專利名稱：調(diào)節(jié)植物葉片壽命的蛋白質(zhì)，其基因和它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)植物葉片壽命的蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的基因，及它們的用途。更具體地，本發(fā)明涉及能調(diào)節(jié)植物葉片壽命的新型蛋白質(zhì)ORE15、編碼該蛋白質(zhì)的新型基因ORE15，及其出于各種目的的使用。
背景技術(shù)：
植物的衰老是發(fā)生在植物胚后的最后階段的一系列的生物化學(xué)的和生理學(xué)的現(xiàn)象，其限制個(gè)體植物的壽命。植物衰老的啟動(dòng)是一個(gè)拐點(diǎn)，在該點(diǎn)上細(xì)胞內(nèi)發(fā)生顯著的變化，正在衰老的植株在合成能力上下降且細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大分子物質(zhì)降解以至于喪失細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Matile P.等人，Elservier，413-440，1992；Nooden L.D.等人，Academicpress，1988；Thiman K.V.等人，CRC press，85-115，1980；Thomas H.等人，Annu.Rev.Plant Physiol.123193-219，1993)。植物的衰老不是植物器官簡(jiǎn)單的被動(dòng)降解過程，而是作為在細(xì)胞、組織和器官中進(jìn)行的高度精確和主動(dòng)的過程由基因程序化控制。
除了生物學(xué)的重要性，因?yàn)槠渑c農(nóng)作物產(chǎn)量的增加和收獲后的耐儲(chǔ)存性有關(guān)，植物的衰老具有工業(yè)上的重要性。相應(yīng)地，在植物衰老上已積極地進(jìn)行了基因的、分子生物學(xué)的，生理學(xué)的，以及生物化學(xué)的研究。然而，大部分的報(bào)告是從對(duì)植物激素的研究中獲得，而衰老的調(diào)節(jié)，如衰老調(diào)節(jié)基因的使用，還未被充分研究。
通過反基因方法，迄今為止在鼠耳水芹(mouse-ear cress)、番茄、玉米、水稻、煙草和馬鈴薯植物中已找到在葉片衰老期間表達(dá)增加的約100個(gè)基因(Buchanan-Wallaston，J.Exp.Bot.48181-199，1997；Quirini等人，Trends Plant Sci.5278-282，2000)。然而，僅僅少量的衰老相關(guān)基因的功能已被研究，而大多數(shù)的性質(zhì)仍然未知。近來，延遲衰老的突變體已被分離出且被研究以嘗試找到負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)葉片衰老的基因(Woo H.R.等人，Plant Cell 131779-1790，2001；Woo H.R.簡(jiǎn)等人，Plant J.(待出版))。然而，實(shí)驗(yàn)上的困難阻止了從衰老促進(jìn)(senescence-promoting)的突變體中分離出衰老調(diào)節(jié)基因。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種調(diào)節(jié)葉片壽命的蛋白質(zhì)，被命名為ORE15。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼所述蛋白質(zhì)ORE15的調(diào)節(jié)植物葉片壽命的基因，被命名為ORE15。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種攜帶ORE15基因的重組載體。
本發(fā)明的又進(jìn)一步的目的是提供一種調(diào)節(jié)植物壽命的方法。
本發(fā)明的再進(jìn)一步的目的是提供一種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種增加植物生物量的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種表現(xiàn)出延長(zhǎng)的壽命的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種表現(xiàn)出生長(zhǎng)促進(jìn)的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的更為進(jìn)一步的目的是提供一種篩選植物衰老調(diào)節(jié)基因的方法。
本發(fā)明的另外的目的是提供一種篩選植物壽命調(diào)節(jié)相關(guān)的材料的方法。
技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，一種包括SEQ ID NO2的氨基酸序列，被命名為ORE15的蛋白質(zhì)，被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)植物葉片壽命的功能。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種編碼所述葉片壽命調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)ORE15，被命名為ORE15的基因。
在本發(fā)明中，采用擬南芥(Arabidopsis thaliana)來篩選與植物壽命相關(guān)的基因，其中擬南芥(Arabidopsis thaliana)是一種用于基因和分子生物學(xué)研究的模式植物。以前，本發(fā)明人鑒定了一種衰老相關(guān)的基因，被命名為ORE9(Woo H.R.等人，Plant Cell 131779-1790，2001)。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)了位于ORE9下游的負(fù)責(zé)衰老的因子突變體和新的衰老延遲突變體。在這點(diǎn)上，新的激活標(biāo)記方法被應(yīng)用于ore9-1，一衰老延遲變異體，以篩選衰老延遲性的表現(xiàn)更甚于ore9-1的突變體。結(jié)果，一新的基因被發(fā)現(xiàn)與衰老相關(guān)且被命名為“ORE15”。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“壽命調(diào)節(jié)”和“衰老調(diào)節(jié)”相互間意義相同且可被互換地使用而沒有本質(zhì)上的區(qū)別。例如，植株中生命延長(zhǎng)與衰老延遲是基本相同的。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的基因或蛋白質(zhì)可被具體地稱為“生命延長(zhǎng)”或“衰老延遲”的基因或蛋白質(zhì)。
此外，必須注意的是，術(shù)語(yǔ)“葉片壽命”，正如在此處應(yīng)用與本發(fā)明基因或蛋白質(zhì)相關(guān)，其適合于更確切地表達(dá)本發(fā)明的目的，并不能解釋為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。盡管被表達(dá)為葉片壽命調(diào)節(jié)基因或蛋白質(zhì)，本發(fā)明的基因或蛋白質(zhì)可涉及對(duì)植物的其他器官的壽命的調(diào)節(jié)，如根、種子、莖、花，以及更進(jìn)一步的，涉及對(duì)植物本身的壽命的調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的植物葉片壽命調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)ORE15為(i)，具有與SEQID NO2序列100％一致的氨基酸序列多肽?？紤]到本領(lǐng)域的技術(shù)，(ii)，含SEQ ID NO2的氨基酸序列的實(shí)質(zhì)部分的多肽，以及(iii)，與(i)或(ii)的基本相似的多肽都被充分地認(rèn)為落入植物葉片壽命調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)ORE15的范圍內(nèi)。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“含SEQ ID NO2的氨基酸序列的實(shí)質(zhì)部分的多肽”是指含SEQ ID NO2的一部分氨基酸序列的多肽，相比于由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成的多肽，其仍然具有葉片壽命延長(zhǎng)(即，衰老延遲)的功能，并且保留鋅指基序。因?yàn)樵诒景l(fā)明中衰老延遲功能和鋅指結(jié)構(gòu)域足以使用，所述多肽的長(zhǎng)度和活性不是重要的(“不可能(out of thequestion)”是指“拒絕許可(permission denied)”)。即使與含SEQ ID NO2的氨基酸的多肽相比活性較低，任何具有延長(zhǎng)葉片壽命功能的多肽可被包括在“含SEQ ID NO2的氨基酸的實(shí)質(zhì)部分的多肽”的范圍內(nèi)，而與長(zhǎng)度無關(guān)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，即理解與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)的那些人認(rèn)為即使含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽被部分地刪除，將仍然具有使壽命延長(zhǎng)的功能。同樣的，還有含SEQ ID NO2的氨基酸序列，其N-或C-末端被刪除的多肽。通常地，本領(lǐng)域中可接受的是即使其N-或C-末端部分被刪除，突變的多肽保持所述完整多肽的功能。此外，即使除了N-或C-末端部分的其他部分被刪除，突變的多肽可仍然保持完整的ORE15蛋白質(zhì)的功能。
相應(yīng)地，在本發(fā)明中必須理解的是含SEQ ID NO2的氨基酸序列的實(shí)質(zhì)部分的多肽是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在本發(fā)明公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上制備的同時(shí)保持葉片壽命延長(zhǎng)功能和鋅指結(jié)構(gòu)域的任何刪除的突變體。
短語(yǔ)“與(i)或(ii)的基本相似的多肽”是指具有至少一個(gè)被取代的氨基酸殘基但仍保持SEQ ID NO2的氨基酸序列的生理和結(jié)構(gòu)功能，即葉片壽命延長(zhǎng)和鋅指結(jié)構(gòu)域的突變體。如果其中至少一個(gè)氨基酸殘基被取代的突變體仍然表現(xiàn)出葉片壽命延長(zhǎng)功能，以及保留一鋅指結(jié)構(gòu)域，其活性或取代百分比是不重要的。相應(yīng)地，無論突變的多肽與含完整的SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽相比，在活性上如何低，或者無論突變的多肽與含完整的SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽相比，被如何大量取代，如果其表現(xiàn)出葉片壽命延長(zhǎng)功能并具有鋅指結(jié)構(gòu)域，所述突變的多肽被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
即使至少一個(gè)氨基酸殘基取代了所述完整的多肽的相應(yīng)的殘基，如果所述取代的氨基酸殘基與相應(yīng)的殘基在化學(xué)上等效，突變的多肽仍然保留所述完整的多肽的功能。例如，當(dāng)丙氨酸，一疏水性氨基酸，被取代為類似的疏水性氨基酸如甘氨酸，或更加疏水性的氨基酸，如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸，含有這些取代氨基酸殘基的多肽仍然保留所述完整的多肽的功能，即使活性更低。同樣地，由帶負(fù)電的氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸之間的取代造成的含取代的氨基酸殘基的多肽仍然保留所述完整多肽的功能，即使其具有更低的活性。此外，帶正電的氨基酸之間的取代的突變多肽也是這樣。例如，含取代精氨酸的賴氨酸的取代突變多肽仍然表現(xiàn)出所述完整多肽的功能，即使其活性更低。此外，在其N-或C-末端部分含取代氨基酸的多肽仍然保留所述完整的多肽的功能。
本領(lǐng)域的通用技術(shù)使得可以制備保留鋅指結(jié)構(gòu)域且表現(xiàn)出與完整的多肽相同的功能的取代突變多肽。
如前所述，“與(i)或(ii)的基本相似的多肽”被理解為包括盡管其中存在至少一個(gè)取代氨基酸，其與所述完整的多肽一樣表現(xiàn)出壽命延長(zhǎng)功能，以及保留鋅指區(qū)域的任何多肽。然而，從活性的角度出發(fā)，具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列更高同源性的多肽更為優(yōu)選。表現(xiàn)出與野生型多肽60％或更高同源性的多肽是有益的，100％同源為最佳的選擇。
更詳細(xì)的，以上升的優(yōu)選順序，更優(yōu)選的為60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％以及99％。
根據(jù)本發(fā)明，植物葉片壽命調(diào)節(jié)基因ORE15包括不僅僅編碼SEQ IDNO2的ORE15蛋白質(zhì)的多聚核苷酸序列，而且包括編碼其變異體的多聚核苷酸序列。具體地，不但編碼SEQ ID NO2的ORE15蛋白質(zhì)的多聚核苷酸序列，而且編碼表現(xiàn)出葉片壽命延長(zhǎng)活性且具有鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的任何多聚核苷酸序列都將落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。更加優(yōu)選地，本發(fā)明的ORE15基因包括列于SEQ ID NO1的堿基序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了攜帶有所述ORE15基因的重組載體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的載體包含(a)編碼負(fù)責(zé)植物壽命延長(zhǎng)的蛋白質(zhì)ORE15的核苷酸序列，以及(b)可操作地與所述核苷酸序列連接的啟動(dòng)子。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“可操作地與......連接”是指調(diào)節(jié)序列(也就是，啟動(dòng)子、信號(hào)序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的排列)被功能性地與其他核苷酸序列連接，由此調(diào)節(jié)這個(gè)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
根據(jù)本發(fā)明的載體系統(tǒng)可通過本領(lǐng)域中公知的各種方法構(gòu)建，所述方法被詳細(xì)地記載于Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)，其公開的內(nèi)容通過在此處引用而成為說明書的一部分。
因?yàn)槠鋸闹参镏蟹蛛x且功能為延長(zhǎng)植物的壽命，本發(fā)明的基因更加適用于植物。相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種植物表達(dá)載體，包括(i)編碼所述植物壽命延長(zhǎng)蛋白質(zhì)ORE15的核苷酸序列；(ii)可操作地與(i)的核苷酸序列連接的啟動(dòng)子，其使得在植物細(xì)胞中形成相應(yīng)的RNA分子；以及(iii)3′端非翻譯區(qū)，其引起在植物細(xì)胞中的RNA分子的3′端的多聚腺苷酸化。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在本發(fā)明中有益的啟動(dòng)子可為在用于向植物中導(dǎo)入基因的技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的任何啟動(dòng)子。例如，在本發(fā)明中可使用從玉米中獲得的泛素啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、胭脂堿合成酶(nos)啟動(dòng)子、玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子、甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子、鴨跖草黃化斑駁病毒啟動(dòng)子、核酮糖-1，5-雙-磷酸羧化酶的小亞基(ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子、水稻細(xì)胞質(zhì)的磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)啟動(dòng)子、擬南芥(Arabidopsis thaliana)的腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(adenine phosphoribosyltransferase，APRT)啟動(dòng)子，以及章魚堿合成酶啟動(dòng)子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，引起在本發(fā)明中有益的多聚腺苷酸化作用的3′端非翻譯區(qū)可以包括來自根瘤土壤桿菌(Acrobacterium tumefaciens)的胭脂堿合成酶基因(nos 3′端)的衍生物(Bevan等人，Nucleic AcidsResearch，11(2)369-385(1983))、來自根瘤土壤桿菌(Acrobacteriumtumefaciens)的章魚堿合成酶基因的衍生物、番茄或馬鈴薯的蛋白酶抑制劑I或II的3′端，或者CaMV 35S的終止子。
可選擇地，所述載體還可攜帶編碼報(bào)導(dǎo)分子(熒光素酶或β-葡萄糖苷酸酶)的基因。此外，本發(fā)明所述的載體可包含，如篩選標(biāo)記、抗生素(例如，新霉素、羧芐青霉素、卡那霉素、奇霉素、勻霉素等等)抗性基因(例如，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)、勻霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)，等等)。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種用于調(diào)節(jié)植物壽命的方法，包括將所述ORE15基因?qū)胫仓曛小?br> 根據(jù)更進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種將ORE15基因?qū)肫渲械?，表現(xiàn)出延長(zhǎng)的壽命的轉(zhuǎn)基因植物。
根據(jù)再進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法，包括將ORE15基因?qū)胫参镏小?br> 根據(jù)又一個(gè)的實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種帶有被導(dǎo)入其中的ORE15基因的，表現(xiàn)出生長(zhǎng)促進(jìn)的轉(zhuǎn)基因植物。
根據(jù)再一個(gè)的實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種增加植物產(chǎn)量的方法，包括將ORE15基因?qū)胫参镏小?br> 轉(zhuǎn)化了相關(guān)基因的植物表現(xiàn)出壽命的延長(zhǎng)性或在生長(zhǎng)/產(chǎn)量上的增加。攜帶了ORE15基因的轉(zhuǎn)化體可通過各種表示壽命延長(zhǎng)的指標(biāo)(例如，葉綠素含量的延遲減少、光合能力的延遲喪失、衰老相關(guān)基因的表達(dá))或表示生長(zhǎng)增加(例如，葉片重量和大小增量的增加)的指標(biāo)進(jìn)行鑒定。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“植物”應(yīng)當(dāng)理解為不僅包括成熟的植物，還包括將長(zhǎng)成成熟植物的植物細(xì)胞、組織以及種子。
在本發(fā)明中有用的植物的例子包括糧食作物如水稻、小麥、大麥、玉米、豆類、馬鈴薯、紅豆、燕麥、粟米等等，蔬菜作物如擬南芥、甘藍(lán)、瓜類、南瓜、綠蔥、洋蔥、胡蘿卜等等，經(jīng)濟(jì)作物，如人參、煙草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫蘇、花生、油菜等等，果樹如蘋果樹、梨樹、棗樹、獼猴桃樹、葡萄樹、柑橘樹、柿樹、李樹、杏樹、香蕉樹等等，花卉如玫瑰、劍蘭、非洲菊、康乃馨、百合、郁金香等等，以及飼料作物如黑麥草、紅三葉草、果樹草、苜蓿、高牛毛草、多年生黑麥草等等。
應(yīng)到注意到的是術(shù)語(yǔ)“增加植物的產(chǎn)量”或“產(chǎn)量增加”是指在植物生物量上的增加，包括植物器官的重量和/或大小的增加，如葉片、莖等等。
將外源的多聚核苷酸，即ORE15基因，導(dǎo)入植物中可通過本領(lǐng)域公知的方法達(dá)到(Methods of Enzymology，Vol.153，1987，Wu和GrossmanED，Academic Press；其中公開的內(nèi)容通過引用成為說明書的一部分)。植物可由載體例如質(zhì)?；虿《巨D(zhuǎn)化，采用介導(dǎo)體，如土壤桿菌(Agrobacterium sp.)，(Chilton等人，1977，Cell 11263271；其中所公開的內(nèi)容通過引用成為本說明書的一部分)，在所述載體上錨定外源多聚核苷酸，或者通過直接地將所述外源多聚核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞中(Lorz等人，1985，Mol Genet.199178-182；其中所公開的內(nèi)容通過此處引用而成為說明書的一部分)，。例如，電穿孔、微粒轟擊法，或聚乙烯乙二醇介導(dǎo)的吸收可被用于導(dǎo)入不含T-DNA區(qū)域的載體。
廣泛使用的是一種植物轉(zhuǎn)化方法，其中攜帶外源多聚核苷酸的根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)被轉(zhuǎn)染至植物細(xì)胞或種子內(nèi)(見美國(guó)專利5,004,863，5,349,124和5,416,011)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能將所述轉(zhuǎn)染后的植物細(xì)胞或種子培養(yǎng)和種植為成熟的生物個(gè)體。
轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生優(yōu)選地通過將負(fù)責(zé)衰老延遲的所述ORE15基因插入至含調(diào)節(jié)序列的表達(dá)載體中以構(gòu)建重組表達(dá)載體，且將所述重組載體導(dǎo)入至開花植物中而完成。
更加優(yōu)選地，通過將負(fù)責(zé)衰老延遲的所述ORE15基因插入至含有調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)載體中以構(gòu)建重組表達(dá)載體、以所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化土壤桿菌(Agrobacterium sp.)，以及將轉(zhuǎn)化后的土壤桿菌(Agrobacterium sp.)轉(zhuǎn)染至植物中，而產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物。更加具體地，所述被轉(zhuǎn)化的土壤桿菌(Agrobacterium sp.)為被轉(zhuǎn)化的根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)核苷酸序列”應(yīng)當(dāng)理解為包括對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)有影響的所有序列。所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的例子包括引導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等等，優(yōu)選地為啟動(dòng)子。
轉(zhuǎn)基因植物的篩選可通過將轉(zhuǎn)染后的生物曝露至篩選試劑(例如，代謝抑制劑、抗生素以及除草劑)中而完成。攜帶了篩選標(biāo)記基因的被轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞可在這些篩選試劑的存在下生長(zhǎng)和分裂?？蓱?yīng)用至本發(fā)明的篩選標(biāo)記的例子包括勻霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、磷酸糖酯(glycophosphate)抗性基因，以及新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)系統(tǒng)，但不限于此。
源自植物的原生質(zhì)或各種外植體的發(fā)育和再分化在本領(lǐng)域中是公知。轉(zhuǎn)染了攜帶外源基因的土壤桿菌(Agrobacterium sp.)的植物細(xì)胞可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法被培育或再分化(見美國(guó)專利5,004,863，5,349,124以及5,416,011).
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種篩選植物衰老調(diào)節(jié)基因的方法，包括(a)在植物細(xì)胞中表達(dá)或激活所述ORE15基因；以及(b)檢測(cè)在植物細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生變化的基因。
本發(fā)明的ORE15基因被發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中對(duì)衰老相關(guān)基因的表達(dá)具有影響(見實(shí)施例4)。也就是說，相比于野生型植株，所述ORE15基因被激活或過量表達(dá)的突變植物允許衰老誘導(dǎo)基因更加活躍地表達(dá)。
基于這個(gè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在植物細(xì)胞中表達(dá)或激活所述ORE15基因時(shí)，可通過檢測(cè)在表達(dá)譜中表現(xiàn)出變化的基因來篩選衰老調(diào)節(jié)基因。
改變其表達(dá)譜的基因的檢測(cè)在本領(lǐng)域中是公知的。例如，在表達(dá)譜上發(fā)生變化的基因可通過在隨機(jī)引物的存在下放大轉(zhuǎn)錄而被篩選(見美國(guó)專利5,599,672)。在這種情況下，比較ORE15基因被激活的突變體植物和ORE15基因未被激活的對(duì)照植株之間的RT-PCR的產(chǎn)物。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種篩選植物壽命調(diào)節(jié)相關(guān)的材料的方法，包括(a)用有關(guān)材料處理植物；以及(b)分析所述ORE15基因在植物中的表達(dá)。
經(jīng)材料處理后，所述ORE15基因在表達(dá)上的增加表示所述材料被認(rèn)為能夠延長(zhǎng)植物的壽命(衰老延遲)。
所述ORE15基因的表達(dá)可以用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)定量地和定性地分析。通常，所述分析可在基因和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行。對(duì)于基因水平的分析，基于本發(fā)明所確定的，所述ORE15基因的堿基序列合成的引物可用于PCR或在雜交中作為探針(對(duì)于這點(diǎn)，DNA芯片是方便的)?？蛇x地，RNA印跡雜交技術(shù)(Northern blotting)(見Peter B.Kaufma等人，Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine，102-108，CRCpress)有益于基因水平的分析。對(duì)于蛋白質(zhì)水平的分析，采用抗所述ORE15基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體(見Enzyme Immunoassay，E.T.Maggio，ed.，CRC Press，Boca Raton，佛羅里達(dá)，1980；以及Gaastra，W.，Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，in Methods in MolecularBiology，Vol.1，Walker，J.M.ed.，Humana Press，NJ，1984)，通過免疫分析(例如，放射免疫分析、放射免疫沉淀分析、酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)、斑點(diǎn)雜交分析(dot blot assays)、蛋白質(zhì)印跡免疫分析(WesternBlot assays)、抑制或競(jìng)爭(zhēng)的分析以及夾心分析(sandwich assays))被定量或定性地完成。
有益效果如上所述，所述ore15-D突變體的延遲衰老的表型歸因于所述ORE15基因的激活。也就是說，所述ORE15基因的激活可造成植物衰老的延遲。相應(yīng)地，通過以負(fù)責(zé)葉片壽命的所述ORE15基因轉(zhuǎn)化植物可調(diào)節(jié)植物的壽命。此外，所述ORE15基因和其ORE15蛋白質(zhì)可有益于對(duì)衰老機(jī)理的研究以及對(duì)衰老相關(guān)基因和衰老調(diào)節(jié)材料的研究。


圖1至3分別表示擬南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-O)和壽命延長(zhǎng)突變體ore15-D之間隨時(shí)間的衰老比較(a)、葉綠素含量上的變化(b)，以及光合活性上的變化(c)。
□Col■ore15-DFv最大可變熒光Fm最大熒光量圖4至7表示暗處理后擬南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-O)和壽命延長(zhǎng)突變體ore15-D之間隨時(shí)間衰老的比較(a)、葉綠素含量上的變化(b)、光合活性上的變化(c)，以及通過Northern blotting分析的衰老相關(guān)基因的表達(dá)譜(d)。
SEN1衰老相關(guān)基因1SEN4衰老相關(guān)基因4
圖8以示意圖的形式表示將激活標(biāo)記載體pSKI015插入至衰老突變體ore15-D的基因組中，以及對(duì)野生型(Col-O)和表達(dá)了ORE15基因的ore15-D突變體的Northern blotting分析結(jié)果。
E增強(qiáng)子BAR除草劑抗性基因pBSE.coli復(fù)制起始區(qū)和氨芐青霉素抗性基因坐落的位點(diǎn)圖9是推知的所述ORE15蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
圖10和11表示野生型(Col-D)和所述ore15-D突變體在新鮮葉片重量和葉片面積上的變化。
圖12是表示來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-D)、ore15-D突變體和敲除的突變體(ore12-2KO)之間葉片大小區(qū)別的照片。
圖13是表示擬南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-D)、過量表達(dá)突變體ore15-D和敲除的突變體(ore12-2KO)的葉片的縱切面的解剖學(xué)照片(條形尺寸相應(yīng)于100μm)。
圖14是一張總結(jié)了擬南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-D)、過量表達(dá)突變體ore15-D和敲除的突變體(ore12-2KO)的柵欄薄壁組織的第一層中長(zhǎng)度方向和寬度方向上細(xì)胞數(shù)量的平均值的表格。
具體實(shí)施例方式
通過下面的實(shí)施例可獲得對(duì)本發(fā)明更好的理解，所述實(shí)施例用以說明，而并非構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中篩選延遲衰老的突變體首先，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中誘導(dǎo)突變。為此，使用電穿孔方法，將含有位于T-DNA的右邊附近的4個(gè)CaMV35S增強(qiáng)子，以及賦予Basta除草劑抗性的bar基因(草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)的激活標(biāo)記載體pSKI015(Weigel等人，Plant Physiology 1221003-1014，2000)(由美國(guó)Weigel實(shí)驗(yàn)室提供)導(dǎo)入根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefacience)ABI菌株(由美國(guó)Amasino實(shí)驗(yàn)室提供)中，隨后在含有卡那霉素和羧芐青霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。此后，使用floral dip方法(Clough等人，Plant J.，16(6)735-743，1998)，帶有pSKI015載體的根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefacience)菌株被轉(zhuǎn)染至擬南芥(Arabidopsis thaliana)延遲衰老突變體ore9-1中(Woo H.R.等人，Plantcell 131779-1790，2001)。被轉(zhuǎn)染的擬南芥(Arabidopsis thaliana)的種子在Basta除草劑的存在下被選擇。在保持23℃的溫室中，栽種10,000株T1系的植株，用肉眼觀察由于衰老而導(dǎo)致的葉綠素流失的黃化。選擇較ore9-1葉黃化更弱的突變系，并命名為ore15-D。圖1示出在擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞野生型(Col-O)和突變體Ore15-D中隨時(shí)間的葉片衰老圖。從圖1中可明顯看出，相比于野生型，本發(fā)明的突變體ore15-D表現(xiàn)了更佳的延遲衰老性能。
實(shí)施例2衰老延遲突變體ore15-D的表達(dá)的檢測(cè)為了檢測(cè)ore15-D突變體的衰老延遲特性，比較了突變體ore15-D和野生型(Col-D)的葉片葉綠素含量和光合作用活性。
2-1)葉綠素含量的測(cè)定各樣品的葉片在80℃、95％的乙醇中煮沸以萃取葉綠素。葉綠素含量通過在648nm和664nm的光吸收進(jìn)行測(cè)定，并且表示為相對(duì)于葉片材料的鮮重的百分比(Vermon等人，Anal.Chem.321142-1150，1960)。
在野生型(Col-O)中，測(cè)得的葉綠素含量在28DAE(出苗后天數(shù))時(shí)為50％，如圖2所示，其在24DAE時(shí)開始褪色。相反，ore15-D的葉綠素含量在28DAE時(shí)保持100％且甚至直到36DAE為約25％。
2-2)光合作用的活性使用Oh的方法(Oh S.A.等，Plant Mol.Biol.30939，1996)來測(cè)定光合作用活性。一開始，各DAE的葉片在暗處放置15min并使用植物光合作用效率分析儀(plant efficiency analyzer)(Hansatech Instruments，Morfolk，英國(guó))測(cè)量葉綠素的熒光。利用葉綠素的熒光，光合作用活性被表示為由最大可變熒光(Fv)與最大熒光值(Fm)的比率(Fv/Fm)給出的PSII(光系統(tǒng)II)的光化學(xué)效率。該值越高，光合作用效率就越佳。
光合作用活性也表現(xiàn)出類似于葉綠素含量的變化模式。當(dāng)在野生型(Col-O)中24DAE之后光合作用活性開始顯著下降時(shí)，ore15-D在28DAE之后表現(xiàn)緩慢的光合作用衰退(見圖3)。
綜合來看，上面獲得的數(shù)據(jù)意味著由于ORE15的突變，相比于野生型，ore15-D突變類型表現(xiàn)出延遲衰老的表型，以及意味著由于在葉綠素含量和光合作用活性上延遲的生物衰退導(dǎo)致了衰老延遲。
實(shí)施例3根據(jù)暗處理的ore15-D突變體的葉片壽命的變化根據(jù)暗處理，一種衰老加速因素，以在光合作用活性和葉綠素含量方面的變化來測(cè)定ore15-D突變體的葉片壽命。
使來自野生型(Col-O)和ore15-D突變體的各24葉片(12DAE)漂浮在3mM 2-[N-嗎啉基]-乙磺酸(pH5.8)(在下文被稱作′MES緩沖液′)上。當(dāng)被放置于22℃完全黑暗的箱體中時(shí)，所述葉片每隔一天被單獨(dú)地分析光合作用活性和葉綠素含量，如實(shí)施例2中那樣。圖4是暗處理之后擬南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型(Col-O)和ore15-D突變體的葉片中隨時(shí)間顯示衰退進(jìn)程的照片。如在照片中所示，本發(fā)明的野突變體ore15-D相比于野生型在衰老上極大的延遲。此外，暗處理5天后，如圖5和6所示，與暗處理之前的測(cè)定相比，在突變體ore15-D中，葉綠素含量和光合作用活性分別地被測(cè)量為多達(dá)99.5％和99％，然而在野生型(Col-O)中，分別被大為降低至75％和74％。
實(shí)施例4在ORE15突變體中衰老相關(guān)基因的表達(dá)為檢測(cè)ORE15對(duì)衰老相關(guān)的基因(SAGs)的影響，采用Northernblots，對(duì)在暗處理期間隨時(shí)間的各SAG表達(dá)譜進(jìn)行分析。樣品為在第0，2，4和6DAT分離的總RNA。將10μg制備好的總RNA裝載在各泳道上，且SEN1(GenBank，登記號(hào)NM 119743)和SEN4(GenBank，登記號(hào)NM 119173)基因被用作探針。
在圖7中給出了Northern blotting的結(jié)果。如圖7中所示，隨著衰老的進(jìn)行，在第8DAT，Col-O確實(shí)增加了衰老相關(guān)的基因SEN1和SEN4的表達(dá)。然而，在相同的時(shí)間內(nèi)，直至第12DAT，在ore15-D突變體中SAGs的表達(dá)才增加。這個(gè)現(xiàn)象表示ORE15突變體在分子水平以及在生理水平影響葉片的壽命。
實(shí)施例5ORE15基因的克隆和堿基測(cè)序?yàn)榱嗽趏re15-D突變體中搜尋在T-DNA附近，由增強(qiáng)子激活的基因，質(zhì)粒拯救方法(Weigel等人，Plant Physiology 1221003-1014，2000)被用于基因的分離。在圖8中，顯示了帶有激活標(biāo)記載體pSKI015插入其中的部分ore15-D突變體的基因組的示意圖。從ore15-D突變體中分離出染色體的DNA(Dellaporta等人，Plant Mol.Biol.Rep.119-21，1983)。隨后，5μg的染色體DNA以EcoRI消化，在乙醇中沉淀，并被干燥。該DNA消化物被自連接并被導(dǎo)入至E.coli DH5α，隨后E.coli DH5α在氨芐青霉素存在下進(jìn)行培養(yǎng)以選擇轉(zhuǎn)化體。
對(duì)轉(zhuǎn)化了含E.coli復(fù)制區(qū)域、選擇標(biāo)記，二者都存在于T-DNA中，以及T-DNA的右邊緣附近的7.0kb的植物染色體DNA片段的質(zhì)粒的E.coli進(jìn)行培養(yǎng)以在選擇平板上形成菌落。在從所述菌落中制備質(zhì)粒之后，測(cè)定T-DNA右邊緣附近的堿基序列。在這點(diǎn)上，基于用于質(zhì)粒拯救方法的EcoRI位點(diǎn)下游的堿基序列合成一寡聚鏈，并用于堿基測(cè)序。參考擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，基于所確定的堿基序列發(fā)現(xiàn)最接近增強(qiáng)子的開放閱讀框。由ORE15基因表達(dá)的蛋白質(zhì)由243個(gè)氨基酸構(gòu)成，如SEQ ID NO2和圖9中所示。
使用ORE15基因作為探針，進(jìn)行Northern blotting分析。使用TRI-試劑(Sigma)從野生型(Col-O)和突變體ore15-D中分離出總RNA。將10μg總RNA裝載于1.2％瓊脂糖/甲醛凝膠上的各泳道內(nèi)，分離并轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。用2X SSC沖洗尼龍膜5min以除去瓊脂糖殘余之后，使用UV光(254nm，0.18J/Sq.cm2)，使該RNA固定至所述尼龍膜。根據(jù)Park’s方法(Park等人，Plant Mol.Biol.261725-1735，1994)使被轉(zhuǎn)移至尼龍膜之上的印記接受預(yù)雜交和雜交。
結(jié)果顯示在圖8中。盡管在野生型(Col-O)中觀察到ORE15基因沒有表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在ore15-D突變體中基因被過量表達(dá)。
實(shí)施例6將ORE15基因?qū)胫烈吧?Col-O)為檢測(cè)ore15-D突變體的延遲衰老表型是否是由于激活ORE15基因的結(jié)果，將含ORE15基因的2.5kb的DNA片段導(dǎo)入至野生型(Col-D)內(nèi)以誘導(dǎo)過量表達(dá)。為該目的，采用RT-PCR分離ORE15的全長(zhǎng)cDNA。其中含ORE15基因的DNA片段被插入至pGEM-T Easy載體內(nèi)(PromegaCorporation Madison，WI.美國(guó))，且該重組體被稱為pORE15/GTE。以BglII和BstEII對(duì)pORE15/GTE進(jìn)行雙酶切以切除隨后被插入至pCAMBIA3301內(nèi)(Caberra，澳大利亞)的ORE15基因片段。所形成的重組載體，被稱為pORE15/3301，Agrobacterium tumefacienceAGL1菌株被轉(zhuǎn)化。根據(jù)floral dip方法(Clough等人，Plant J.，16(6)735-743，1998)，被轉(zhuǎn)化的Agrobacterium tumefacienceAGL1菌株，稱為pAT-ORE15，被轉(zhuǎn)染至野生型(Col-O)。轉(zhuǎn)基因的擬南芥(Arabidopsis thaliana)的延遲衰老表型證明了ORE15基因負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)擬南芥(Arabidopsis thaliana)的葉片壽命。
實(shí)施例7ore15-D突變體在生長(zhǎng)中的葉片重量和大小的變化根據(jù)生長(zhǎng)的時(shí)間檢測(cè)出本發(fā)明的特點(diǎn)是，伴隨葉片壽命的延長(zhǎng)，ore15-D突變體的葉片重量和大小較之野生型也有較大的增加。
在從葉片的DAE(出苗后天數(shù))開始的4-天間隔下，測(cè)量來自野生型(Col-O)和ore15-D突變體的葉片的重量和大小。關(guān)于葉片大小，使用軟件Scion image(NIH，美國(guó))，根據(jù)葉片的掃描數(shù)據(jù)而測(cè)定。結(jié)果在圖10中給出。野生型(Col-O)和ore15-D突變體之間葉片重量的不同從8DAE開始顯著，且在之后增大。此外，如圖11所示，從8DAE開始，在葉片的大小上ore15-D突變體也超過野生型(Col-O)。
在12DAE時(shí)，在野生型(Col-O)、過量表達(dá)的突變體ore15-D，以及敲除的突變體ore15-2KO之中證實(shí)了這些表型的不同。觀察到ore15-D在葉片大小上與野生型相比有較大地增加(圖12)，且這種大小的增加在包括葉片在內(nèi)的ore15-D的幾乎所有器官中被發(fā)現(xiàn)。為檢測(cè)何種因素誘導(dǎo)了在器官大小上的變化，對(duì)葉片的縱向切面進(jìn)行解剖學(xué)觀察(圖13)，且對(duì)第三葉叢葉片(the third rosette leaf)進(jìn)行解剖學(xué)分析(圖14)。在柵欄薄壁組織內(nèi)，ore15-D突變體具有稍微較小的細(xì)胞尺寸，但具有比野生型更多的細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)，敲除的突變體ore15-2KO表現(xiàn)出的表型與過量表達(dá)的突變體ore15-D的正好相反。相應(yīng)地，在ore15-D葉片器官中的表型特征可歸因于柵欄薄壁組織的細(xì)胞數(shù)量而不是細(xì)胞尺寸的增加，意味著ore15-D通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量在延遲植物衰老中起重要的作用。
盡管需要另外的實(shí)施例以檢查是否這種現(xiàn)象是衰老調(diào)控的直接影響或間接影響的因素，在葉片大小和重量上的增長(zhǎng)可應(yīng)用于各種農(nóng)作物，造成產(chǎn)量的極大增加。
序列表<110>基諾麥因有限公司(GENOMINE INC.)波斯泰克基金會(huì)(POSTECH FOUNDATION)<120>調(diào)節(jié)植物葉片壽命的蛋白質(zhì)，其基因和它們的用途<150>KR/10-2004-0069454<151>2004-09-01<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>732<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atggttagag aaggtgaaga agaagaagag atgatgatga tgatggcaac gaaacctgca 60tggcttgaag gtttaatggc ggagactttc ttctcaagct gtggaatcca cgaaactcgc120cgtaaaagtg aaaagaacgt tttttgctta ctctgttgtc tcagtgtttg tcctcactgt180ctcccttctc atcgctctca tcctcttctt caggtgagac gatacgtata ccacgacgtc240gttcggttga gtgatcttga gaagctcata gattgttcat atgttcagcc atatacaatt300aatggagcca aagtgatatt cttaaaccaa agacaacaat cacgagctaa ggtttcttca360aatgtttgct tcacttgtga tagaatcctt caagaaccat tccacttttg ttccctctct420tgcaaggtgg attatttatc atatcaagga gatgatttat caagcattct ctatagaatt480gatgaatcag attttacgtt cgagggtttg agaatggacg gacatgatca gctcggagag540atatcgacga tggaggatgg ggaggatata ctggtaattt cagatgaatc tgagcaaggt600aacaatagtc ataagaaaga gaagaagaag agcaagaaga agaagccaga gagcaattac660ttgcctggga tggttctttc atcacttggt aatagaagaa aaggtgctcc tcatagggct720cctttttcat aa732
<210>2<211>243<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2Met Val Arg Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Met Met Met Met Met Ala1 5 10 15Thr Lys Pro Ala Trp Leu Glu Gly Leu Met Ala Glu Thr Phe Phe Ser20 25 30Ser Cys Gly Ile His Glu Thr Arg Arg Lys Ser Glu Lys Asn Val Phe35 40 45Cys Leu Leu Cys Cys Leu Ser Val Cys Pro His Cys Leu Pro Ser His50 55 60Arg Ser His Pro Leu Leu Gln Val Arg Arg Tyr Val Tyr His Asp Val65 70 75 80Val Arg Leu Ser Asp Leu Glu Lys Leu Ile Asp Cys Ser Tyr Val Gln85 90 95Pro Tyr Thr Ile Asn Gly Ala Lys Val Ile Phe Leu Asn Gln Arg Gln100 105 110Gln Ser Arg Ala Lys Val Ser Ser Asn Val Cys Phe Thr Cys Asp Arg115 120 125Ile Leu Gln Glu Pro Phe His Phe Cys Ser Leu Ser Cys Lys Val Asp130 135 140Tyr Leu Ser Tyr Gln Gly Asp Asp Leu Ser Ser Ile Leu Tyr Arg Ile145 150 155 160Asp Glu Ser Asp Phe Thr Phe Glu Gly Leu Arg Met Asp Gly His Asp165 170 175Gln Leu Gly Glu Ile Ser Thr Met Glu Asp Gly Glu Asp Ile Leu Val180 185 190Ile Ser Asp Glu Ser Glu Gln Gly Asn Asn Ser His Lys Lys Glu Lys195 200 205
Lys Lys Ser Lys Lys Lys Lys Pro Glu Ser Asn Tyr Leu Pro Gly Met210 215 220Val Leu Ser Ser Leu Gly Asn Arg Arg Lys Gly Ala Pro His Arg Ala225 230 235 240Pro Phe Ser
權(quán)利要求
1.一種葉片壽命調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，被命名為ORE15，其具有選自下列(a)，(b)和(c)的多肽(a)包括在SEQ ID NO2中公開的氨基酸序列的全部長(zhǎng)度的多肽；(b)包括在SEQ ID NO2中公開的氨基酸序列的實(shí)質(zhì)部分的多肽；以及(c)與(a)或(b)的所述多肽類似的多肽。
2.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)ORE15的植物葉片壽命調(diào)節(jié)基因，被命名為ORE15。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物葉片壽命調(diào)節(jié)基因ORE15，其特征在于，其具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
4.一種攜帶根據(jù)權(quán)利要求2所述的ORE15基因的重組載體。
5.一種調(diào)節(jié)植物壽命的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因?qū)胫林参镏小?br> 6.一種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因?qū)胫林参镏小?br> 7.一種增加植物產(chǎn)量的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因?qū)胫林参镏小?br> 8.一種轉(zhuǎn)基因植物，表現(xiàn)出延長(zhǎng)的壽命，具有被導(dǎo)入其中的根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因。
9.一種轉(zhuǎn)基因植物，表現(xiàn)出生長(zhǎng)促進(jìn)性，具有被導(dǎo)入其中的根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因。
10.一種用于篩選植物衰老調(diào)節(jié)基因的方法，包括(a)在植物細(xì)胞中表達(dá)或激活根據(jù)權(quán)利要求2所述的ORE15基因；以及(b)對(duì)在植物細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生變化的基因進(jìn)行檢測(cè)。
11.一種用于篩選植物壽命調(diào)節(jié)相關(guān)材料的方法，包括(a)將植物用相關(guān)的材料處理；以及(b)對(duì)植物中的根據(jù)權(quán)利要求2所述的ORE15基因的表達(dá)進(jìn)行分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)植物葉片壽命的新型蛋白質(zhì)，ORE15。此外，還公開了一種編碼所述蛋白質(zhì)ORE15的基因。所述蛋白質(zhì)和基因可用于調(diào)節(jié)植物葉片壽命，包括延遲的衰老、生長(zhǎng)促進(jìn)、葉片重量和尺寸的增加。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101023096SQ200580031205
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2005年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月1日
發(fā)明者南洪吉, 金鎮(zhèn)赫, 禹慧蓮 申請(qǐng)人:基諾麥因有限公司, 波斯泰克基金會(huì)