其通過在親本抗體序列中加入、刪除和/或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而在氨基酸序列中與“親本”抗-OX40L抗體氨基酸序列不同。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述變體包括在親本抗體一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)或可變區(qū)，優(yōu)選在恒定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。例如，所述變體可以包括在親本抗體的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的至少一個(gè)，例如，從約1個(gè)到約10個(gè)，并且優(yōu)選地從約2個(gè)到約5個(gè)取代。通常，所述變體具有這樣的氨基酸序列，即，其與親本抗體恒定和/或可變結(jié)構(gòu)域序列有至少90％的氨基酸序列相同性，更優(yōu)選的至少95％，和更優(yōu)選地至少99％的相同性。
本發(fā)明包括修飾選自由SEQ ID NOs21-38組成的組的親本抗體重鏈CDR和/或選自由SEQ ID NOs39-57組成的組的抗體輕鏈CDR的初始氨基酸序列的方法，其特征在于，提供編碼所述初始氨基酸序列的核酸，修飾所述核酸，在這點(diǎn)上，重鏈CDR1中1個(gè)氨基酸被修飾，重鏈CDR2中1-2個(gè)氨基酸被修飾，重鏈CDR3中1-2個(gè)氨基酸被修飾，輕鏈CDR1中1-3個(gè)氨基酸被修飾，輕鏈CDR2中1-3個(gè)氨基酸被修飾，和/或輕鏈CDR3中1-3個(gè)氨基酸被修飾，在抗體結(jié)構(gòu)中表達(dá)所述修飾的CDR氨基酸序列，測(cè)定所述抗體是否以小于10-8M的KD結(jié)合OX40L，并且如果所述抗體以小于10-8M的KD結(jié)合OX40L，選擇所述修飾的CDR。優(yōu)選地，這樣的修飾是保守序列修飾。
關(guān)于序列的相同性或同源性在本文定義為在候選序列中與親本抗體殘基相同的氨基酸殘基的百分比，如果必要，在對(duì)所述序列進(jìn)行比對(duì)并且引入缺口后，獲得最大的序列相同性百分?jǐn)?shù)?？贵w序列內(nèi)的N-端、C-端、或內(nèi)部的延長、刪除或插入都不應(yīng)該解釋為影響序列相同性或同源性。變體保持結(jié)合人OX40L的能力，并且優(yōu)選地具有優(yōu)于親本抗體的那些特性的特性。例如，由于OX40L不僅在B細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上瞬時(shí)表達(dá)，還在內(nèi)皮細(xì)胞(Kotani，A.，等.，Immunol.Lett.84(2002)1-7)、呼吸道平滑肌細(xì)胞(＝ASM)(Burgess，J.K.，J.Allergy Clin.Immunol 113(2004)683-689)和小膠質(zhì)細(xì)胞(Weinberg，A.D.，等.，J.Immunol.162(1999)1818-1826)上瞬時(shí)表達(dá)，所以，所述變體可以在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘過程中具有減小的副作用。針對(duì)OX40L的抗體與內(nèi)皮細(xì)胞、ASM和小膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)合可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并且與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致血管滲漏，與ASM細(xì)胞結(jié)合導(dǎo)致肺部毀壞，與小膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致小膠質(zhì)的損傷。
在本文中，“親本”抗體是由用于制備變體的氨基酸序列編碼的一種抗體。優(yōu)選地，所述親本抗體具有人構(gòu)架區(qū)域，并且如果存在，具有人抗體恒定區(qū)。例如，所述親本抗體可以是人源化的或人抗體，優(yōu)選為IgG1型。
另外，按照本發(fā)明的抗體包括具有“保守序列修飾”、核苷酸和氨基酸序列修飾的這樣的抗體，所述修飾不影響或者改變按照本發(fā)明的抗體的上述提及的特征。修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入，諸如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變技術(shù)。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代的那些取代。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)的、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)的、不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)的、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)的、β-支化側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)的和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，人抗-OX40L抗體的預(yù)計(jì)的非必需氨基酸殘基可以優(yōu)選地用來自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基取代。
氨基酸取代可以通過基于Riechmann，L.，等.，Nature 332(1988)323-327和Queen，C.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033描述的制作分子模型的誘變進(jìn)行。
本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生抗體的方法，其特征在于，對(duì)編碼以小于10-8M的KD值結(jié)合OX40L的抗體的重鏈的第一核酸序列以這樣的方式進(jìn)行修飾，以致所修飾的抗體不與NK細(xì)胞上的補(bǔ)體因子C1q和/或人Fcγ受體結(jié)合，將所述修飾的第一核酸和編碼所述抗體輕鏈的第二核酸插入到表達(dá)載體中，將所述載體插入到原核或真核宿主細(xì)胞中，在允許所述抗體合成的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞并且從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體。
本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生按照本發(fā)明并且包括來源于人源的Fc片段的抗體的方法，所述方法包括下列步驟a)用編碼按照本發(fā)明的親本人抗體輕鏈的第一核酸序列和編碼所述親本人抗體重鏈的第二DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中Fc片段被修飾，使得所述Fc片段不結(jié)合補(bǔ)體因子C1q和/或Fc受體；b)表達(dá)所述第一和第二DNA序列，以致產(chǎn)生所述抗體重鏈和輕鏈；和c)從宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述抗體。
本發(fā)明還包括編碼上文提及的抗體的核酸分子、包括這些核酸的相應(yīng)的載體和用于這些載體的相應(yīng)的宿主細(xì)胞。本發(fā)明包括用于制備所述抗體的方法，其包括在允許合成所述抗體的條件下培養(yǎng)相應(yīng)的宿主細(xì)胞，并且從所述培養(yǎng)物回收所述抗體，例如，通過在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼重鏈的核酸和編碼輕鏈的核酸，并且從所述細(xì)胞回收所述多肽來實(shí)現(xiàn)。
考慮了所述抗體的診斷和治療應(yīng)用。在一種診斷應(yīng)用中，本發(fā)明提供確定OX40L蛋白存在的方法，其包括將懷疑含有OX40L的樣品暴露于抗-OX40L抗體，并且確定抗體與樣品的結(jié)合。OX40L蛋白可以通過其跨膜結(jié)構(gòu)域插入到表達(dá)OX40L的細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)，或者可以作為通過如脫落(shedding)或蛋白水解釋放的機(jī)制釋放到體液中的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域而存在。對(duì)于這種應(yīng)用，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括所述抗體和應(yīng)用所述抗體檢測(cè)OX40L蛋白的用法說明。
本發(fā)明的抗體有效用于預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物中的、優(yōu)選地懷疑患有或者遭受這樣的疾病折磨的患者中的炎癥疾病。這樣的疾病包括過敏性反應(yīng)，諸如哮喘。其它應(yīng)用是自體免疫疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。
本發(fā)明還提供用于治療遭受上文提及的炎癥疾病，特別是哮喘和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的折磨的哺乳動(dòng)物的方法。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體可以用于治療患者中的嚴(yán)重頑固性哮喘，所述患者的癥狀沒有充分受到吸入的糖皮質(zhì)激素的控制。患者群體包括患有不充分控制的嚴(yán)重頑固性哮喘的成人和青少年(12歲或年齡更大的)?？贵w將優(yōu)選地通過皮下遞送每月一次或兩次。主要的終點(diǎn)(endpoint)將優(yōu)選地在急性惡化中下降。其它終點(diǎn)包括峰值流量、日間哮喘癥狀、夜間醒來、生活質(zhì)量、急診室隨訪、沒有哮喘的天數(shù)、β-2激動(dòng)劑應(yīng)用、類固醇減少或逐漸減弱以及對(duì)高-響應(yīng)性的作用。
還優(yōu)選將按照本發(fā)明的抗體用于單一治療或者與甲氨喋呤或其它DMARDs(疾病修飾的抗-類風(fēng)濕性藥物，Disease ModifyingAnti-Rheumatic Drugs)組合來治療患有中等到嚴(yán)重急性(active)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成年人。它將作為每2或4周的皮下注射進(jìn)行施用。它將在對(duì)一種或多種DMARDs無效的患者中進(jìn)行慢性治療。終點(diǎn)包括患有急性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成年患者中的跡象和癥狀的減少以及結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)展的抑制。無能力的預(yù)防、跡象和癥狀的改善通過ACR標(biāo)準(zhǔn)(ACR20＞60％，ACR50＞35％，ACR70＞15％；指數(shù)來源于American College of Rheumatology；www.rheumatology.com)進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是按照本發(fā)明的抗體用于制備治療這些疾病的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及上文定義的抗體用于制備藥物組合物的應(yīng)用，并且包括藥物組合物，其包含按照本發(fā)明的抗體，與藥物有效量、任選地與用于配制藥物目的的抗體的緩沖劑和/或佐劑。
本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含在藥用載體中的這樣的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物可以包含在一套產(chǎn)品或試劑盒中。
按照本發(fā)明的抗體優(yōu)選地通過重組方法產(chǎn)生。這樣的方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，并且包括在原核和真核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，隨后分離抗體多肽，并且通常純化到藥學(xué)可用的純度。對(duì)于蛋白表達(dá)，將編碼輕鏈和重鏈或其片段的核酸通過標(biāo)準(zhǔn)方法插入到表達(dá)載體中。表達(dá)在適宜的原核或真核宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、酵母、或大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中進(jìn)行，并且將所述抗體從所述細(xì)胞回收(裂解后的上層清液或細(xì)胞)。
抗體的重組生產(chǎn)是本領(lǐng)域公知的，并且例如，在Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等.，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，等.，Arzneimittelforschung 48(1998)870-880的綜述論文中描述。
所述抗體可以存在于完整的細(xì)胞中、細(xì)胞裂解物中、或者以部分純化或基本上純化的形式存在。為了除去其它細(xì)胞成分或其它污染物，例如，其它細(xì)胞核酸或蛋白，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/SDS處理、柱層析和其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行純化。參見，Ausubel，F(xiàn).，等.，ed.，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
例如，在NS0細(xì)胞中的表達(dá)由Barnes，L.M.，等.，Cytotechnology 32(2000)109-123；和Barnes，L.M.，等.，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。例如，瞬時(shí)表達(dá)由Durocher，Y.，等.，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的克隆由Orlandi，R.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等.，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(HEK 293)由Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，在Cytotechnology 30(1999)71-83中和由Schlaeger，E.-J.，在J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中描述。
例如，適用于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞應(yīng)用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)。
當(dāng)它處于與其它核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，核酸是“可操作地連接的”。例如，如果它作為參與多肽分泌的前蛋白而表達(dá)，那么，將前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA可操作地連接到多肽DNA上；如果它影響所述序列的轉(zhuǎn)錄，那么將啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接到編碼序列上；或者如果它位于促進(jìn)翻譯的位置時(shí)，將核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接到編碼序列上。一般地，“可操作地連接”意指要連接的DNA序列是相鄰的，并且，在分泌性前導(dǎo)序列的情形中，是相鄰的并且在閱讀框內(nèi)。然而，增強(qiáng)子不必是相鄰的。連接通過在便利的限制性位點(diǎn)的連接而實(shí)現(xiàn)。如果不存在這樣的位點(diǎn)，那么，按照常規(guī)應(yīng)用，使用合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。
通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法，諸如，例如，蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將單克隆抗體適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基中分離。應(yīng)用常規(guī)方法，易于對(duì)編碼單克隆抗體的DNA和RNA進(jìn)行分離和測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可以作為這樣的DNA和RNA的來源。一旦分離，可以將DNA插入到表達(dá)載體中，然后將其轉(zhuǎn)染不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞，諸如HEK 293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中獲得重組單克隆抗體的合成。
人OX40L抗體的氨基酸序列變體(或突變體)通過將適宜的核苷酸改變引入抗體DNA中或通過核苷酸合成而制備。然而，這樣的修飾可以只在非常有限的范圍內(nèi)如上文所述的那樣進(jìn)行。例如，所述修飾不改變上述提及的抗體特性，諸如IgG同種型和表位結(jié)合特性，但是可以提高重組生產(chǎn)的產(chǎn)量、蛋白穩(wěn)定性或者促進(jìn)純化。
還可以將任何不參與保持抗-OX40L抗體的正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基取代，通常用絲氨酸取代，以提高所述分子的氧化穩(wěn)定性，并且防止異常交聯(lián)。相反，可以向所述抗體中加入半胱氨酸鍵，以提高其穩(wěn)定性(特別地當(dāng)所述抗體是抗體片段諸如Fv片段時(shí))。
可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法制備編碼抗-OX40L抗體的氨基酸變體的核酸分子。這些方法包括，但不限于，從天然來源分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情形中)或通過人源化-OX40L抗體更早制備的變體或非變體譯本的寡聚核苷酸-介導(dǎo)的(或定點(diǎn)的)誘變、PCR誘變、和盒式誘變而制備。
本發(fā)明還關(guān)于免疫綴合物，其包括綴合到細(xì)胞毒性劑，諸如化療劑、毒素(例如，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶促活性毒素、或其片段)、放射活性同位素(即，放射性綴合物)上的按照本發(fā)明的抗體。抗體和細(xì)胞毒性劑的綴合物應(yīng)用各種雙功能蛋白偶聯(lián)劑諸如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、iminothiolane(IT)、亞氨酸酯的雙官能衍生物；(諸如dimethyl adipimidate HCL)、活性酯(諸如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮基苯甲基)己二胺)、雙-二氮鎓衍生物(諸如雙-(對(duì)-二氮鎓苯甲基)-ethylenediatnine)、二異氰酸酯(諸如tolyene 2，6-二異氰酸酯)和雙-活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)而制備。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以按照在Vitetta，E.S.，等.，Science 238(1987)1098-1104)中所述的那樣進(jìn)行制備。碳-14-標(biāo)記的l-異氰硫基苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種用于將放射性核苷酸偶聯(lián)到抗體上的示例性螯合劑。參見WO 94/11026。
所述抗體的另一種類型的共價(jià)修飾包括以在美國專利號(hào)4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中提出的方式將抗體連接到各種非蛋白質(zhì)聚合物中的一種上，例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
在另一方面，本發(fā)明提供從轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因小鼠分離的B細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物表達(dá)人抗-OX40L抗體(例如，由選自產(chǎn)生按照本發(fā)明的抗體的雜交瘤細(xì)胞組成的組的細(xì)胞系產(chǎn)生的親本抗體)。優(yōu)選地，分離的B細(xì)胞從轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因小鼠而獲得，所述轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物已經(jīng)用純化的或重組形式的OX40L抗原和/或表達(dá)OX40L的細(xì)胞免疫。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠，具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，其編碼完整的或部分的本發(fā)明的抗體。然后，使分離的B細(xì)胞無限增殖以提供人抗-OX40L抗體的來源(例如，雜交瘤)。因此，本發(fā)明還提供能夠產(chǎn)生按照本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的B細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，其編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分，被融合到無限增殖的細(xì)胞上。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因小鼠，其具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，所述基因組編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分。所述轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物可以用OX40L抗原的純化的或富集制劑和/或表達(dá)OX40L的細(xì)胞進(jìn)行免疫。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生針對(duì)OX40L的人單克隆抗體的同種型。
按照本發(fā)明的人單克隆抗體可以通過用OX40L抗原的純化的或富集制劑和/或表達(dá)OX40L的細(xì)胞來免疫轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因小鼠而產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因非-人動(dòng)物具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，所述基因組編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分。然后得到所述動(dòng)物的B細(xì)胞(例如脾B細(xì)胞)，并且與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成分泌針對(duì)OX40L的人單克隆抗體的無限增殖的雜交瘤細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，針對(duì)OX40L的人單克隆抗體可以使用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠而產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因小鼠，本文叫作″HuMAb″小鼠，含有編碼未重排的人免疫球蛋白基因的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)(所述未重排的人免疫球蛋白基因包括重(μ和γ)和κ輕鏈(恒定區(qū)基因))，以及使內(nèi)源μ和κ鏈基因座失活的目標(biāo)突變(Lonberg，N.，等.，Nature 368(1994)856-859)。因此，所述小鼠表現(xiàn)出減少的小鼠IgM或K的表達(dá)，并且響應(yīng)免疫，所引入的人重和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷了種類轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，以產(chǎn)生高親和力的人IgG單克隆抗體(Lonberg，N.，等.，Nature 368(1994)856-859；在Lonberg，N.，Handbook ofExperimental Pharmacology 113(1994)49-101中綜述；Lonberg，N.，和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93；和Harding，F(xiàn).，和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci.764(1995)536-546)。HuMAb小鼠的制備在Taylor，L.，等.，Nucleic Acids Res.20(1992)6287-6295；Chen，J.，等.，Int.Immunol.5(1993)647-656；Tuaillon，N.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)3720-3724；Choi，TK.，等.，Nat.Genet.4(1993)117-123；Chen，J.，等.，EMBO J.12(1993)821-830；Tuaillon，N.，等.，J.Immunol.152(1994)2912-2920；Lonberg，N.，等.，Nature 368(1994)856-859；Lonberg，N.，Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101；Taylor，L.，等.，Int.Immunol.6(1994)579-591；Lonberg，N.，和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93；Harding，F(xiàn).，和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci.764(1995)536-546；Fishwild，D.M.，等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述，所有這些的內(nèi)容通過參考完全結(jié)合于此。還可以參見，美國專利號(hào)5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,545,807；5,770,429；WO 98/24884；WO 94/25585；WO 93/1227；WO 92/22645；和WO 92/03918。
為了充分地產(chǎn)生針對(duì)OX40L的人單克隆抗體,可以按照常規(guī)方法，如由Lonberg，N.，等.，Nature 368(1994)856-859；Fishwild，D.M.，等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO 98/24884所描述的那樣，將HuMAb小鼠用OX40抗原純化的或富集的制劑和/或表達(dá)OX40L的細(xì)胞進(jìn)行免疫。優(yōu)選地，在第一次免疫時(shí)，小鼠應(yīng)該是6-16周齡。例如，可以使用偶聯(lián)到KLH上的或在PBS中的可溶OX40L抗原(例如，從表達(dá)OX40L的細(xì)胞純化的)的純化的或富集的制劑來腹膜內(nèi)免疫HuMAb小鼠。這可以通過用分離的OX40L蛋白與表達(dá)OX40L的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞系交替免疫而組合，以促進(jìn)免疫應(yīng)答。使用各種抗原累積的經(jīng)驗(yàn)表明，當(dāng)初始用在完全弗氏佐劑中的抗原進(jìn)行腹膜內(nèi)(i.p.)免疫時(shí)，其后每隔一周用在不完全弗氏佐劑中的抗原i.p.免疫(例如，達(dá)到總共6次)，HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)答最好。免疫應(yīng)答可以用從后眼眶采血獲得的血漿樣品而在免疫流程的過程中進(jìn)行監(jiān)測(cè)。血漿可以通過ELISA進(jìn)行篩選，并且具有足夠的抗-OX40L人免疫球蛋白滴度的小鼠可以用于使得相應(yīng)的B細(xì)胞無限增殖。在處死和移除脾和淋巴結(jié)前3-4天，可以用抗原將小鼠靜脈內(nèi)增強(qiáng)。一些小鼠將對(duì)于每種抗原進(jìn)行免疫。例如，總共HCo7和HCo12種系的12只HuMAb小鼠可以被免疫。
HCo7小鼠具有在其內(nèi)源輕鏈(κ)基因中的JKD中斷(如在Chen，J.，等.，EMBO J.12(1993)821-830中所述)、在其內(nèi)源重鏈基因中的CMD中斷(如在WO 01/14424實(shí)施例1中所述)、KCo5人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因(如在Fishwild，D.M.，等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所述)、和HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因(如在美國專利號(hào)5,770,429中所述)。
HCo12小鼠具有在其內(nèi)源輕鏈(κ)基因中的JKD中斷(如在Chen，J.，等.，EMBO J.12(1993)821-830中所述)、在其內(nèi)源重鏈基因中的CMD中斷(如在WO 01/14424實(shí)施例1中所述)、KCo5人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因(如在Fishwild，D.M.，等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所述)、和Hco 12人重鏈轉(zhuǎn)基因(如在WO 01/14424實(shí)施例2中所述)?？梢詫⑿∈蟮牧馨图?xì)胞分離，并且基于標(biāo)準(zhǔn)流程使用PEG與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。然后，篩選得到的雜交瘤關(guān)于抗原-特異性抗體的產(chǎn)生。例如，用50％PEG，將來自于免疫小鼠的脾和淋巴結(jié)來源的淋巴細(xì)胞的單一細(xì)胞混懸液與1/6數(shù)目的SP 2/0非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL 1581)融合。將細(xì)胞以大約2×105接種在平底微量滴定培養(yǎng)平板上，其中在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2周。
然后，對(duì)于人抗-OX40L單克隆IgM和IgG抗體，通過ELISA篩選單個(gè)孔。一旦廣泛的雜交瘤生長發(fā)生，通常在10-14天后，分析培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞重新接種，再次篩選，并且如果仍然對(duì)于人IgG、抗-OX40L單克隆抗體是陽性的，那么可以通過限制性稀釋亞克隆至少2次。然后，將穩(wěn)定的亞克隆在體外培養(yǎng)，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生抗體用于表征。
檢測(cè)樹主要由關(guān)于IgG的非特異性檢測(cè)(“IgG-ELISA”)、接著通過特異性ELISA檢測(cè)和外觀(apparent)FACS檢測(cè)組成，用來確定與純化的OX40L蛋白或OX40L-表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的抗原。下一步驟包括功能性檢測(cè)，其中確定了抗OX40L抗體與其天然相互作用伴侶，例如對(duì)于純化的OX40L或者在細(xì)胞上表達(dá)的OX40L的可溶的、純化的OX40，的競爭，例如，競爭性ELISA或FACS。下一步驟包括功能性檢測(cè)，其中確定了抗-OX40L抗體阻滯OX40-信號(hào)傳導(dǎo)的能力，例如，NFκB-活化(＝“NFκB-檢測(cè)”)。下一步驟包括功能性檢測(cè)，其中確定了抗-OX40L抗體關(guān)于T細(xì)胞活化的阻滯能力(“T-細(xì)胞活化檢測(cè)”和“TT-檢測(cè)”)。
由于CDR序列負(fù)責(zé)抗體-抗原的相互作用，所以，可能通過在來自于不同的人抗體的構(gòu)架序列上構(gòu)建表達(dá)載體而表達(dá)按照本發(fā)明的重組抗體，所述表達(dá)載體包括按照本發(fā)明的CDR序列(參見，例如，Riechmann，L.，等.，Nature 332(1998)323-327；Jones，P.，等.，Nature 321(1986)522-525；和Queen，C.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033)。這樣的構(gòu)架序列可以從包括種系人抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫獲得。由于這些種系序列不包括在B細(xì)胞成熟過程中通過V(D)J連接而形成的完全組裝的可變基因，所以，這些種系序列不同于成熟的抗體基因序列。種系基因序列還在個(gè)體均一地貫穿可變區(qū)不同于高親和力次級(jí)所有成分抗體的序列。
本發(fā)明還包括按照本發(fā)明的抗體用于在體外診斷OX40L的應(yīng)用，優(yōu)選地通過確定樣品的OX40L(可溶的或膜-結(jié)合的)與按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合的免疫學(xué)檢測(cè)。
在另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如，藥物組合物，其包含一種或者本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原-結(jié)合部分的組合，與藥用載體一起配制。更具體地，所述組合物是藥物或診斷組合物，并且甚至更具體地，所述藥物組合物包括上文定義的抗體和至少一種藥用賦形劑。所述組合物必須是無菌的，并且在某種程度上是流體，以便于通過注射器遞送所述組合物。
當(dāng)用于本文時(shí)，“藥用載體”包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散基質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，所述載體適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或灌注)。優(yōu)選地，這樣的載體是水性pH緩沖溶液(例如，乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或組氨酸)，優(yōu)選地等滲，優(yōu)選地另外含有無機(jī)鹽、糖、多羥基化合物和/或表面活性劑。藥用載體還是諸如在Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.Ed.(1980)中描述的那些。
抗體濃度優(yōu)選地從0.1mg/ml到50mg/ml。優(yōu)選地，1mM-200mM緩沖濃度的緩沖溶液的pH值在4.0-8.0范圍。優(yōu)選的鹽是1mM-200mM范圍的氯化鈉和/或磷酸鈉。優(yōu)選的糖是在1％-15％(w/v)范圍的蔗糖和/或海藻糖。優(yōu)選的多羥基化合物是1％-15％(w/v)范圍的丙三醇、丙二醇、液體聚乙二醇、和/或類似的。表面活性劑優(yōu)選地是0.001％-0.5％(w/v)范圍的聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯20或80)和/或poloxamere。優(yōu)選的藥物組合物含有0.1mg/ml-50 mg/ml的抗體和1mM-200mM pH 4.0-8.0磷酸緩沖的鹽。
本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種方法施用給需要其的患者。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解，施用的途徑和/或方式將取決于需要的結(jié)果而不同。
藥用賦形劑或載體包括無菌水性溶液或無菌粉劑，用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散液。藥物活性物質(zhì)的這樣的介質(zhì)和試劑的應(yīng)用是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。
當(dāng)用于本文時(shí)，短語“腸胃外施用”和“腸胃外地施用”意指除了腸和局部施用外的施用模式，通常通過注射的方式，并且包括但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管的、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬腦膜外和胸骨內(nèi)的注射和灌注。
在本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際給藥水平可以不同，以便獲得一定量的活性成分，所述一定量的活性成分有效實(shí)現(xiàn)對(duì)于具體的患者、組合物和施用模式的理想的治療反應(yīng)，而對(duì)患者沒有毒性。選擇的給藥水平將取決于許多藥物動(dòng)力學(xué)因素，包括所用的本發(fā)明的具體的組合物或其酯、鹽或胺的活性，施用的途徑，施用的時(shí)間，要用的具體化合物排泄速率，治療的持續(xù)時(shí)間，與所用的具體組合物組合應(yīng)用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)，要治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、綜合健康狀體和現(xiàn)有病歷等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公知的因素。典型的每周給藥劑量可以在約0.1mg/kg-約20mg/kg的范圍或更多，這取決于上文提及的因素。
提供下述實(shí)例、參考文獻(xiàn)、序列表和附圖，以輔助對(duì)本發(fā)明的理解，它們的真正范圍在附上的權(quán)利要求中列出。應(yīng)該理解，可以以不背離本發(fā)明的精神對(duì)提出的方法進(jìn)行改進(jìn)。
附圖簡述

圖1a顯示TAG-34，LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033的“結(jié)合ELISA”。
圖1b顯示TAG-34，LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033的“阻滯ELISA”+IC50數(shù)據(jù)。
圖2顯示TAG-34，LC.001，LC.005的“封閉FACS”。
圖3顯示TAG-34，LC.001，LC.019和LC.024(不結(jié)合的抗體)的“NFkB-檢測(cè)”。
圖4和5顯示TAG-34，LC.001和LC.005的“T細(xì)胞活化檢測(cè)”和IC50-值(圖4IL-2釋放，圖5抑制)。
圖6顯示TAG-34，LC.001和LC.033的“TT-檢測(cè)”數(shù)據(jù)。
圖7顯示本發(fā)明的抗體與小鼠OX40L的交叉反應(yīng)性。A)對(duì)于在轉(zhuǎn)染的和WT細(xì)胞上表達(dá)的hOX40L的控制，B)抗體與表達(dá)hOX40L的K562細(xì)胞的結(jié)合，C)對(duì)于在轉(zhuǎn)染的和WT細(xì)胞上表達(dá)mOX40L的控制，D)抗體與表達(dá)hOX40L的K562細(xì)胞的結(jié)合，和E)抗體與WT K562細(xì)胞的結(jié)合(n＝3)。
圖8顯示本發(fā)明的抗體結(jié)合C1q的能力(n＝3)。
圖9顯示本發(fā)明的抗體激活C3c的能力(n＝3)。
圖10顯示本發(fā)明的抗體結(jié)合FcγRI(n＝4)、FcγRIIa(n＝4)和FcγRIIb(n＝4)的能力。
圖11顯示本發(fā)明的抗體結(jié)合NK細(xì)胞上FcγRIIIa(CD16)的能力(6個(gè)供體的平均值±SEM)。
圖12蛋白質(zhì)印跡；泳道1，4，7標(biāo)記；泳道2，5，8100ng OX40L；泳道3，6，940ng OX40L。
序列表描述SEQ ID NO1κ輕鏈，LC.001的可變區(qū)SEQ ID NO2LC.001的γ重鏈可變區(qū)SEQ ID NO3κ輕鏈，LC.005的可變區(qū)SEQ ID NO4LC.005的γ重鏈可變區(qū)SEQ ID NO5κ輕鏈，LC.010的可變區(qū)SEQ ID NO6LC.010的γ重鏈可變區(qū)SEQ ID NO7κ輕鏈，LC.029的可變區(qū)SEQ ID NO8LC.029的γ重鏈可變區(qū)SEQ ID NO9κ輕鏈，LC.019的可變區(qū)
SEQ ID NO10LC.019的γ重鏈可變區(qū)SEQ ID NO11κ輕鏈，LC.033的可變區(qū)SEQ ID NO12LC.033的γ重鏈可變區(qū)SEQ ID NO13κ輕鏈恒定區(qū)SEQ ID NO14γ1重鏈恒定區(qū)SEQ ID NO15γ4重鏈恒定區(qū)SEQ ID NO16κ輕鏈，LC.033的突變可變區(qū)SEQ ID NO1 κ輕鏈，LC.059的可變區(qū)SEQ ID NO17LC.059的γ重鏈可變區(qū)SEQ ID NO18κ輕鏈，LC.060的可變區(qū)SEQ ID NO19LC.060的γ重鏈可變區(qū)SEQ ID NO1 κ輕鏈，LC.063的可變區(qū)SEQ ID NO20LC.063的γ重鏈可變區(qū)SEQ ID NO21-57 CDR序列SEQ ID NO58LC.001的γ重鏈(人IgG1型)SEQ ID NO59LC.001的γ重鏈(L234A，L235A人IgG1突變體)SEQ ID NO60LC.001的γ重鏈(S228P人IgG4突變體)SEQ ID NO61LC.001的κ輕鏈SEQ ID NO62LC.005的γ重鏈(人IgG1型)SEQ ID NO63LC.005的γ重鏈(L234A，L235A人IgG1突變體)SEQ ID NO64LC.005的γ重鏈(S228P人IgG4突變體)SEQ ID NO65LC.005的κ輕鏈SEQ ID NO66LC.060的γ重鏈(人IgG1型)SEQ ID NO67LC.060的γ重鏈(L234A，L235A人IgG1突變體)SEQ ID NO68LC.060的γ重鏈(S228P人IgG4突變體)SEQ ID NO69LC.060的κ輕鏈縮略詞氨基酸縮寫為3個(gè)(Leu)或1個(gè)字母編碼(L)。
S228P意指在IgG4重鏈位置228的絲氨酸與脯氨酸的置換。
L234意指按照EU編號(hào)方式(Kabat)在位置234的氨基酸亮氨酸。
L234A意指在位置234的氨基酸亮氨酸變成丙氨酸。
L235A意指在位置235的氨基酸亮氨酸變成丙氨酸。
PVA236意指在236區(qū)域，IgG1的ELLG或者IgG4的EFLG被修改成PVA。
GLPSS331意指在331區(qū)域，IgG1的ALPAP或IgG2的GLPAP變成GLPSS。
ΔG236意指位置236的氨基酸被刪除。
IgG4x意指IgG4中突變S228P。
LC2010-001是LC.001的異名。
Fcg是Fcgamma(Fcγ)的異名。
抗體的其它序列修改類似地定義。
實(shí)施例實(shí)施例1產(chǎn)生生產(chǎn)抗-0X40L抗體的雜交瘤細(xì)胞系雜交瘤的培養(yǎng)在IMDM(Cambrex)，胎克隆1牛血清(Perbio Science)，原始雜交瘤克隆因子(Igen)，丙酮酸鈉，青霉素/鏈霉素，2-巰基乙醇，HAT(Sigma-Aldrich)和卡那霉素(Invitrogen)中，在37℃和5％CO2，培養(yǎng)HuMab雜交瘤細(xì)胞。
轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫流程LC2010-001將6只HCo7(2只雄性和4只雌性)，種系GG2201(Medarex，San José，CA，USA)，和4只HCo12(4只雄性)，種系GG2198(Medarex，San José，CA，USA)交互地用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了人OX40L(hOX40L)表達(dá)載體的1×106個(gè)HEK293細(xì)胞和20μg hOX40L可溶的胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行免疫?？偣策M(jìn)行8次免疫，4次用表達(dá)hOX40L的細(xì)胞進(jìn)行腹膜內(nèi)(i.p.)免疫，和4次在尾巴底部用重組蛋白進(jìn)行皮下(s.c.)免疫。對(duì)于第一次免疫，將100μl 1×106個(gè)HEK293-hOX40L細(xì)胞與100μl完全弗氏佐劑(CFA；Difco Laboratories，Detroit，USA)混合。對(duì)于所有其它的免疫，使用100μl在PBS中的細(xì)胞，或者將重組蛋白與100μl不完全弗氏佐劑(ICFA；Difco)混合。
當(dāng)發(fā)現(xiàn)抗-hOX40L的血清滴度足夠時(shí)，在融合前4和3天，將小鼠用在200μl PBS中的15μg hOX40L胞外結(jié)構(gòu)域另外靜脈內(nèi)(i.v.)增強(qiáng)2次。
LC2010-001，LC.059，LC.060和LC.063來源于HCo12小鼠。
LC2010-005，-010，-019，-029和-033將5只HCo7(4只雄性和1只雌性)，種系GG2201(Medarex，San José，CA，USA)用20μghOX40L可溶的胞外結(jié)構(gòu)域免疫?？偣苍谖舶偷撞窟M(jìn)行7次免疫，4次腹膜內(nèi)(i.p.)和3次皮下(s.c.)免疫。對(duì)于第一次免疫，將100μl重組蛋白與100μl完全弗氏佐劑(CFA；Difco Laboratories，Detroit，USA)混合。對(duì)于所有其它的免疫，將100μl重組蛋白與100μl不完全弗氏佐劑(ICFA；Difco)混合.
當(dāng)發(fā)現(xiàn)抗-hOX40L的血清滴度足夠時(shí)，在融合前4和3天，將小鼠用在200μl PBS中的15μg hOX40L胞外結(jié)構(gòu)域另外靜脈內(nèi)(i.v.)增強(qiáng)2次。
雜交瘤的產(chǎn)生將小鼠處死，并且收集脾和在腹部大動(dòng)脈和腔靜脈側(cè)面的淋巴結(jié)。按照標(biāo)準(zhǔn)操作方法，用融合伴侶SP 2.0細(xì)胞進(jìn)行脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞的融合。
抗原特異性ELISA通過抗原特異性ELISA確定免疫小鼠血清中的抗-OX40L滴度。將平板(96平底ELISA平板，Greiner)用溶解在PBS中的0.1μg/ml純化的OX40L包被，并且在室溫下包被過夜。此后，在室溫下將孔用PBSTC(含有0.05％吐溫20(Sigma-Aldrich Chemie BV)和2％雞血清(Gibco)的PBS)封閉1小時(shí)。
將檢測(cè)的血清樣品(taps)在PBSTC中1∶50稀釋，并且添加到孔中。將從免疫前小鼠獲得的血清1∶100溶解在PBSTC中，并且用作陰性對(duì)照。將針對(duì)人OX40L的小鼠抗體1∶50溶解在PBSTC中，并且用作陽性對(duì)照。將平板在室溫溫育1小時(shí)。隨后，將平板用PBST(含有0.05％Tween 20的PBS)洗滌2次。將Gt-α-huIgG-HRP(Jackson)1∶5000稀釋在PBSTC中，并且添加到含有測(cè)試樣品和陰性對(duì)照的孔中。將Rb-α-mIgG(Jackson)1∶3000稀釋在PBSTC中，并且添加到含有陽性對(duì)照的孔中。將平板在室溫下溫育1小時(shí)。最后，將平板用PBST洗滌3次，并且用新鮮制備的ABTS溶液(1mg/ml)(ABTS2，2’-疊氮基雙(3-乙苯基噻唑啉-6-磺酸))在室溫下黑暗處反應(yīng)30分鐘。在405nm處測(cè)定吸收。
κ-ELISA為了確定由融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞是否產(chǎn)生人抗體，進(jìn)行了κ-ELISA。將ELISA平板用在PBS中1/10000稀釋的大鼠抗-人IgGκ-輕鏈抗體(DAKO)包被，在4℃培養(yǎng)過夜。棄去細(xì)胞后，將平板通過在室溫下與PBSTC(PBSC，補(bǔ)充了0.05％吐溫-20(PBSTC))溫育1小時(shí)進(jìn)行封閉。此后，將孔用1/2稀釋在PBSTC中的雜交瘤培養(yǎng)物上層清液溫育。1/2稀釋在PBSTC中的培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照，1/100稀釋在PBSTC中的κ-輕鏈陽性小鼠血清用作陽性對(duì)照。隨后，將孔洗滌3次，并且在37℃，用1/2000稀釋在PBSTC中的HRP-綴合的大鼠抗-人IgGF(ab’)2(DAKO)溫育1h。將孔洗滌3次，并且在室溫下(RT)黑暗處用新鮮制備的ABTS溶液(1mg/ml)進(jìn)行檢測(cè)30分鐘。在ELISA平板讀數(shù)儀上測(cè)定405nm的吸收。
實(shí)施例2抗-OX40L HuMab可變結(jié)構(gòu)域的克隆和測(cè)序(κ-輕鏈和γ1-重鏈)通過標(biāo)準(zhǔn)cDNA合成/PCR方法，分離編碼OX40L HuMabs的輕鏈可變區(qū)VL和重鏈可變區(qū)VH的核苷酸序列。
使用GeneRacerTM試劑盒(Invitrogen)，從1×106-1×107個(gè)雜交瘤細(xì)胞中制備總RNA。來源于雜交瘤的RNA用作第1鏈cDNA合成和GeneRacerTMOligo-dT引物連接的模板。第2鏈cDNA合成和編碼VL與VH的cDNA片段的進(jìn)一步PCR擴(kuò)增分別用反向輕鏈和重鏈引物和5’-特異的GeneRacerTM引物進(jìn)行，所述反向輕鏈和重鏈引物與κ-輕鏈和γ1-重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)。使用來自InvitrogenTMLife Technologies的TOPOTMTA克隆試劑盒，和pCR4-TOPOTM作為克隆載體，而將PCR產(chǎn)物克隆。通過使用EcoRI消化將適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒限制性繪圖，以及分別約740和790 bp的VL和VH的期望/計(jì)算的DNA片段大小，而確定克隆的PCR產(chǎn)物。
克隆的PCR片段的DNA序列通過雙鏈測(cè)序進(jìn)行確定。
GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)軟件包版本10.2和載體-NTI 8(InforMax，Inc)用于常規(guī)數(shù)據(jù)處理。使用GCG模CLUSTALW比對(duì)DNA和蛋白序列。使用程序GENEDOC(版本2.1)進(jìn)行序列比對(duì)。
實(shí)施例3構(gòu)建抗-OX40L IgG1 HuMab的表達(dá)質(zhì)粒將抗-OX40L HuMab輕鏈和重鏈的編碼基因分別組裝在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中。
因此，將編碼抗-OX40L HuMab輕鏈可變區(qū)(VL)和人κ-輕鏈恒定區(qū)(CL，SEQ ID NO13，或來自SEQ ID NO61，65或69)的基因片段連接起來，同樣地將抗-OX40L HuMab重鏈可變區(qū)(VH)和人γ1-重鏈恒定區(qū)(CH1-鉸鏈-CH2-CH3，SEQ ID NO14，或來自SEQ ID NO58，62或66)的基因片段連接起來。
關(guān)于從中可以推斷出密碼子應(yīng)用的人輕鏈和重鏈核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.，等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.，NIH Publication No.91-3242(1991)中給出。
抗-OX40L HuMab κ-輕鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下列元件組成-人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的直接早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，-包括Kozak序列的合成的5’-UT，-包括信號(hào)序列內(nèi)含子的小鼠免疫球蛋白重鏈信號(hào)序列，-克隆的抗-OX40L HuMab可變輕鏈cDNA，其用5’端唯一的BsmI限制性位點(diǎn)，和剪接供體位點(diǎn)，以及3’端唯一的NotI限制性位點(diǎn)而排列，-基因組人κ-基因恒定區(qū)，其包括內(nèi)含子2小鼠Ig-κ增強(qiáng)子[Picard，D.，和Schaffner，W.，Nature 307(1984)80-82]和-人免疫球蛋白κ-多聚腺苷酸化(“poly A”)信號(hào)序列。
抗-OX40L HuMab γ1-重鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下列元件組成-人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的直接早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，-包括Kozak序列的合成的5’-UT，-修飾的小鼠免疫球蛋白重鏈信號(hào)序列，其包括信號(hào)序列內(nèi)含子，-克隆的抗-OX40L HuMab可變重鏈cDNA，其用5’端唯一的BsmI限制性位點(diǎn)，和剪接供體位點(diǎn)，以及3’端唯一的NotI限制性位點(diǎn)而排列，
-基因組人γ1-重鏈基因恒定區(qū)，其包括小鼠Igμ-增強(qiáng)子(Neuberger，M.S.，EMBO J.2(1983)1373-1378)，-人γ1-免疫球蛋白多聚腺苷酸化(“poly A”)信號(hào)序列。
抗-OX40L HuMab κ-輕鏈和γ1-重鏈表達(dá)質(zhì)粒的功能性元件除了抗-OX40L HuMab κ-輕鏈或γ1-重鏈表達(dá)盒之外，這些質(zhì)粒還包含-潮霉素抗性基因-埃巴病毒(EBV)的復(fù)制起點(diǎn)，oriP-載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其允許這一質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，和-在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因。
實(shí)施例4構(gòu)建抗-OX40L IgG4 HuMab的表達(dá)質(zhì)粒抗-OX40Lγ4-重鏈原型表達(dá)質(zhì)粒衍生于抗-OX40Lγ1-重鏈表達(dá)質(zhì)粒，其通過用人基因組γ4-恒定區(qū)(SEQ ID NO15或來自SEQ ID NO60，64或68的未突變的γ4-恒定區(qū))和γ4-免疫球蛋白多聚腺苷化-信號(hào)序列取代人基因組γ1-恒定區(qū)和γ1-免疫球蛋白多聚腺苷化(“poly A”)信號(hào)序列。
對(duì)于抗-OX40L HuMab κ-輕鏈的表達(dá)，使用同用于IgG1所述相同的表達(dá)質(zhì)粒(參見上文)。
實(shí)施例5基于LC.001構(gòu)建突變體(變體)抗-OX40L IgG1和IgG4的表達(dá)質(zhì)粒使用QuickChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)，通過定點(diǎn)誘變野生型表達(dá)質(zhì)粒而生成編碼突變體抗-OX40L γ1-和γ4-重鏈的表達(dá)質(zhì)粒。按照EU編號(hào)方式(Edelman，G.M.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.，Public Health Service，NIH Publication No.91-3242，Bethesda，MD(1991))，對(duì)氨基酸進(jìn)行編號(hào)。
表1
實(shí)施例6重組抗OX40L HuMabs的生產(chǎn)重組HuMabs通過貼壁HEK293-EBNA細(xì)胞(ATTC CRL-10852)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生，所述HEK293-EBNA細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充了10％超低IgG FCS(Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％v/v非必需氨基酸(Gibco)和250μg/mlG418(Roche)的DMEM(Gibco)中。對(duì)于轉(zhuǎn)染，以3∶1-6∶1范圍的試劑(μl)比DNA(μg)的比例使用FugeneTM6(Roche)轉(zhuǎn)染試劑。使用1∶2-2∶1摩爾比例的輕鏈比重鏈編碼的質(zhì)粒，將免疫球蛋白輕鏈和重鏈從兩個(gè)不同的質(zhì)粒上表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后第4-11天，收集含有HuMab的細(xì)胞培養(yǎng)物上層清液。在純化前將上層清液保存在-20℃。
關(guān)于人抗體在例如HEK293中重組表達(dá)的一般信息在Meissner，P.，等，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203.中給出。
實(shí)施例7抗體TAG34，LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033的親和力分析儀器Biacore 3000，運(yùn)行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐溫20，ph 7.4)，25℃。分析物的注射在0.78nM和100nM之間的7個(gè)濃度進(jìn)行3分鐘，并且用HBS-P洗滌5分鐘。表面(羧甲基化的葡聚糖表面，CM)的再生通過每次10mM甘氨酸pH 2.0持續(xù)1min的2次注射而進(jìn)行。芯片、檢測(cè)形式和注射的順序以及動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與下表中的描述相對(duì)應(yīng)。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)通過將動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與1∶1 Langmuir結(jié)合模型相適配而計(jì)算。
表2
在TAG34和mOX40L之間沒有相互作用可以被測(cè)定。
對(duì)于所有Biacore檢測(cè)的數(shù)據(jù)評(píng)估和數(shù)據(jù)保存從樣品曲線中減去陰性對(duì)照數(shù)據(jù)(例如，緩沖液曲線)，以校正系統(tǒng)固有的基線漂移和減少噪聲信號(hào)。BiaEvaluation版本4.01用于Sensorgrams分析和親和力數(shù)據(jù)計(jì)算。
實(shí)施例8抑制hOX40L與固定的hOX40相互作用的抗-hOX40L抗體的抑制競爭檢測(cè)儀器Biacore 3000，運(yùn)行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐溫20，ph7.4)，25℃。注射前，將分析物(10nM)和競爭劑(在0.78nM和100nM之間的8個(gè)濃度)在22℃預(yù)先溫育至少20min。分析物+/-競爭劑的注射進(jìn)行3分鐘，并且用HBS-P洗滌3分鐘。表面的再生通過每次10mM甘氨酸pH 2.0持續(xù)1min的2次注射而進(jìn)行。芯片、檢測(cè)形式和注射的順序以及動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與下表3中的描述相對(duì)應(yīng)。
表3
所有的抗體抑制溶液中OX40L與OX40的結(jié)合(溶液親和力)。LC.001和LC.005表現(xiàn)出比TAG34更低的IC50-值。
實(shí)施例9抗-OX40L抗體TAG34，LC.001，LC.005，LC.010，LC.01 9，LC.029，LC.033，LC.060的表位特性描述儀器Biacore 3000，運(yùn)行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐溫20，ph7.4)，25℃。通過列出的抗體之間的交叉競爭而確定表位組。注射前，將分析物(50nM)和競爭劑(100nM)在22℃預(yù)先溫育至少20min。分析物+/-競爭劑的注射進(jìn)行2分鐘，并且用HBS-P洗滌3分鐘。表面的再生通過每次10mM甘氨酸pH 2.0持續(xù)1min的2次注射而進(jìn)行。芯片、檢測(cè)形式和注射的順序以及動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與下表4中的描述相對(duì)應(yīng)。
表4
TAG34識(shí)別的OX40L表位定義為表位A。然而，TAG34不結(jié)合抗體濃度為100ng的變性的OX40L(在蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)中)。在一個(gè)表位組(A或B)內(nèi)的抗體表現(xiàn)出交叉抑制活性，而不同組的抗體表現(xiàn)出附加的結(jié)合信號(hào)。LC.019中和來自組A以及組B的其它抗體。
實(shí)施例10TAG34，LC.001和LC.005與CD40L和TNFα的結(jié)合特異性儀器Biacore 3000，運(yùn)行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐溫20，ph 7.4)，25℃。分析物的注射在100nM和500nM進(jìn)行3分鐘，并且用HBS-P洗滌2分鐘。表面的再生通過每次100mMHCl持續(xù)1min的2次注射而進(jìn)行。芯片、檢測(cè)形式和注射的順序以及動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與下表5中的描述相對(duì)應(yīng)。
表5
在這種檢測(cè)中，CD40L表現(xiàn)出對(duì)所有抗體或?qū)π酒砻娴哪撤N非特異性結(jié)合，但是在減去背景信號(hào)后，這一檢測(cè)表明，不存在TNFα和CD40L(達(dá)到500nM)與固定的抗體TAG34，LC.001和LC.005的非特異性結(jié)合。
實(shí)施例11抗體LC.001-IgG1和LC.001-IgG4x的親和力分析儀器Biacore 3000，運(yùn)行和反應(yīng)緩沖液HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐溫20，ph 7.4)，25℃。分析物的注射在0.78nM-100nM的8個(gè)濃度進(jìn)行3分鐘，并且用HBS-P洗滌5分鐘。表面的再生通過每次100mM HCl持續(xù)1min的2次注射而進(jìn)行。芯片、檢測(cè)形式和注射的順序以及動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與下表中的描述相對(duì)應(yīng)。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)通過將動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與1∶1 Langmuir結(jié)合模型相適配而計(jì)算。
表6
LC.001和LC.001-IgG4x表現(xiàn)出對(duì)hOX40L-His相同的親和力。
實(shí)施例12
檢測(cè)與OX40L結(jié)合的抗體的ELISA檢測(cè)將SA-包被的平板(96平底ELISA平板，Microcoat)用溶解在溫育緩沖液(IB＝含有0.1％吐溫20(Serva)和1％封閉蛋白的PBS)中的0.5μg/ml生物素化的OX40L在室溫下包被1小時(shí)。然后，將平板用洗滌緩沖液(WB＝含有0.1％吐溫20的鹽水)洗滌2次。
將樣品(細(xì)胞培養(yǎng)物上層清液或純化的抗體)在IB中連續(xù)稀釋，并且添加到孔中。將平板在室溫下溫育1小時(shí)。隨后，將平板用WB洗滌2次。隨后，將針對(duì)人IgG的山羊抗體與POD(Dianova)的綴合物在IB中稀釋到50ng/ml，并且添加到孔中。平板在室溫下溫育1小時(shí)。最后，將平板用WB洗滌2次，并且在室溫(RT)下黑暗處用現(xiàn)成可用的ABTS溶液反應(yīng)。在最高濃度的吸收達(dá)到足夠的OD時(shí)，在405nm測(cè)量吸收(圖1a)。獲得3nM-8 nM范圍內(nèi)的EC50值。
實(shí)施例13檢測(cè)抑制人OX40/人OX40L相互作用的抗體的ELISA檢測(cè)將SA-包被的平板(96平底ELISA平板，Microcoat，德國)用溶解在IB中的0.5μg/ml生物素化的OX40L在室溫下包被1小時(shí)。然后，將平板用WB(PBS緩沖液，0.1％(w/v)吐溫TM20)洗滌2次。
將樣品在IB中稀釋到1μg/ml濃度，并且以連續(xù)稀釋添加到孔中。為了獲得OX40與OX40L的最大結(jié)合，在某些孔中只加入IB。然后，向每個(gè)孔中，加入濃度為0.2μg/ml的與洋地黃毒苷(Roche Diagnostics GmbH，DE)綴合的人OX40溶液。將平板在室溫下溫育1小時(shí)。隨后，將平板用WB洗滌2次。將綿羊<洋地黃毒苷>-POD(Roche)在IB中稀釋到50mU/ml，并且添加到孔中。平板在室溫下溫育1小時(shí)。最后，將平板用WB洗滌2次，并且在室溫(RT)下黑暗處用現(xiàn)成可用的ABTS溶液反應(yīng)。10-20分鐘后，在405nm測(cè)量吸收(圖1b)。獲得1nM-4nM范圍內(nèi)的IC50值。
實(shí)施例14
檢測(cè)抑制人OX40與在K562細(xì)胞(K562 OX40L細(xì)胞)上表達(dá)的人OX40L相互作用的HuMabs的FACS-檢測(cè)目的用于確定HuMab hOX40L阻滯Dig-標(biāo)記的hOX40hFc融合蛋白與表達(dá)hOX40L的細(xì)胞系K562 hOX40L相互作用的特性的檢測(cè)。
方法所述檢測(cè)用Dig標(biāo)記的hOX40hFc作為“檢測(cè)劑”和HuMabhOX40L作為“競爭劑”而進(jìn)行。
檢測(cè)劑儲(chǔ)液0.5μg/μl-1∶10稀釋在PBS中，100μl抗-洋地黃毒苷-FLUOS。1∶25稀釋在PBS/0.5％BSA/1％封閉試劑(Roche DiagnosticsGmbH，DE)中。
將2×105K562 OX40L細(xì)胞(在ISF-0中生長)在2ml PBS中洗滌，并且重懸在100μl PBS中。這之后加入在PBS中的競爭劑(競爭劑/試劑關(guān)系0∶1/1∶1/1.5∶1/2∶1/2.5∶2/5∶1)。這之后是30Min溫育時(shí)間，RT和白天光照。然后，加入試劑(在PBS中)；溫育時(shí)間30Min，RT和白天光照。將細(xì)胞在2ml PBS中洗滌，并且通過離心沉淀。加入用于染色的二級(jí)抗體(抗-洋地黃毒苷-熒光素，F(xiàn)ab-片段(Roche，1207741))，并且溫育30Min，4℃在黑暗處。將細(xì)胞在2ml PBS中洗滌，并且通過離心沉淀。之后將細(xì)胞重懸在0.5ml PBS中。樣品的測(cè)定在FACS-Scan中進(jìn)行(圖2)。
實(shí)施例15確定抗體對(duì)hOX40/hOX40L信號(hào)傳導(dǎo)的抑制能力的功能性檢測(cè)(，，NFκB-檢測(cè)“)將Hela野生型(wt)和表達(dá)人OX40的HeLa細(xì)胞(HeLa_OX40)生長在極限必需培養(yǎng)基(MEM)，1×丙酮酸鈉，1×非必需氨基酸(Gibco)，10％FCS中，并且在重組細(xì)胞的情形中，+600μg/ml G418。K562和表達(dá)OX40L的K562生長在ISF-O培養(yǎng)基中，并且在重組細(xì)胞的情形中，加入200μg/mlG418。
將HeLa_wt或HeLa_OX40細(xì)胞以3×104個(gè)細(xì)胞/100μl的細(xì)胞密度接種在96-孔平板中，w/o G418，并且在CO2-培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。以1∶1的細(xì)胞-比-細(xì)胞關(guān)系加入K562_wt或K562_OX40L細(xì)胞。將福爾馬林-固定的或沒有福爾馬林-固定的表達(dá)OX40L的K562細(xì)胞(在-70℃凍存)解凍，并且在MEM/10％FCS中1∶10稀釋；將K562_OX40L細(xì)胞與針對(duì)OX40L的抗體在RT下預(yù)溫育30min。K562_OX40L細(xì)胞的刺激時(shí)間在30-150min之間。按照Active Motif NE-試劑盒的供應(yīng)者用法說明，進(jìn)行從細(xì)胞核提取蛋白。Active Motif的TransAM NFκB-ELISA(檢測(cè)按照供應(yīng)者的用法說明進(jìn)行)用來確定OX40-信號(hào)傳導(dǎo)，其導(dǎo)致NFκB活化。所述檢測(cè)在Tecan MTP-讀數(shù)儀中在波長450/620nm吸收處進(jìn)行(圖3)。得到在0.6-5nM范圍內(nèi)的對(duì)于所有LC抗體的IC50值。
實(shí)施例16T-細(xì)胞活化檢測(cè)檢測(cè)原理將人外周血單核細(xì)胞(PBL)用低于最佳濃度的T-細(xì)胞促分裂原植物凝集素(PHA)激活，并且用過量表達(dá)OX40L的K562細(xì)胞共同刺激。在檢測(cè)條件下，在37℃培養(yǎng)24hr的活化的T-細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。應(yīng)用ELISA檢測(cè)，測(cè)定在上層清液中的細(xì)胞因子。為了確定Mab的阻滯作用，在與PBL共同培養(yǎng)之前，將K562 OX40L細(xì)胞用抗體的適當(dāng)稀釋液預(yù)先溫育1小時(shí)。
方法通過在Histopaque-1077(Sigma)中的密度梯度離心，將人外周血單核細(xì)胞(PBL)從肝素化的全血中分離。用Hanks洗滌后，使用Turk’s溶液計(jì)數(shù)細(xì)胞，并且將細(xì)胞以106/ml的濃度重懸在補(bǔ)充了青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺(Gibco 10378-016)以及10％FBS的RPMI 1640(Gibco)中。K562對(duì)照細(xì)胞(野生型)保持在補(bǔ)充了上述物質(zhì)的相同的RPMI培養(yǎng)基中。將轉(zhuǎn)染了OX40L的K562細(xì)胞保持在補(bǔ)充了終濃度為50mg/ml的遺傳霉素(G418，Gibco)的相同的培養(yǎng)基中。將K562細(xì)胞(WT或OX40L+)用相同的培養(yǎng)基稀釋為1.5×105個(gè)細(xì)胞/ml，并且以50μl/孔(0.75×104/孔)分裝到96孔組織培養(yǎng)平板的每個(gè)孔中。將適當(dāng)?shù)腗ab稀釋液以20μl/孔的體積添加到孔中，并且在37℃溫育1hr。每一份稀釋液在一式兩份的孔內(nèi)檢測(cè)。PBL以100μl/孔(105個(gè)細(xì)胞/孔)的體積加入。PBL比K562細(xì)胞的最終比例是～13∶1。以20μl/孔(終濃度0.75μg/ml)加入PHA(10×)(Sigma L-9132)。用RPMI/10％FCS使每個(gè)孔的總體積達(dá)到200μl。將平板在37℃ 5％CO2-濕潤的培養(yǎng)箱中溫育24 hrs。將平板離心后，收集上層清液，并且按照制造者說明書，通過ELISA(BD，San Diego，CA，CatNo2627KI)檢測(cè)IL-2(圖4)。為了計(jì)算IC50(阻滯OX40L-刺激的PBL的IL-2釋放的50％的Mab濃度)，將在對(duì)照培養(yǎng)物(PBL+PHA+K562WT)中產(chǎn)生的背景IL-2濃度從由K562×OX40L+細(xì)胞刺激的PBL產(chǎn)生的總IL-2中減去(圖5)。IC50TAG340.07μM；LC.0012nM；LC.00510nM。IC50值在2-10nM范圍。
實(shí)施例17破傷風(fēng)檢測(cè)(‘TT-檢測(cè)’)檢測(cè)抗體對(duì)由破傷風(fēng)毒素刺激的外周血淋巴細(xì)胞的抑制作用通過Ficoll Hypaque將外周血單核細(xì)胞(PBMC)從肝素化的血液中分離。在大多數(shù)情形中，將新鮮分離的PBMC用于這一檢測(cè)。在一些情形中，也使用冷藏的PBMC。用于這一檢測(cè)的培養(yǎng)基是含有10％人男性AB血清(Sigma-Aldrich)；2mM谷氨酰胺和Pen/Strep(抗生素青霉素和鏈霉素的現(xiàn)成可用的混合物(Roche Diagnostics GmbH DE)；以20ml重建的冷凍干燥物；每1000ml培養(yǎng)基用2ml)的RPMI。
為了附著到塑料上，將每孔300.000 PBMC在96孔平底平板上預(yù)培養(yǎng)過夜。
第二天，將破傷風(fēng)毒素(TT)(Chiron Behring)加入到孔中，終濃度2-5μg/ml。陽性對(duì)照孔(最大增殖/刺激)只含有TT，抗體(如純化的IgG)加入所有其它的孔中，終濃度10μg/ml。小鼠Mab TAG-34包含在檢測(cè)中(終濃度10μg/ml)。使用單獨(dú)的非刺激性背景對(duì)照培養(yǎng)基。所有的檢測(cè)進(jìn)行一式三份。
繼續(xù)培養(yǎng)(37℃，5％CO2，95％濕度)6天后，加入3H-胸苷，終濃度為1μCurie/ml，并且在額外的16h培養(yǎng)期間后，收集平板并且在β-計(jì)數(shù)器中確定結(jié)合的3H-胸苷(圖6)。
實(shí)施例18OX40L抗體與小鼠OX40L的交叉反應(yīng)性為了確定本發(fā)明的抗體與小鼠OX40L的交叉反應(yīng)能力，將連續(xù)稀釋的抗體和對(duì)照抗體與穩(wěn)定表達(dá)mOX40L的K562-mOX40L細(xì)胞一起溫育。還評(píng)估了與K562 WT細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)hOX40L的K562-hOX40L細(xì)胞的結(jié)合。針對(duì)匙孔血藍(lán)蛋白(α-KLH)的HuMab抗體用作陰性對(duì)照。包含抗體RM134L，大鼠抗-mOX40L(eBioscience，San Diego，CA)作為mOX40L表達(dá)的陽性對(duì)照。包含抗體TAG-34，小鼠抗-mOX40L(MBL，Nagoya，Japan)作為hOX40L表達(dá)的陽性對(duì)照。為了檢測(cè)結(jié)合的人抗體，使用熒光素(FITC)-綴合的山羊抗-人IgG抗體。為了檢測(cè)結(jié)合的RM134L，將生物素化的兔抗-大鼠IgG抗體(DAKO，Glostrup，Denmark)與用藻紅蛋白(PE)(DAKO)綴合的鏈霉抗生物素蛋白組合應(yīng)用。為了檢測(cè)結(jié)合的TAG-34，使用FITC-綴合的兔抗-小鼠IgG抗體。使用Graphpad Prism軟件用非線性回歸(具有可變斜率的S型劑量-反應(yīng))確定關(guān)于在20μg/ml檢測(cè)的HuMabs的EC50值或最大結(jié)合(Bmax)的計(jì)算。
結(jié)果按照本發(fā)明的LC.001能夠結(jié)合hOX40L，這由5.16±2.93μg/ml的EC50值和385.22的Bmax(MFI)值表明，但不結(jié)合mOX40L或WT細(xì)胞，這分別由11.41和9.67的Bmax(MFI)值表明。此外，按照本發(fā)明的LC.001(IgG4)也能夠有效地結(jié)合hOX40L，這由8.19±1.05μg/ml的EC50值和311.30的Bmax(MFI)值表明，但是不結(jié)合mOX40L或WT細(xì)胞，這分別由13.47和9.58的Bmax(MFI)值表明。如預(yù)計(jì)的那樣，陰性對(duì)照α-KLH不與任何細(xì)胞結(jié)合(圖7)。因此，與人OX40L相比，按照本發(fā)明的OX40L抗體表現(xiàn)出至少30倍更低的與小鼠OX40L的結(jié)合。
實(shí)施例19OX40L HuMabs激活補(bǔ)體系統(tǒng)的潛力C1q和C3c結(jié)合ELISA
為了確定本發(fā)明的抗體誘導(dǎo)C1q結(jié)合和C3活化的能力，將ELISA平板用連續(xù)稀釋的抗體和對(duì)照抗體包被。非常弱地結(jié)合C1q的人IgG4(The Binding Site，Birmingham，England)用作陰性對(duì)照。包含人IgG1(TheBinding Site)和α-KLH(IgG1)作為陽性對(duì)照。隨后，將包被的抗體與重組的C1q或作為C3來源的收集的人血清一起溫育。為了檢測(cè)結(jié)合的C1q，應(yīng)用與綴合了辣根過氧化物酶(HRP)(DAKO)的豬抗-兔IgG抗體組合的針對(duì)C1q的兔抗體(DAKO)。為了檢測(cè)活化的C3c(通過C3活化產(chǎn)生)，應(yīng)用與綴合了HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)的兔抗-小鼠IgG抗體組合的小鼠抗-人C3c抗體(DAKO)。為了評(píng)估包被效率的不同，將包被的抗體用與HRP綴合的山羊抗-人IgG抗體顯現(xiàn)。使用Graphpad Prism軟件用非線性回歸(具有可變斜率的S型劑量-反應(yīng))確定關(guān)于在10μg/ml檢測(cè)的HuMabs的EC50值或最大結(jié)合(Bmax)的計(jì)算。
結(jié)果按照本發(fā)明的LC.001能夠有效地結(jié)合C1q，這由2.19±0.42μg/ml的EC50值和3.089的Bmax(OD405)值表明。此外，陽性對(duì)照人IgG1和抗-KLH都能夠有效地結(jié)合C1q，這由分別為4.17±1.08μg/ml和2.57±1.51μg/ml的EC50值以及分別為2.685和3.306的Bmax(OD405)值表明。如預(yù)計(jì)的那樣，陰性對(duì)照人IgG4不結(jié)合C1q，這由0.353的OD405 Bmax值表明。并且，按照本發(fā)明的LC.001IgG4x失去了結(jié)合C1q的能力，這由0.357的OD405 Bmax值表明。
在排列與C1q結(jié)合的能力時(shí)，C3c通過LC.001的沉積以依賴于抗體濃度的方式發(fā)生，具有2.67±0.16μg/ml的EC50值和2.614的Bmax(OD405)值。此外，陽性對(duì)照人IgG1和抗-KLH都能有效地沉積C3c，這由分別為為5.45±0.36μg/ml和2.16±0.26μg/ml的EC50值以及分別為2.543和2.633的Bmax(OD405)值表明。如預(yù)計(jì)的那樣，陰性對(duì)照人IgG4不沉積C3c，這由0.095的OD405 Bmax值表明。并且，按照本發(fā)明的LC.001IgG4x失去了沉積C3c的能力，這由0.090的OD405 Bmax值表明(圖8和9)。
實(shí)施例20OX40L HuMabs結(jié)合Fcγ受體I、IIa和IIb的潛力IgG-誘導(dǎo)的依賴于抗體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)受到效應(yīng)細(xì)胞上的Fcγ受體(FcγR)的調(diào)控。為了確定本發(fā)明的抗體結(jié)合FcγRs的能力，將穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了人FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb的IIA1.6細(xì)胞(來源于IIA1細(xì)胞的限制性稀釋；Jones，B.，等.，J.Immunol.136(1986)348-356)和野生型細(xì)胞用連續(xù)稀釋的抗體和對(duì)照抗體溫育。不結(jié)合FcγRI的人IgG2(The BindingSite Ltd.，UK)和不結(jié)合FcγRII的人IgG4(The Binding Site)用作陰性對(duì)照。包括用于FcγRI結(jié)合的人IgG1(The Binding Site)和用于FcγRII結(jié)合的人IgG3(The Binding Site)作為陽性對(duì)照。應(yīng)用與藻紅蛋白(PE)綴合的針對(duì)人IgG的抗體，通過FACS檢測(cè)結(jié)合的抗體。使用Graphpad Prism軟件用非線性回歸曲線適配(可變斜率)確定關(guān)于在10μg/ml檢測(cè)的HuMabs的EC50值或最大結(jié)合(Bmax)的計(jì)算。
LC.001能夠有效地結(jié)合FcγRI(與對(duì)照IgG1抗體相當(dāng))，這由0.11±0.03μg/ml的EC50值和8041.54的Bmax(MFI)值表明，但是不結(jié)合FcγRIIa和FcγRIIb，這由分別為25，06和21，18的Bmax(MFI)值表明。
與LC.001相比，LC.001IgG4x較不有效地結(jié)合FcγRI，并且與對(duì)照IgG4抗體相當(dāng)，具有0.86±0.12μg/ml的EC50值和6030.07的Bmax(MFI)值。沒有觀察到LC.001 IgG4x與FcγRIIa和FcγRIIb的結(jié)合(Bmax(MFI)值分別為21.40和19.27)，而對(duì)照IgG3抗體能夠與之結(jié)合(Bmax(MFI)值分別為536.65和418.59)(圖10)。因此，與抗體LC.001的EC50值相比較，對(duì)于LC.001IgG4x結(jié)合FcγRI的EC50值是8倍。
實(shí)施例21OX40L HuMabs與NK細(xì)胞上的FcγRIIIa結(jié)合的潛力為了確定本發(fā)明的抗體與天然殺傷(NK)細(xì)胞上的FcγRIIIa(CD16)結(jié)合的能力，將外周血單核細(xì)胞(PBMCs)分離，并且，在存在或不存在20μg/ml針對(duì)FcγRIIIa的封閉小鼠抗體(抗-CD16，克隆3G8，RDI，F(xiàn)landers，NJ)時(shí)，與20μg/ml HuMab抗體和對(duì)照抗體一起溫育，以證實(shí)通過FcγRIIIa的結(jié)合。應(yīng)用不與FcγRIIIa結(jié)合的人IgG2和IgG4(The Binding Site)作為陰性對(duì)照。包含人IgG1和IgG3(The Binding Site)作為對(duì)于FcγRIIIa結(jié)合的陽性對(duì)照。應(yīng)用與FITC-標(biāo)記的山羊F(ab)2抗-人IgG(Fc)抗體(Protosimmunoresearch，Burlingame，CA)組合的PE-標(biāo)記的小鼠抗-人CD56(NK-細(xì)胞表面標(biāo)記)抗體(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)，通過FACS分析而檢測(cè)在NK細(xì)胞上結(jié)合的抗體。確定了20μg/ml檢測(cè)的HuMab的最大結(jié)合(Bmax)。
LC.001能夠有效地結(jié)合FcγRIIIa(與對(duì)照IgG1抗體相當(dāng))，這由641.37的Bmax(MFI)值表明。加入針對(duì)FcγRIIIa的封閉抗體消除了LC.001與NK細(xì)胞的結(jié)合(與145.38的背景染色相比，Bmax(MFI)值為194.61)。LC.001 IgG4x不結(jié)合FcγRIIIa，并且表現(xiàn)相當(dāng)于對(duì)照IgG4抗體，具有170.52的Bmax(MFI)值，這導(dǎo)致大約僅為LC.001 Bmax的10％的LC.001IgG4x的Bmax。加入針對(duì)FcγRIIIa的封閉抗體對(duì)LC.001 IgG4x結(jié)合沒有影響(Bmax(MFI)值174.26)(圖11)。
實(shí)施例22hMab_hOX40L和Mab TAG-34與HUVEC(初級(jí)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞/幼細(xì)胞)結(jié)合的作用描述內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)hOX40L(Kotani，A.，等.，Immunol.Lett.84(2002)1-7)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)天然表達(dá)hOX40L，并且因此可以用作“內(nèi)皮細(xì)胞模型”。這一檢測(cè)的目的是確定在與抗體TAG-34和LC.001結(jié)合后HUVEC細(xì)胞上的hOX40L的命運(yùn)。
將HUVEC解凍，并且在T175-燒瓶(Sarstedt)中在ECG-M培養(yǎng)基+2％FCS中擴(kuò)展4天。將細(xì)胞接種在24孔平板中(10.000個(gè)細(xì)胞/孔)。
3天后，將培養(yǎng)基換成ECG-M+0.5％FCS。加入10μg/ml的抗體(<KLH>(針對(duì)匙孔血藍(lán)蛋白的抗體)，TAG-34或LC.001，用于誘導(dǎo)下調(diào))，并且溫育2,5h或24h。用TAG-34或LC.001將HUVEC細(xì)胞重新染色。
用每種為10μg/ml的Alexa488標(biāo)記的針對(duì)小鼠IgG(＝<m>)或者Alexa488標(biāo)記的針對(duì)人IgG(＝<h>)的二級(jí)抗體進(jìn)行FACS-染色。FACS-測(cè)定在FACS-掃描儀(Becton Dickinson)中進(jìn)行，并且計(jì)算平均熒光密度(MFI)。
<KLH>抗體用作非特異性的陰性對(duì)照。
表7表明，加入LC.001在2,5或24h后都沒有導(dǎo)致OX40L在HUVEC細(xì)胞上表達(dá)的下調(diào)(將第4行與第5和6行比較)。然而，加入TAG 34在2,5h后和在24h后都表現(xiàn)出對(duì)在HUVEC細(xì)胞上hOX40L的強(qiáng)(約3倍)下調(diào)(將第10行與第11和12行比較)。
濃度為10μg/ml的按照本發(fā)明的抗體沒能誘導(dǎo)OX40L在HUVEC細(xì)胞上表達(dá)的下調(diào)。
表7
實(shí)施例23TAG34，LC.001和LC.005的蛋白質(zhì)印跡分析制備40和100ng hOx40L-His(R&D系統(tǒng)，具有28-34kDa的理論大小)和分子量標(biāo)記Magik Mark XP(Invitrogen；20，30，40，50，60，80，100，120，220kDa)用于凝膠-電泳。因此，將xμl蛋白質(zhì)，2.5μl NuPage LDS(十二烷基硫酸鋰鹽)樣品緩沖液(4×)，1μl NuPage還原劑(10×)，和H2O加10μl混合在一起，并且在70℃變性10min。此后，將樣品上樣到NuPage凝膠上(Novex；10％Bis-Tris)，并且在150V 1×MOPS電泳緩沖液(Novex)中電泳1h。
在半干室中，使用1×NuPage轉(zhuǎn)移緩沖液(1×緩沖液，0.1％抗氧化劑，10％甲醇)持續(xù)1h/50mA，將所述凝膠通過半干印跡(Semi-Dry-Blot)印跡到PVDF膜上(Millipore；通過在甲醇中溫育5min并且在1×轉(zhuǎn)移緩沖液中溫育10min而將膜活化)。在RT下?lián)u動(dòng)1h，將膜在1×PBS/5％牛奶/0，5％吐溫中封閉。將一級(jí)抗體(pAB)在1×PBS/1％牛奶/0.5％吐溫中稀釋，加入并且在4℃溫育過夜。
LC.0011.9μl(1.6μg)，在4ml的總體積中LC.0051.1μl(1.6μg)/4mlTAG341.6μl(1.6μg)/4ml將膜在1×PBS/0.5％吐溫中洗滌3×。將二級(jí)抗體(sAB)在1×PBS/1％牛奶/0.5％吐溫中稀釋，加入并且在RT溫育1.5h。對(duì)于LC.001和LC.005，將1∶10000稀釋的針對(duì)人IgG的多克隆抗體(Pierce)用作sAB；對(duì)于TAG34，將1∶400稀釋的來自Lumi-Light蛋白質(zhì)印跡試劑盒(Roche)的針對(duì)小鼠IgG的多克隆抗體用作sAB。將膜用1×PBS/0.5％吐溫洗滌2×持續(xù)30min。按照制造者的用法說明使用Lumi-Light蛋白質(zhì)印跡試劑盒(Roche)用于檢測(cè)。蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果在圖12中顯示。LC.001能夠檢測(cè)(十二烷基硫酸)變性的OX40L，而LC.005和TAG34不能結(jié)合變性的OX40L。
參考文獻(xiàn)列表Akiba，H.，et al.，Biochem.Biophys. Res.Commun. 251(1998)131-136Akiba，H.，et al.，J. Exp.Med.191(2000)375-380Angal，S.，et al.，Mol.Immunol.30(1993)105-108Aplin，J.D.，and Wriston，J.C.Jr.，CRC Crit.Rev.Biochem.10(1981)259-306Arestides，R.S.，et al.，Eur.J Immunol.32(2002)2874-2880Armour，K.L.，et al.. Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624Ausubel；F.，et al.，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishingand Wiley Interscience，New York(1987)Barnes，L.M.，et al.，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270Barnes，L.M.，et al.，Cytotechnology 32(2000)109-123Baum，P.R.，et al.，EMBO J.13(1994)3992-4001Blazar，B.R.，et al.，Blood 101(2003)3741-3748Boerner，P.，et al.，J.Immunol.147(1991)86-95Bruggemann，M.，et al.，Year Immunol.7(1993)33-40Brunhouse，R.，and Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917Burgess，J.K.，et al.，J. Allergy Clin.Immunol.113(2004)683-689Burton，D.R.，et al.，Nature 288(1980)338-344Burton，D.R.，Mol.Immunol.22(1985)161-206Capel，P.J.，et al.，Immunomethods 4(1994)25-34Carter，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289Chen，J.，et al.，EMBO J.12(1993)821-830Chen，J.，et al.，Int.Immunol.5(1993)647-656Choi，T.K.，et al.，Nat.Genet.4(1993)117-123Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)de Haas，M.，et al.，J. Lab.Clin.Med.126(1995)330-341Duncan，A.R.，and Winter，G.，Nature 332(1988)738-740Durocher，Y.，et al.，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9Edelman，G.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85Edge，A.S.，et al.，Anal.Biochem.118(1981)131-137.
EP 0 307 434Fishwild，D.M.，et al.，Nat. Biotechnol.14(1996)845-851Geisse，S.，et al.，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282Gessner，J.E.，et al.，Ann.Hematol.76(1998)231-248Harding，F(xiàn).，and Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci.764(1995)536-546Hezareh，M.，et al.，J.Virol.75(2001)12161-12168
Higgins，L.M.，et al.，J.Immunol.162(1999)486-493Hoogenboom，H.R.，and Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388Hoshino，A.，et al.，Eur.J.Immunol.33(2003)861-869Humphreys，I.R.，et al.，J.Exp.Med.198(2003)1237-1242Idusogie，E.E.，et al.，J.Immunol.164(2000)4178-4184Imura，A.，et al.，Blood 89(1997)2951-2958Imura，A.，et al.，J.Exp.Med.183(1996)2185-2195Ishii，N.，et al.，Eur.J.Immunol.33(2003)2372-2381Jakobovits，A.，et al.，Nature 362(1993)255-258Jakobovits，A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555Jones，B.，et al.，J.Immunol.136(1986)348-356Jones，P.，et al.，Nature 321(1986)522-525Kabat，E.A.，et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161Kjaergaard，J.，et al.，J.Immunol.167(2001)6669-6677Kotani，A.，et al.，Immunol.Lett.84(2002)1-7Lane，P.，J.Exp.Med.191(2000)201-206Lonberg，N.，and Huszar，D.，Intern.Rev.lmmunol.25(1995)65-93Lonberg，N.，et al.，Nature 368(1994)856-859Lonberg，N.，Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101Lukas，T.J.，et al.，J.Immunol.127(1981)2555-2560Lund，J.，et al.FASEB J.9(1995)115-119Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202Mallett，S.，and Barclay，A.N.，Immunol.Today 12(1991)220-223Mallett，S.，et al.，EMBO J.9(1990)1063-1068Marks，J.D.，et al.，J.Mol.Biol.222(1991)581-597Matsumura，Y.，et al.，J.Immunol.163(1999)3007-3011Meissner，P.，et al.，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203Miura，S.，et al.，Mol.Cell.Biol.11(1991)1313-1325Morgan，A.，et al.，Immunology 86(1995)319-324Morrison，S.L.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855Ndhlovu，L.C.，et al.，J.Immunol.167(2001)2991-2999Neuberger，M.S.，EMBO J.2(1983)1373-1378Neuberger，M.S.，et al.，Nature 314(1985)268-270Nohara，C.，et al.，J.Immunol.166(2001)2108-2115Norderhaug，L.，et al.，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87
Ohshima，Y.，et al.，J.Immunol.159(1997)3838-3848Orlandi，R.，et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 86(1989)3833-3837Picard，D.，and Schaffner，W.，Nature 307(1984)80-82Queen，C.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033Ravetch，J.V.，and Bolland，S.，Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290Ravetch，J.V.，and Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492Riechmann，L.，et al.，Nature 332(1988)323-327Rogers，P.R.，et al.，Immunity 15(2001)445-455Salek-Ardakani，S.，et al.，J.Exp.Med.198(2003)315-324Schlaeger，E.-J.，and Christensen，K.，Cytotechnology 30(1999)71-83Schlaeger，E.-J.，J.Immunol.Methods 194(1996)191-199Shields，R.L.，et al.，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604Sojahr，H.T.，and Bahl，O.P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57Stüber，E.，and Strober，W.，J.Exp.Med.183(1996)979-989Stüiber，E.，et al.，Gastroenterology 115(1998)1205-1215Sugamura，K.，et al.，Nat.Rev.Immunol.4(2004)420-431Takahashi，Y.，et al.，J.Virol.75(2001)6748-6757Takasawa，N.，et al.，Jpn.J.Cancer Res.92(2001)377-382Tanaka，Y.，et al，Int.J.Cancer 36(1985)549-555Taylor，L.，and Schwarz，H.，J.Immunol.Meth.255(2001)67-72Taylor，L.，et al.，Int.Immunol.6(1994)579-591Taylor，L.，et al.，Nucleic Acids Res.20(1992)6287-6295Thommesen，J.E.，et al.，Mol.Immunol.37(2000)995-1004Thotakura，N.R.，and Bahl，O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359Tozawa，H.，et al.，Int.J.Cancer 41(1988)231-238Tsukada，N.，et al.，Blood 95(2000)2434-2439Tuaillon，N.，et al.，J.Immunol.152(1994)2912-2920Tuaillon，N.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)3720-3724US 4,179,337US 4,301,144US 4,496,689US 4,640,835US 4,670,417US 4,791,192US 5,202,238US 5,204,244US 5,545,806
US 5,545,807US 5,569,825US 5,625,126US 5,633,425US 5,661,016US 5,770,429US 5,789,650US 5,814,318US 5,874,299US 5,877,397van de Winkel，J.G.，and Anderson，C.L.，J.Leukoc.Biol.49(199l)511-524van Dijk，M.A.，and van de Winkel，J.G.，Curr. Opin.Chem.Biol，5(2001)368-374Vitetta，E.S.，et al.，Science 238(1987)1098-1104Ward，E.S，and Ghetie，V.，Ther.Immunol.2(1995)77-94Weinberg，AD.，et al.，J.Immunol.162(1999)1818-1826Weinberg，A.D.，et al.，Nature Medicine 2(1996)183-189Weinberg，A.D.，et al.，Semin.Immunol.10(1998)471-480Weinberg，A.D.，Trends Immunol.23(2002)102-109Werner，R.G.，et al.，Arzneimittelforschung 48(1998)870-880WO 01/14424WO 87/05330WO 92/03918WO 92/22645WO 93/1227WO 94/11026WO 94/25585WO 95/12673WO 95/21915WO 98/24884WO 99/15200Wu，T.，et al.，Transplant.Proc.33(2001)217-218Yshioka，T.，et al.，Eur.J.Immunol.30(2000)2815-2823
序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司<120>抗-OX40L抗體<130>22672 WO<150>EP 04022158<151>2004-09-17<150>EP 04030546<151>2004-12-23<160>69<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>107<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>輕鏈，LC.005的可變區(qū)<400>3Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
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<223>重鏈，LC.005的可變區(qū)<400>4Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
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<223>重鏈，LC.010的可變區(qū)
<400>6Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>7<211>58<212>PRT<213>人工的<220>
<223>輕鏈，LC.029的可變區(qū)<400>7Met Leu His Pro Leu Cys Lys Val Gly Ser His Gln Gly Ser Val Ala1 5 10 15Val Asp Leu Gly Gln Ile Ser Leu Ser Pro Ser Ala Ala Cys Ser Leu20 25 30
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<223>重鏈，LC.029的可變區(qū)<400>8Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Sar Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>9<211>57<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>輕鏈，LC.019的可變區(qū)<400>9Met Pro Pro Val Trp Lys Val Gly Ser His Gln Gly Ser Ala Ala Val1 5 10 15Asp Leu Gly Gln Ile Ser Leu Ser Pro Ser Ala Ala Cys Ser Leu Lys20 25 30Ile Leu Gln Leu Ile Thr Val Asn Ser Leu Ile Val Thr Leu Thr Phe35 40 45Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys50 55<210>10<211>116<212>PRT<213>人工的<220>
<223>重鏈，LC.019的可變區(qū)<400>10Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Lys Asn Trp Ser Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115<2l0>11<211>106<212>PRT<213>人工的<220>
<223>輕鏈，LC.033的可變區(qū)(a)<400>11Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Arg Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Val Ser Gly50 55 60Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Asp Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Gln Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105<210>12<211>121<212>PRT<213>人工的<220>
<223>重鏈，LC.033的可變區(qū)<400>12
Gln Lys Gln Leu Val Glu Phe Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Arg Met Gly Ile Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>13<211>107<212>PRT<213>人工的<220>
<223>輕鏈，恒定區(qū)<400>13Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu1 5 10 15Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe20 25 30Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln35 40 45Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser50 55 60
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<223>重鏈，恒定區(qū)(γ1)<400>14Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125
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<220>
<223>重鏈，恒定區(qū)(γ4)<400>15Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg1 5 10 15Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr65 70 75 80Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro100 105 110Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys115 120 125Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val130 135 140Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp145 150 155 160Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe165 170 175Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp180 185 190Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr I1e Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg210 215 220Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys225 230 235 240Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp245 250 255Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys260 265 270Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser275 280 285Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser290 295 300Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser305 310 315 320Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys325<210>16<211>104<212>PRT<213>人工的<220>
<223>輕鏈，LC.033的可變區(qū)(b)<400>16Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Thr Phe85 90 95Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100<210>17<211>120<212>PRT<213>人工的<220>
<223>重鏈，LC.059的可變區(qū)<400>17Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys85 90 95Ala Lys Asp Asp Ile Pro Ala Ala Gly Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>18<211>106<212>PRT<213>人工的<220>
<223>輕鏈，LC.060的可變區(qū)<400>18Ala Ile Gln Leu Thr GlnSer Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Val Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Trp Thr85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>19<211>119<212>PRT<213>人工的<220>
<223>重鏈，LC.060的可變區(qū)<400>19Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ils Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>20<211>120<212>PRT<213>人工的<220>
<223>重鏈，LC.063的可變區(qū)<400>20Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys85 90 95Ala Lys Asp Asp Ile Pro Ala Ala Gly Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>21<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>21Ser Tyr Thr Met His1 5<210>22<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>22Ser Tyr Ala Met Ser1 5<210>23<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>23Asn Phe Gly Met His1 5
<210>24<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>24Asn Tyr Gly Met His1 5<210>25<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>25Ser Tyr Ala Met Asn1 5<210>26<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>26Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>27<2ll>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>27
Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val Lys1 5 10 15Gly<210>28<2ll>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>28Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Val Lys1 5 10 15Gly<210>29<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>29Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<2l0>30<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>30Val Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly<210>3l<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>31Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly Arg<210>32<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>32Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly Arg<210>33<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>33Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr1 5 10
<210>34<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>34Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr1 5 10<210>35<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>35Lys Asn Trp Ser Phe Asp Phe1 5<210>36<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>36Asp Arg Met Gly Ile Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val1 5 10<210>37<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>37Lys Asp Asp Ile Pro Ala Ala Gly Thr Phe Asp Pro1 5 10
<210>38<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>38Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly A1a Leu Asp Tyr1 5 10<210>39<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>39Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10<210>40<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>40Arg ALa Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>41<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>41Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala1 5 10
<210>42<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>42Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Arg Tyr Leu Ala1 5 10<210>43<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>43Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>44<211>24<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>44Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Va1 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser1 5 10 15Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala20<210>45<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>45
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5<210>46<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>46Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>47<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>47Met Pro Pro Val Trp Lys Val1 5<210>48<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>48Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5<210>49<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>49
Leu His Pro Leu Cys Lys Val1 5<210>50<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>50Asp Val Ser Ser Leu Glu Ser1 5<210>51<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>51Asn Ser Leu Ile Val Thr Leu Thr1 5<210>52<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>52Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr1 5<210>53<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>53
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Phe Thr1 5<210>54<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>54Gln Gln Arg Ser Asn Trp Gln Tyr Thr1 5<210>55<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>55Gln Gln Arg Ser Asn Trp Thr1 5<210>56<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段<400>56Asn Ser Ile Ile Val Ser Leu Thr1 5<210>57<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>CDR/抗體片段
<400>57Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Trp Thr Phe1 5<210>58<211>450<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.001的重鏈(人IgG1型)<400>58Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly225 230 235 240Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile245 250 255Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His275 280 285Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr340 345 350Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu355 360 365Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val385 390 395 400Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445Gly Lys450<210>59<211>450<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.001的重鏈(L234A，L235A人IgG1突變體)<400>59Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly225 230 235 240Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile245 250 255Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His275 280 285Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr340 345 350Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr LysAsn Gln Val Ser Leu355 360365Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp370 375 380Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val385 390 395 400Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445Gly Lys450<210>60<211>447<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.001的重鏈(S228P人IgG4突變體)<400>60Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro210 215 220Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val225 230 235 240Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr245 250 255Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser290 295 300Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile325 330 335Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser385 390 395 400Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg405 410 415Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys435 440 445<210>61<211>214<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.001的輕鏈<400>61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr85 90 95Thr Phs Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210
<210>62<211>450<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.005的重鏈(人IgG1型)<400>62Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly225 230 235 240Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile245 250 255Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His275 280 285Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr340 345 350Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu355 360 365Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp370 375 380Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445Gly Lys450<210>63<211>450<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.005的重鏈(L234A，L235A人IgG1突變體)<400>63Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly225 230 235 240Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile245 250 255Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His275 280 285Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr340 345 350Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu355 360 365Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp370 375 380Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val385 390 395 400Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445Gly Lys450<210>64<211>447<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.005的重鏈(s228P人IgG4突變體)<400>64Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe20 25 30Gly Mer His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro210 215 220Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val225 230 235 240Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr245 250 255Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser290 295 300Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile325 330 335Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser385 390 395 400Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg405 410 415Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys435 440 445<210>65<211>214<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.005的輕鏈<400>65
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Als Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Phe85 90 95Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ash Phe Tyr Pro Arg Glu A1a130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210
<210>66<211>449<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.060的重鏈(人IgG1型)<400>66Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Als Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe115 120 125Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu130 135 140Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp145 150 155 160Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser180 185 190Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro195 200 205Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys210 215 220Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro225 230 235 240Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser245 250 255Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp260 265 270Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn275 280 285Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val290 295 300Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu305 310 315 320Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys325 330 335Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro G11n Val Tyr Thr340 345 350Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr55 360 365Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu370 375 380Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys405 410 415Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu420 425 430Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 440 445Lys<210>67<211>449<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.060的重鏈(L234A，L235A人IgG1突變體)<400>67Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe115 120 125Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu130 135 140Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp145 150 155 160Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu165 170 175Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser180 185 190Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro195 200 205Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys210 215 220Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro225 230 235 240Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser245 250 255Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp260 265 270Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn275 280 285Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val290 295 300Val Ser Val Leu Thr Val Leu His G1n Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu305 310 315 320Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr340 345 350Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr355 360 365Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu370 375 380Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu385 390 395 400Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys405 410 415Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu420 425 430Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 440 445Lys<210>68<211>446<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.060的重鏈(S228P人IgG4突變體)<400>68Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe115 120 125Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu130 135 140Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp145 150 155 160Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu165 170 175Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser180 185 190Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro195 200 205Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro210 215 220Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe225 230 235 240Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro245 250 255Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr275 280 285Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val290 295 300Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys305 310 315 320Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser325 330 335Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro340 345 350Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val355 360 365Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly370 375 380Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp385 390 395 400Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp405 410 415Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His420 425 430Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys435 440 445<210>69<211>213<212>PRT<213>人工的<220>
<223>LC.060的輕鏈<400>69
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Val Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Trp Thr85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Ash Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210
PCT/RO/134表的中文譯文涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis)
C.附加指示(附頁)申請(qǐng)人霍夫曼-拉羅奇有限公司，等申請(qǐng)人文件參考號(hào)22672 WO-SR國際申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2005/009968關(guān)于說明書引用的保藏生物材料的專家解決方案相關(guān)的指示涉及保藏的生物材料的指示全部包含在說明書中。下列另外的指示不要求是說明書的一部分，并且應(yīng)當(dāng)作為“分開的指示”對(duì)待。它們僅涉及專家解決方案。以下作出的另外的指示涉及在說明書第24頁(注中文第21頁)中稱為hu Mab<hOX40L>LC.001 DSMACC2672hu Mab<hOX40L>LC.005 DSMACC2685hu Mab<hOX40L>LC.010 DSMACC2686hu Mab<hOX40L>LC.019 DSMACC2688hu Mab<hOX40L>LC.033 DSMACC2689的保藏的生物材料。
另外的指示是對(duì)于CA(加拿大)指定對(duì)于加拿大的指定，按照加拿大專利法案專利細(xì)則第107和108條規(guī)定，只有通過將樣品簽發(fā)給局長提名的獨(dú)立專家(細(xì)則10(4))，直到授予加拿大專利，或直到申請(qǐng)被駁回或被放棄且不再要求恢復(fù)、或被撤回的日期，才可以提供保藏的生物材料的樣品。
對(duì)于EP(歐專局)指定關(guān)于EPO的指定，按照EPC實(shí)施細(xì)則的細(xì)則28(3)的規(guī)定，只有通過將樣品簽發(fā)給請(qǐng)求人提名的專家(細(xì)則28(4)EPC)，直到歐洲專利授權(quán)通知公開，或者如果申請(qǐng)被駁回或撤回或視撤，直至從申請(qǐng)日起20年，才可以提供保藏的生物材料的樣品。
對(duì)于SG(新加坡)指定申請(qǐng)人由此提請(qǐng)注意，我們意欲根據(jù)1995年專利法則目錄四的第3段，上述培養(yǎng)物僅可提供給專家。
權(quán)利要求
1.一種抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，含有來源于人源的Fc片段并且不結(jié)合補(bǔ)體因子Clq。
2.按照權(quán)利要求1的抗體，其特征在于所述抗體不結(jié)合NK細(xì)胞上的人Fcγ受體。
3.按照權(quán)利要求1或2的抗體，其特征在于所述抗體是人抗體。
4.按照權(quán)利要求1或2的抗體，其特征在于所述抗體是嵌合的或人源化的抗體。
5.按照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體以小于10-8M的KD值與OX40L結(jié)合。
6.按照權(quán)利要求5的抗體，其中所述KD在10-12-10-9M范圍。
7.按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述抗體是人亞類IgG1的抗體，包含一個(gè)或多個(gè)來自PVA236、GLPSS331和/或L234A/L235A(按照EU索引進(jìn)行編號(hào))的突變。
8.按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述抗體是人亞類IgG4的抗體。
9.按照權(quán)利要求8的抗體，其特征在于含有突變S228P。
10.按照權(quán)利要求8或9的抗體，其特征在于含有突變L235E。
11.按照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述抗體不激活補(bǔ)體因子C3。
12.按照權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于其不引發(fā)依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)。
13.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于其不引發(fā)依賴于抗體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。
14.按照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于它在ELISA檢測(cè)中表現(xiàn)出抑制，在0.5μg/ml OX40L的包被濃度，通過阻滯固定的OX40L和可溶的OX40之間的相互作用而進(jìn)行抑制，具有1nM-4nM范圍的IC50值。
15.一種抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，并且所述抗體包括獨(dú)立地選自由下列組合組成的組的可變區(qū)組合a)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO2定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；b)由氨基酸序列SEQ ID NO3定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO4定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；c)由氨基酸序列SEQ ID NO5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO6定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；d)由氨基酸序列SEQ ID NO7定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；e)由氨基酸序列SEQ ID NO9定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO10定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；f)由氨基酸序列SEQ ID NO11或16定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ ID NO12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；g)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈(VL)可變結(jié)構(gòu)域和由SEQID NO17定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域；h)由氨基酸序列SEQ ID NO18定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO19定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；i)由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
16.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述人輕鏈可變區(qū)包括獨(dú)立地選自由SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，16和18組成的組的氨基酸序列。
17.按照權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述人重鏈可變區(qū)包括獨(dú)立地選自由SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，17，19和20組成的組的氨基酸序列。
18.按照權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述抗體包括由氨基酸序列SEQ ID NO1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和由SEQ ID NO2，17或20定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
19.按照權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述抗體在Fc片段中包括至少1個(gè)使得不與補(bǔ)體因子Clq結(jié)合的氨基酸突變。
20.按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述抗體包括由SEQID NO13定義的κ輕鏈恒定區(qū)或者SEQ ID NO61，65或69的輕鏈恒定區(qū)。
21.按照權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述抗體包括由SEQID NO14或SEQ ID NO15定義的重鏈恒定區(qū)或者SEQ ID NO58的重鏈恒定區(qū)。
22.一種結(jié)合OX40L、包括可變輕鏈和可變重鏈的抗體，其特征在于所述可變重鏈包括選自SEQ ID NOs33-38的CDR3和/或所述可變輕鏈包括選自SEQ ID NOs51-57的CDR3。
23.按照權(quán)利要求22的抗體，其特征在于所述可變重鏈包括選自SEQ IDNOs21-25的CDR1和選自SEQ ID NOs26-32的CDR2，和/或所述可變輕鏈包括選自SEQ ID NOs39-44的CDR1和選自SEQ ID NOs45-50的CDR2。
24.一種抗體，其特征在于它由選自由下列細(xì)胞系組成的組的細(xì)胞系產(chǎn)生hu-Mab<hOX40L>LC.001，hu-Mab<hOX40L>LC.005，hu-Mab<hOX40L>LC.010，hu-Mab<hOX40L>LC.019，hu-Mab<hOX40L>LC.029和hu-Mab<hOX40L>LC.033。
25.按照權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于所述抗體是Fab、F(ab’)2或單鏈片段。
26.用于產(chǎn)生按照權(quán)利要求1-25的抗體的方法，其特征在于，編碼以小于10-8M的KD值結(jié)合OX40L的抗體的重鏈的第一核酸序列以這樣的方式進(jìn)行修飾，以致所述修飾的抗體不結(jié)合NK細(xì)胞上的補(bǔ)體因子Clq和/或人Fcγ受體，將所述修飾的第一核酸和編碼所述抗體輕鏈的第二核酸插入到表達(dá)載體中，將所述載體插入到原核或真核宿主細(xì)胞中，將所述宿主細(xì)胞在允許合成所述抗體的條件下培養(yǎng)，并且從所述培養(yǎng)物回收所述抗體。
27.按照權(quán)利要求26的用于產(chǎn)生抗體的方法，其特征在于編碼所述抗體重鏈的所述第一核酸的序列編碼按照權(quán)利要求22的抗體的重鏈。
28.一種編碼權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的抗體分子的核酸分子。
29.一種包括權(quán)利要求28的核酸分子的載體。
30.一種包括權(quán)利要求29的載體的宿主細(xì)胞。
31.一種用于制備權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的抗體分子的方法，其包括將權(quán)利要求30的宿主細(xì)胞在允許所述抗體分子合成的條件下培養(yǎng)，并且從所述培養(yǎng)物回收所述抗體分子。
32.一種組合物，其包括權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的抗體分子或者通過權(quán)利要求26或27的方法產(chǎn)生的抗體分子。
33.權(quán)利要求32的組合物，其是一種藥物組合物或診斷組合物。
34.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的抗體和至少一種藥用賦形劑。
35.用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于給所述患者施用治療有效量的按照權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的抗體。
36.權(quán)利要求1-23中定義的抗體用于治療的應(yīng)用。
37.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)定義的抗體用于預(yù)防和治療炎癥疾病的應(yīng)用。
38.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)定義的抗體用于制備預(yù)防和治療炎癥疾病的藥物的應(yīng)用。
39.試劑盒，其包括權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的抗體分子，權(quán)利要求28的核酸分子，權(quán)利要求29的載體或權(quán)利要求30的宿主細(xì)胞。
40.修飾選自由SEQ ID NOs21-38組成的組的親本抗體重鏈CDR和/或選自由SEQ ID NOs39-57組成的組的親本抗體輕鏈CDR的初始氨基酸序列的方法，其特征在于，提供編碼所述初始氨基酸序列的核酸，修飾所述核酸，其中，重鏈CDR1中1個(gè)氨基酸被修飾，重鏈CDR2中1-2個(gè)氨基酸被修飾，重鏈CDR3中1-2個(gè)氨基酸被修飾，輕鏈CDR1中1-3個(gè)氨基酸被修飾，輕鏈CDR2中1-3個(gè)氨基酸被修飾，和/或輕鏈CDR3中1-3個(gè)氨基酸被修飾，在抗體結(jié)構(gòu)中表達(dá)所述修飾的CDR氨基酸序列，測(cè)定所述抗體是否以小于10-8M的KD結(jié)合OX40L，并且如果所述抗體以小于10-8M的KD結(jié)合OX40L，選擇所述修飾的CDR。
41.一種抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，是人IgG1種類并且包括γ重鏈SEQ ID NO58，62或66。
42.按照權(quán)利要求41的抗體，其包括a)γ重鏈SEQ ID NO58和κ輕鏈SEQ ID NO61，b)γ重鏈SEQ ID NO62和κ輕鏈SEQ ID NO65或c)γ重鏈SEQ ID NO66和κ輕鏈SEQ ID NO69。
43.一種抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，是包含突變L234A/L235A的IgG1種類，并且包括γ重鏈SEQ ID NO59，63或67。
44.按照權(quán)利要求43的抗體，其包括a)γ重鏈SEQ ID NO59和κ輕鏈SEQ ID NO61，b)γ重鏈SEQ ID NO63和κ輕鏈SEQ ID NO65或c)γ重鏈SEQ ID NO67和κ輕鏈SEQ ID NO69。
45.一種抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合OX40L，是含有突變S228P的IgG4種類，包括γ重鏈SEQ ID NO60，64或68。
46.按照權(quán)利要求45的抗體，其包括a)γ重鏈SEQ ID NO60和κ輕鏈SEQ ID NO61，b)γ重鏈SEQ ID NO64和κ輕鏈SEQ ID NO65或c)γ重鏈SEQ ID NO68和κ輕鏈SEQ ID NO69。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗－OX40L抗體，并且特別地涉及抗－OX40L抗體及其變體，其含有衍生于人源的Fc片段并且不結(jié)合補(bǔ)體因子C1q。這些抗體具有給受炎癥疾病折磨的患者帶來益處的新穎性和創(chuàng)造性特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K16/46GK101023102SQ200580031358
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2005年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者約瑟夫·恩德爾, 埃爾西·歐吉, 瑪麗亞·芬特斯, 伊沃·格勞斯, 阿蘭·拉布里吉恩, 馬丁·蘭岑德費(fèi)爾, 保羅·帕倫, 弗蘭克·雷貝阿斯, 拉爾夫·舒馬赫, 澤貝爾·斯特凡, 揚(yáng)·范德溫克爾, 馬丁·弗里斯瑪-范武格特 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司