專利名稱：雙齒肽結(jié)合物的制作方法
雙齒肽結(jié)合物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙齒肽結(jié)合物(Bipodal peptide binder)及其制造方法。背景技術(shù)：
抗體是作為B細(xì)胞所產(chǎn)生的一種血漿蛋白質(zhì)的免疫球蛋白，其特異性地識別從外部引進(jìn)的抗原的特定區(qū)而結(jié)合，從而對抗原進(jìn)行鈍化或中和。通過應(yīng)用這種抗原-抗體反應(yīng)的特異性和高度的親和力及能夠區(qū)別數(shù)千萬種類的抗原的抗體的多樣性，當(dāng)今出現(xiàn)了包含診斷劑和治療劑等的多種抗體產(chǎn)品。目前FDA認(rèn)證了 21種單克隆抗體，如利妥昔單抗 (Rituximab)及赫賽汀(Here印tin)的抗體在其他治療中完全未起到效應(yīng)的50%以上的患者身上產(chǎn)生了效果，實(shí)際上在許多研究過程中利用單克隆抗體在淋巴瘤、大腸癌或乳腺癌等方面呈現(xiàn)成功的臨床治療。預(yù)計(jì)治療用抗體的整體市場規(guī)模將從2004年100億美元增加到2010年的300億美元呈現(xiàn)年均20%的成長率，并預(yù)計(jì)其市場規(guī)模將會急劇增加。踴躍開展利用抗體的新藥開發(fā)的理由在于藥品的開發(fā)期間短，投資費(fèi)用少，能夠容易預(yù)測到副作用。并且，抗體作為生藥幾乎不給人體帶來影響，并且抗體在體內(nèi)的半衰期相當(dāng)長，其期間相比低分子量藥品具有壓倒性的優(yōu)勢，因而對患者無害。單克隆抗體盡管具有這種有用性，但是在人體內(nèi)被識別為外源性抗原而會引起嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)或超敏反應(yīng)。并且，臨床上使用這種抗癌功能的單克隆抗體時(shí)，由于生產(chǎn)成本高，因而具有作為治療劑的價(jià)格急劇上漲的缺點(diǎn)，并且由于培養(yǎng)抗體的方法及純化方法等廣泛領(lǐng)域的技術(shù)受到各種知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，要支付昂貴的專利權(quán)使用費(fèi)。因此，為了解決此問題，以美國為中心，歐洲聯(lián)盟處于抗體替代蛋白質(zhì)開發(fā)的萌發(fā)期?？贵w替代蛋白質(zhì)作為如抗體一樣具有不變區(qū)和可變區(qū)的重組蛋白質(zhì)，將大小較小而穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的規(guī)定部分替換成隨機(jī)序列的氨基酸而構(gòu)成文庫(library)，將其針對靶物質(zhì)進(jìn)行淘選而能夠找出具有較高的親和力和優(yōu)良的特異性的物質(zhì)。例如報(bào)告了抗體替代蛋白質(zhì)中的高親合性多聚體(avimer)和親和體(affibody)對于靶物質(zhì)具有皮摩爾(picomole) 程度的親和力的例子。報(bào)告稱這種抗體替代蛋白質(zhì)由于大小較小而穩(wěn)定，能夠滲透到癌細(xì)胞深處，一般很少引起免疫反應(yīng)。并且，尤其是能夠擺脫廣泛的抗體專利問題，并且在細(xì)菌中能夠容易地進(jìn)行大量純化，使得生產(chǎn)成本降低，因此經(jīng)濟(jì)上相比抗體具有更大的優(yōu)點(diǎn)。目前開發(fā)出的抗體替代蛋白質(zhì)有40種，其中，在風(fēng)險(xiǎn)投資公司或跨國制藥公司正試圖商用化的抗體替代蛋白質(zhì)正在利用纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域、脂籠蛋白、LDLR-A結(jié)構(gòu)域、結(jié)晶體、蛋白A、錨蛋白重復(fù)序列(Ankyrin repeat)以及BPTI這些蛋白質(zhì)，對于靶具有皮摩爾到數(shù)納摩爾程度的親和力。其中，艾得奈可汀(Adnectin)、高親合性多聚體、庫尼茨(Kimitz) 結(jié)構(gòu)域目前正處于FDA臨床實(shí)驗(yàn)階段。本發(fā)明聚焦于與迄今的利用蛋白質(zhì)的抗體替代蛋白質(zhì)不同的基于肽的抗體替代蛋白質(zhì)。肽相比抗體能夠?qū)崿F(xiàn)適當(dāng)?shù)乃幬飫恿W(xué)、大量生產(chǎn)率、低毒性、抗原性抑制以及低生產(chǎn)成本等，因而目前替代抗體治療劑以多種形態(tài)應(yīng)用。作為治療用藥物的肽的優(yōu)點(diǎn)在于 生產(chǎn)成本低，安全性及反應(yīng)性高，專利稅相對低廉，不太露出在不期望的免疫系統(tǒng)，能夠抑制對于肽自身的抗體產(chǎn)生，容易而準(zhǔn)確地進(jìn)行通過合成的變形。但是，由于大部分的肽相比抗體，對于特定蛋白質(zhì)靶呈現(xiàn)低的親和力及特異性，因而具有無法使用于多種應(yīng)用領(lǐng)域的缺點(diǎn)。因此，本領(lǐng)域中便開始涌現(xiàn)出關(guān)于能夠克服肽的缺點(diǎn)的基于新穎肽的抗體替代蛋白質(zhì)開發(fā)的需求。為此，本發(fā)明人們致力于開發(fā)出能夠以高的親和性與生物學(xué)靶分子特異性地結(jié)合的肽物質(zhì)。預(yù)計(jì)這將成為能夠利用對于目前許多的靶進(jìn)行了報(bào)告的具有低親和力的肽來短時(shí)間內(nèi)制造具有高親和性及特異性的新藥候補(bǔ)物質(zhì)的技術(shù)。本說明書遍及其所有內(nèi)容參照并引用了多個(gè)論文及專利文獻(xiàn)。所引用的論文及專利文獻(xiàn)的所有揭示內(nèi)容作為參照內(nèi)容編入本說明書中，由此更加明確地說明本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人致力于開發(fā)出能夠以十分高的親和性(affinity)與生物學(xué)靶分子特異性地結(jié)合的肽物質(zhì)。其結(jié)果表明，如果在具有比較堅(jiān)固(rigid)肽骨架的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩個(gè)末端隨機(jī)(random)地結(jié)合肽，并將所述兩個(gè)肽共同結(jié)合至靶分子，則能夠獲得具有大大增大的結(jié)合能力及特異性的雙齒肽結(jié)合物，由此完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種雙齒肽結(jié)合物(bipodal-peptide binder)的制造方法。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種與生物學(xué)靶分子結(jié)合的雙齒肽結(jié)合物。本發(fā)明的又一目的在于，提供一種對雙齒肽結(jié)合物進(jìn)行編碼的核酸分子。本發(fā)明的再一目的在于，提供一種雙齒肽結(jié)合物的表達(dá)用載體。本發(fā)明的還一目的在于，提供一種包含雙齒肽結(jié)合物的表達(dá)用載體的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點(diǎn)，將通過本發(fā)明的詳細(xì)說明、權(quán)利要求書及附圖更為明確。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種與生物學(xué)靶分子結(jié)合的雙齒肽結(jié)合物 (bipodal-peptide binder)的制造方法，該方法包含如下步驟(a)提供雙齒肽結(jié)合物的文庫的步驟，上述雙齒肽結(jié)合物包含(i)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū) (structure stabilizing region)，其包含形成有鏈間(interstrand)非共價(jià)鍵的平行線 (parallel)、反平行線(antiparallel)或平行(parallel)和反平行(antiparallel)氨基酸鏈，以及(ii)靴結(jié)合區(qū) I (target binding region I)及靴結(jié)合區(qū) II (target binding regionll)，與上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩個(gè)末端結(jié)合，并包含隨機(jī)選擇的各η及m個(gè)氨基酸；(b)使上述文庫和靶接觸的步驟；以及(c)選擇與上述靶結(jié)合的雙齒肽結(jié)合物。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種特異性地與靶結(jié)合的雙齒肽結(jié)合物，該雙齒肽結(jié)合物包含(a)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)(structure stabilizing region)，其包含形成有鏈間(interstrand)非共價(jià)鍵的平行線(parallel)、反平行線(antiparallel)或平行(parallel)和反平行(antiparallel)氨基酸鏈；以及(b)靶結(jié)合區(qū)I (target binding region I)及靶結(jié)合區(qū)II (target binding region II)，其與上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩個(gè)末端結(jié)合，并包含隨機(jī)選擇的各η及m個(gè)氨基酸。
本發(fā)明人等致力于開發(fā)出能夠以十分高的親和性(affinity)與生物學(xué)靶分子特異性地結(jié)合的肽物質(zhì)。其結(jié)果表明，如果在具有比較堅(jiān)固(rigid)肽骨架的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩個(gè)末端隨機(jī)(random)地結(jié)合肽，并將所述兩個(gè)肽共同結(jié)合至靶分子，則能夠獲得具有大大增大的結(jié)合能力及特異性的雙齒肽結(jié)合物。本發(fā)明的基本策略在于，在堅(jiān)固的肽骨架的兩個(gè)末端連接與靶結(jié)合的肽。此時(shí)，堅(jiān)固的肽骨架起著對雙齒肽結(jié)合物的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行穩(wěn)定化的作用，并加強(qiáng)靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)II與靶分子結(jié)合。本發(fā)明中能利用的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)包含平行線、反平行線或平行和反平行氨基酸鍵，并包含將形成基于鏈間(interstrand)氫鍵、基于靜電相互作用、疏水性相互作用、范德瓦爾斯相互作用、η-η相互作用、陽離子-η相互作用或它們的組合的非共價(jià)鍵的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基序。將基于鏈間氫鍵、靜電相互作用、疏水性相互作用、范德瓦爾斯相互作用、
相互作用、陽離子-η相互作用或它們的組合形成的非共價(jià)鍵有助于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的堅(jiān)固性(rigidity)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)上的鏈間(interstrand)非共價(jià)鍵包含氫鍵、疏水性相互作用、范德瓦爾斯相互作用、η-η相互作用或它們的組合。選擇性地，在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)可能有共價(jià)鍵。例如在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)形成二硫鍵，由此能夠更加增強(qiáng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的堅(jiān)固性。鑒于對雙齒肽結(jié)合物的靶的特異性及親和力，增強(qiáng)基于這種共價(jià)鍵的堅(jiān)固性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的各氨基酸鏈通過連接物連接。在本說明書中談及鏈時(shí)所用的術(shù)語“連接物”是指用于連接物與鏈之間的物質(zhì)。例如將發(fā)夾用作結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)時(shí)，位于發(fā)夾的換向序列起著連接物的作用，將亮氨酸拉鏈用作結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)時(shí)，用于連接亮氨酸拉鏈的兩個(gè)C-末端的物質(zhì)(例如肽連接物)起著連接物的作用。連接物用于連接平行線、反平行線或平行和反平行氨基酸鏈。例如該連接物連接以平行方式排序的最小2個(gè)鏈(優(yōu)選為2個(gè)鏈)、以反平行方式排序的最小2個(gè)鏈(優(yōu)選為 2個(gè)鏈)、以平行及反平行方式排序的最小3個(gè)鏈(優(yōu)選為3個(gè)鏈)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，連接物是換向序列或肽連接物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上述換向序列是β-換向、Y-換向、α-換向、Ji-換向或 ω-環(huán)形(ω-loop) (Venkatachalam CM(1968)，Biopolymers，6，1425-1436 ；Nemethy G and Printz MP. (1972), Macromolecules,5,755-758 ；Lewis PN et al. , (1973), Biochim.Biophys. Acta,303,211-229 ；Toniolo C. (1980)CRC Crit. Rev. Biochem. ,9, 1-44 ；Richardson JS. (1981),Adv. Protein Chem.，34，167—339 ；Rose GD et al.，(1985)， Adv. Protein Chem.，37，1-109 ；Milner-ffhite EJ and Poet R. (1987)，TIBS，12，189-192 ; Wilmot CMand Thornton JM. (1988), J.Mol.Biol. ,203,221-232 ；MiIner-ffhiteEJ. (1990)，J. Mol.Biol.，216，385-397 ；Pavone V et al. (1996)，Biopolymers,38,705-721 ； Rajashankar KR and Ramakumar S. (1996), Protein Sci.，5，932-946)。最優(yōu)選地，本發(fā)明中所利用的換向序列為β-換向。將β-換向用作換向序列時(shí)，優(yōu)選為I型、Γ型、II型、ΙΓ型、III型或ΙΙΓ型換向序列，更優(yōu)選為I型、Γ型、II型、ΙΓ型換向序列，進(jìn)而優(yōu)選為Γ型或II'型換向序列，最優(yōu)選為 Γ 型換向序列(B. L. Sibanda et al. , J. Mol. Biol. , 1989, 206,4, 759-777 ； B. L.Sibanda et al.，Methods Enzymol.，1991，202，59-82)。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例，能夠在本發(fā)明中用作換向序列的已在H. Jane Dyson et al.，Eur. J. Biochem. 255 :462-471 (1998)中公開，上述文獻(xiàn)作為參照內(nèi)容編入本說明書中。能夠用作換向序列的包含以下氨基酸序列=X-Pro-Gly-Glu-Val ； Ala-X-Gly-Glu-Val (X 選自 20 個(gè)氨基酸)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，將折疊或亮氨酸拉鏈用作結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)時(shí)，優(yōu)選地通過肽連接物來連接以平行方式排序的2個(gè)鏈或以反平行方向排序的2個(gè)鏈。肽連接物只要是在本領(lǐng)域中公開的能夠利用任何一個(gè)。適合的肽連接物的序列能夠鑒于如下的因素而選擇(a)能夠適用于柔性延伸構(gòu)象(flexible extended conformation)的能力；(b)不生成與生物學(xué)靶分子相互作用的二級結(jié)構(gòu)的能力；以及(c) 與生物學(xué)靶分子相互作用的疏水性殘基或帶有電荷的殘基的部件。優(yōu)選的肽連接物包含 Gly、Asn及Ser殘基。諸如Thr及Ala的其他中性氨基酸也能包含于連接物序列。適合于連接物的氨基酸序列已在 Maratea et al.，Gene40 :39-46(1985) ；Murphy et al.，Proc. Natl. Acad Sci. USA83 :8258-8562 (1986)；美國專利第 4，935，233 號、第 4，751，180 號及第 5，990，275號中公開。肽連接物序列能夠由1-50氨基酸殘基構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)是發(fā)夾、通過連接物連接的折疊或通過連接物連接的亮氨酸拉鏈，更優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)是β-發(fā)夾或通過連接物連接的β-折疊，最優(yōu)選為β-發(fā)夾。本說明書中，術(shù)語“β_發(fā)夾”是指包含兩個(gè)β鏈的最簡單的蛋白質(zhì)基序，這兩個(gè) β鏈呈現(xiàn)相互反平行的排序。該β-發(fā)夾中的兩個(gè)β鏈一般通過換向序列相連接。優(yōu)選地，適用于β-發(fā)夾的換向序列是I型、Γ型、II型、ΙΓ型、III型或ΙΙΓ 型換向序列，更優(yōu)選為I型、Γ型、II型、ΙΓ型換向序列，進(jìn)而優(yōu)選為Γ型或II'型換向序列，最優(yōu)選為I'型換向序列。并且，由X-Pro-Gly-Glu-Val ；或Ala-X-Gly-Glu-Val (X 選自20個(gè)氨基酸中)表示的換向序列也能利用于β-發(fā)夾。根據(jù)本發(fā)明的例示性的實(shí)施例，I型換向序列為Asp-Asp-Ala-Thr-Lys-Thr， I ‘ 型換向序列是Glu-Asn-Gly-Lys，II型換向序列為X-Pro-Gly-Glu-Val或 Ala-X-Gly-Glu-Val (X選自20個(gè)氨基酸中)，11'型換向序列為Glu-Gly-Asn-Lys或 Glu-D-Pro-Asn-Lys。具有β-發(fā)夾構(gòu)象的肽已為本領(lǐng)域所熟知。例如熟知的有在美國專利第 6,914，123 號及 Andrea G. Cochran et al.，PNAS，98(10) :5578-5583)中公開的色氨酸拉鏈、在WO 2005/047503中公開的被鑄型固定的β -發(fā)夾模擬體、在美國專利第5，807，979號中公開的各β-發(fā)夾變形體。此外，具有β-發(fā)夾構(gòu)象的肽公開在 Smith&Regiin (1995) Science 270 :980-982 ；Chou&Fassmiin (1978) Armu. Rev. Biochem. 47 251-276 ；Kim&Berg(1993)Nature 362 :267-270 ；Minor&Kim(1994)Nature 367 :660-663 ； Minor&Kim(1993)Nature 371 :264-267 ；Smith et al.Biochemistry(1994) 33 :5510-5517 ； Searle et al. (1995) Nat. Struct. Biol. 2 :999-1006 ；Haque&Gellman (1997) J. Am. Chem. Soc. 119 :2303-2304 ；Blanco et al. (1993)J.Am. Chem. Soc. 115:5887-5888 ；de Alba et al. (1996)Fold. Des. 1 :133-144 ；de Alba et al. (1997)Protein Sci. 6 :2548-2560 ;Ramirez-Alvarado et al. (1996)Nat. Struct. Biol. 3 :604-612 ；Stanger&Gellman(1998) J.Am. Chem. Soc. 120 :4236-4237 ；Maynard&Searle(1997)Chem. Commun. 1297-1298 ； Griffiths-Jones et al. (1998)Chem. Commun. 789-790 ；Maynard et al. (1998)J. Am. Chem. Soc. 120 :1996-2007 ；及 Blanco et al. (1994) Nat. Struct. Biol. 1 :584-590 中，上述文獻(xiàn)作為參照內(nèi)容編入本說明書中。將具有β -發(fā)夾構(gòu)象的肽用作結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)時(shí)，最優(yōu)選為利用色氨酸拉鏈。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明中所利用的色氨酸拉鏈由以下通式I表示通式IX1-Trp (X2) X3-X4-X5 (X ‘ 2) X6-X7X1 為 Ser 或 Gly-Glu, X2 及 X' 2 相互獨(dú)立地為 Thr、His、Val、lie、Phe 或 Tyr, X3 為Trp或Tyr，)(4為I型、Γ型、II型、ΙΓ型或III型或ΙΙΓ型換向序列，)(5為Trp或 Phe，X6 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。更優(yōu)選地，在上述通式I中，&為Ser或Gly-Glu，&及X' 2相互獨(dú)立地為Thr、 His或ValJ3* Trp或TyrJ4為I型、I'型、II型或II'型換向序列，&為Trp或Phe， X6 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。進(jìn)而優(yōu)選地，在通式I中，&為Ser或Gly-GluJ2及X' 2相互獨(dú)立地為Thr、His 或ValJ3* TrpJ4為I型、Γ型、II型或ΙΓ型換向序列，&為Trp，)(6為Trp，X7為Lys 或 Ilir-Glu。再而優(yōu)選地，在通式I中，&為^^，)(2及父'2 SThrJ3STrpJ4S I'型或II' 型換向序列，X5為Trp, X6為Trp, X7為Lys0最優(yōu)選地，在通式1中，)(1為^^，)(2及)('2為1111~，)(3為^1)，)(4為Γ型換向序列(ENGK)或 ΙΓ 型換向序列(EGNK)，X5 為 Trp，X6 為 Trp，X7 為 Lys0適合于本發(fā)明的色氨酸拉鏈的例示性氨基酸序列記載于序列目錄第1序列至第3 序列以及第5序列至第10序列。在本發(fā)明中，能夠用作結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的β -發(fā)夾肽是來源于蛋白質(zhì)G的Bl域的肽，即為GBl肽。在本發(fā)明中利用GBl肽時(shí)，優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)由以下通式II表示通式IIX1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4X1SArgAGly-Glu 或 Lys-LysJ2 SGln 或 ThrJ3* I 型、I'型、II 型、ΙΓ 型或III型或III'型換向序列，)(4為Gin、Thr-Glu或Gln-Glu。更優(yōu)選地，通式II的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)由以下通式ΙΓ表示通式IIX1-Trp-Thr-Tyr-X2-Phe-Thr-Val-X3^C1SGly-Glu 或 Lys-LysJ2* I 型、Γ 型、II 型、ΙΓ 型或 III 型或 ΙΙΓ 型換向序列，X3 為 Thr-Glu 或 Gln-Glu。適合于本發(fā)明的GBl β -發(fā)夾的例示性氨基酸序列記載于序列目錄第4序列以及第14序列至第15序列。在本發(fā)明中，能夠用作結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的發(fā)夾肽是HP肽。本發(fā)明中利用HP肽時(shí)，優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)由以下通式III表示通式IIIX1-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7X1 為 Lys 或 Lys-Lys, X2 為 Trp 或 Tyr, X3 為 Val 或 Thr，X4 為 I 型、I'型、II 型、 II'型或 III 型或 III'型換向序列，或 AlaJ6STrp 或 Val，X7*Glu 或 Gln-Glu。在本發(fā)明中，能夠用作結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的其他β-發(fā)夾肽由以下通式IV表示通式IVX1-X2-X3-Trp-X4X1 為 Lys-Thr 或 Gly, X2 為 Trp 或 Tyr, X3 為 I 型、I'型、II 型、ΙΓ 型或 III 型或Iir型換向序列，& SThr-GlU或Gly。通式III及通式IV的β -發(fā)夾的例示性氨基酸序列記載于序列目錄第11序列至第12序列、第15序列以及第16序列至第19序列。根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)⑼ㄟ^連接物連接的β -折疊用作結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)。在β -折疊結(jié)構(gòu)中，在折疊結(jié)構(gòu)中，平行或反平行的、優(yōu)選為反平行的兩個(gè)氨基酸鏈形成為延伸結(jié)構(gòu)(extended form)，在氨基酸鏈之間形成氫鍵。在β-折疊結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)氨基酸鏈的相鄰的兩個(gè)末端通過連接物相連接。作為連接物能夠利用上述多種換向-序列或肽連接物。將換向-序列用作連接物時(shí)，最優(yōu)選為 β-換向序列。根據(jù)本發(fā)明的另一變形例，能夠?qū)⒘涟彼崂溁蛲ㄟ^連接物連接的亮氨酸拉鏈用作結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)。亮氨酸拉鏈?zhǔn)且鹌叫械?個(gè)α-鏈的二聚化的保存性肽結(jié)構(gòu)域，一般是從參與基因表達(dá)的蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)的二聚化結(jié)構(gòu)域(“Leucine scissors" . Glossary of Biochemistry and Molecular Biology (Revised). (1997). Ed. David M. Glick. London Portland Press ；Landschulz WH, et al. (1988) kience240 :1759-1764)。亮氨酸拉鏈一般包含七肽(heptad)重復(fù)序列，亮氨酸殘基位于第4或第5位置。例如能夠利用于本發(fā)明的亮氨酸拉鏈包含 LEALKEK、LKALEKE、LKKLVGE、LEDKVEE、LENEVAR 或 LLSKNYH 的氨基酸序列。 本發(fā)明中所利用的亮氨酸拉鏈的具體例子記載于序列目錄第39序列。亮氨酸拉鏈的各一半由較短的α-鏈組成，亮氨酸直接接觸于α-鏈之間。轉(zhuǎn)錄因子的亮氨酸拉鏈一般由疏水性亮氨酸拉鏈區(qū)及堿性區(qū)(是與DNA分子的主溝槽相互作用的區(qū))構(gòu)成。本發(fā)明中利用亮氨酸拉鏈時(shí)，并非必然需要堿性區(qū)。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)中兩個(gè)氨基酸鏈(即，兩個(gè)α-鏈) 的相鄰的兩個(gè)末端能夠通過連接物相連接。作為連接物能夠利用上述的多種換向-序列或肽連接物，優(yōu)選地利用不影響亮氨酸拉鏈的結(jié)構(gòu)的肽連接物。在上述的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩個(gè)末端將結(jié)合隨機(jī)氨基酸序列。上述隨機(jī)氨基酸序列形成靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)II。本發(fā)明的一個(gè)最大的特征在于在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩側(cè)末端連接靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)II，而以雙齒方式制造肽結(jié)合物。靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)II 相互配合地(cooperatively)與靶結(jié)合，從而大大地增加對于靶的親和力。靶結(jié)合區(qū)I的氨基酸數(shù)量η不受特殊限制，優(yōu)選為2-100的整數(shù)，更優(yōu)選為2_50 的整數(shù)，進(jìn)而優(yōu)選為2-20的整數(shù)，最優(yōu)選為3-10的整數(shù)。靶結(jié)合區(qū)II的氨基酸數(shù)量m不受特殊限制，優(yōu)選為2-100的整數(shù)，更優(yōu)選為2_50 的整數(shù)，進(jìn)而優(yōu)選為2-20的整數(shù)，最優(yōu)選為3-10的整數(shù)。
靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)II中能夠包含數(shù)量相互不同或相同的氨基酸殘基。靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)11中能夠包含相互不同或相同的氨基酸序列，優(yōu)選為包含相互不同的氨基酸序列。包含于靶結(jié)合區(qū)I和/或靶結(jié)合區(qū)II的氨基酸序列是線性型氨基酸序列或環(huán)狀型氨基酸序列。為了增加靶結(jié)合區(qū)的肽序列的穩(wěn)定性，在包含于靶結(jié)合區(qū)I和/或靶結(jié)合區(qū) II的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸殘基能夠變形為乙酰基、芴甲氧羰酰基、甲酸基、棕櫚?；?、肉豆蔻基、硬脂?；蚓垡叶?PEG)。與生物學(xué)靶分子結(jié)合的本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物能夠利用于生體內(nèi)生理學(xué)反應(yīng)的調(diào)節(jié)、生體內(nèi)物質(zhì)的檢測、體內(nèi)分子成像、體外細(xì)胞成像以及藥物傳遞用靶向，并能夠用作保護(hù)分子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)、靶結(jié)合區(qū)I或靶結(jié)合區(qū)II (更優(yōu)選為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)，進(jìn)而優(yōu)選為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的連接物)追加結(jié)合有功能性分子。上述功能性分子的例子包含產(chǎn)生能夠檢測的信號的標(biāo)記物、化學(xué)藥物、生物藥物、細(xì)胞穿透肽(CPP)或納米粒子，但不限于此。上述產(chǎn)生能夠檢測的信號的標(biāo)記物包含Tl造影物質(zhì)(例如Gd螯合物)、T2造影物質(zhì)(例如超順磁性物質(zhì)(例磁鐵礦、狗304、^-狗203、錳鐵氧體、鈷鐵氧體以及鎳鐵氧體))、 放射性同位素(例如 11C、150、13N、P32、S35、4你c、45Ti、1181、136La、198Tl、200Tl、205Bi 以及206Bi)、熒光物質(zhì)(熒光素(fluorescein)、藻紅素(phycoerythrin)、羅丹明、麗絲胺 (Iissamine)以及Cy3和Cy5)、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、磁性顆粒、大量標(biāo)志或密電子顆粒，但不限于此。上述化學(xué)藥物例如包含抗炎劑、鎮(zhèn)痛劑、抗風(fēng)濕劑、鎮(zhèn)痙劑、抗抑郁劑、抗精神病藥物、鎮(zhèn)靜劑、抗焦慮劑、抗麻醉劑、抗帕金森病藥物、膽堿能激動劑、抗癌劑、抗血管生成抑制劑、免疫抑制劑、抗病毒劑、抗生素、厭食劑、鎮(zhèn)痛劑、抗膽堿能藥物、抗組胺劑、抗偏頭痛藥物、激素藥、冠狀血管、腦血管或周圍血管擴(kuò)張藥、避孕藥、抗血栓劑、利尿劑、抗高血壓藥、 心血管病治療劑、美容成分(例如皺紋改善劑、皮膚老化抑制劑以及皮膚美白劑)等，但不限于此。上述生物藥物能夠是胰島素、IGF-l(insulin-likegrowth factorl)、 生長激素、紅細(xì)胞生成素、G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors) > GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors) > i)t M ~ a ^ i)t 素-β、干擾素-Y、白細(xì)胞介素-Ia及β、白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-2、EGFskpidermal growth factors 表皮生長因子)、降血鈣素 (calcitonin)、ACTH(adrenocorticotropic hormone 促腎上腺皮質(zhì)素)、TNF (tumor necrosis factor 月中瘤壞死因子)、阿托西班(atosiban)、布舍瑞林(buserelin)、 西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、去氛力口壓素(desmopressin)、強(qiáng)啡肽 A(dynorphin A) (1-13)、依降鈣素(elcatonin)、章魚唾腺精(eledoisin)、依替巴月太(eptifibatide) > GHRH-II (growth hormone releasing hormone-II 生長素釋放激素-Π)、戈那瑞林(gonadorelin)、戈舍瑞林(goserelin)、組氨瑞林(histrelin)、 亮丙瑞林(Ieuprorelin)、賴氨加壓素(Iypressin)、奧曲肽(octreotide)、催產(chǎn)素 (oxytocin)、加壓素(pitressin)、分泌素(secretin)、辛卡利特(sincalide)、特利加壓素(terlipressin)、胸腺噴丁 (thymopentin)、胸腺素(thymosine) α 、曲普瑞林 (triptorelin)、比伐盧定(bivalirudin)、卡貝縮官素(carbetocin)、環(huán)孢霉素、艾可西定(exedine)、蘭樂妝(Ianreotide)、LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone 黃體生成素釋放激素)、納發(fā)阮林(nafarelin)、甲狀旁腺素、普蘭林肽(pramlintide)、 T-20(enfuvirtide)、胸腺法新(thymalfasin)、齊考諾肽、RNA、DNA、cDNA、反義寡核苷酸以及siRNA，但不限于此。靶結(jié)合區(qū)I和/或靶結(jié)合區(qū)II能夠包含與多種靶結(jié)合的氨基酸序列。能夠被本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物進(jìn)行靶向的是生化物質(zhì)、肽、多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、諸如細(xì)胞及組織的生物學(xué)靶、化合物、金屬或非金屬物質(zhì)，優(yōu)選為生物學(xué)靶。由靶結(jié)合區(qū)結(jié)合的生物學(xué)靶優(yōu)選為生化物質(zhì)、肽、多肽、糖蛋白、核酸、碳水化合物、蛋白聚糖、脂質(zhì)或糖脂。例如由靶結(jié)合區(qū)結(jié)合的生化物質(zhì)包含多種生體內(nèi)代謝產(chǎn)物(例如ATP、NADH、 NADPH、碳水化合物代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物以及氨基酸代謝產(chǎn)物)。由靶結(jié)合區(qū)結(jié)合的例示性肽或多肽包含酶、配位體、受體、生物標(biāo)志、激素、轉(zhuǎn)錄因子、生長因素、免疫球蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)、結(jié)合蛋白質(zhì)、離子通道、抗原、粘附蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、毒蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子以及凝血因子，但不限于此。更詳細(xì)地，雙齒肽結(jié)合物的革巴包含 Fibronectin extra domain B (ED-B) >VEGF(vascular endothelial growth factor) >VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor)>VCAM1(vascular cell adhesion molecule-1)、nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)、HAS (Human serum albumin)>MyD88>EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)>HER2/neu>CD20>CD33XD52> EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule)> TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α ), IgE(Immunoglobul in E)、CDlIA ( α-chain of lymphocyte function-associated antigen 1)、CD3、CD25、Glycoprotein Ilb/IIIa、整合素、AFP(Alpha-fetoprotein)、 β 2M(Beta2-microglobulin) > BTA(Bladder Tumor Antigens) > NMP22> Cancer Antigen 125、Cancer Antigen 15-3、降血 丐素、Carcinoembryonic Antigen、Chromogranin A、 : #、 ￥ : #、Human Chorionic Gonadotrop in、Neuron-Specific Enolase、PSA (Prostate-Specific Antigen)、PAP (Prostatic Acid Phosphatase)以及 Thyroglobulin，但不限于此。由靴結(jié)合區(qū)結(jié)合的例示性核酸分子包含gDNA、mRNA、cDNA、rRNA(ribosomal RNA)、 rDNA(ribosomal DNA)以及tRNA，但不限于此。由靶結(jié)合區(qū)結(jié)合的例示性碳水化合物是生體內(nèi)碳水化合物，其包含單糖、雙糖、三糖以及多糖，但不限于此。由靶結(jié)合區(qū)結(jié)合的例示性脂質(zhì)包含脂肪酸、三脂酰甘油、鞘脂、神經(jīng)節(jié)苷脂以及膽固醇，但不限于此。本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物能夠與露出在細(xì)胞表面的生體分子(例如蛋白質(zhì))結(jié)合， 但也能與細(xì)胞內(nèi)的生體分子(例如蛋白質(zhì))結(jié)合，由此能夠調(diào)節(jié)生體分子的活性。優(yōu)選地，雙齒肽結(jié)合物對細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行靶向時(shí)，雙齒肽結(jié)合物還包含細(xì)胞穿膜肽(CPP)。上述CPP包含本領(lǐng)域中公開的多種CPP，例如包含HIV-ITat蛋白質(zhì)、Tat肽類似物(例如寡聚精氨酸)、ANTP肽、HSV VP22轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)、來源于vFGF的MTS肽、 Penetratin, Transportan或P^-I肽，但不限于此。將上述CPP與雙齒肽結(jié)合的方法有多種方法，例如使位于雙齒肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的環(huán)形部分的賴氨酸殘基與CPP進(jìn)行共價(jià)鍵合。細(xì)胞內(nèi)有著對生理活性起著重要作用的很多靶蛋白，結(jié)合有CPP的雙齒肽結(jié)合物流入到細(xì)胞內(nèi)與該靶蛋白結(jié)合而調(diào)節(jié)(例如抑制)活性。以下實(shí)施例19表示雙齒肽結(jié)合物對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行的靶向的具體例子。MyD88被廣知為與TLR 4、白細(xì)胞介素1受體、 RACUIRAK2以及IRAKI相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。由于對MyD88有著結(jié)合特異性的CPP-雙齒肽結(jié)合物進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)抑制MyD88的功能，從而有效地阻斷MMP-13的表達(dá)。如上所述，本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物具有典型的“N-靶結(jié)合區(qū)I-結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的一個(gè)鏈-連接物-結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的另一鏈-靶結(jié)合區(qū)II-C”組織。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物中靶結(jié)合區(qū)I和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的一個(gè)鏈之間和/或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的另一鏈-靶結(jié)合區(qū)II之間包含阻斷靶結(jié)合區(qū)與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)之間的相互結(jié)構(gòu)性影響的結(jié)構(gòu)影響抑制區(qū)(structure influence inhibiting region) 0肽分子中φ和Ψ的旋轉(zhuǎn)比較自由的氨基酸位于旋轉(zhuǎn)區(qū)。φ和Ψ的旋轉(zhuǎn)比較自由的氨基酸優(yōu)選為甘氨酸、丙氨酸及絲氨酸。在結(jié)構(gòu)影響抑制區(qū)能夠具有1-10個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選為1-8個(gè)，更優(yōu)選為1-3個(gè)。具有上述組織的本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物的文庫能夠通過本領(lǐng)域中所公知的多種方法而獲得。在該文庫中雙齒肽結(jié)合物具有隨機(jī)序列，這意味著在靶結(jié)合區(qū)I和/或靶結(jié)合區(qū)II的任何位置上均無順序偏好(sequence preference)或指定(或固定)的氨基酸殘基。例如雙齒肽結(jié)合物的文庫能夠根據(jù)在固相載體(例如聚苯乙烯或聚丙烯酰胺樹脂)上實(shí)施的均分合成法(Lam et al. (1991)Nature354 :82 ；WO 92/00091)而構(gòu)建。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，雙齒肽結(jié)合物的文庫以細(xì)胞表面展示(cell surface display)方式(例如噬菌體展示、細(xì)菌展示或酵母展示)構(gòu)建。優(yōu)選地，雙齒肽結(jié)合物的文庫能夠通過基于質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、噬菌粒、酵母、細(xì)菌、mRNA或核糖體的展示方式生成。噬菌體展示是以與噬菌體表面上的外殼蛋白融合的蛋白質(zhì)形態(tài)展示各種多肽的技術(shù)(Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249 386 ；Sambrook, J. et al.， Molecular Cloning. A Laboratory Manual,3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press (2004)) 。
(例如M13)的基因III或基因VIII融合所要表達(dá)的基因而展示隨機(jī)肽。噬菌體展示中能夠利用噬菌粒。噬菌粒是具有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(例如ColEl)及細(xì)菌噬菌體的基因間(intergenic)區(qū)的一副本的質(zhì)粒載體?？寺≡谠撌删５腄NA片段如質(zhì)粒一樣增殖。以噬菌體展示的方式構(gòu)建雙齒肽結(jié)合物的文庫時(shí)，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例包含如下步驟(i)制造表達(dá)載體文庫的步驟，該文庫包含由對噬菌體外殼蛋白質(zhì)(例如如M13的絲狀噬菌體的基因III或基因VIII的外殼蛋白質(zhì))進(jìn)行編碼的基因和對雙齒肽結(jié)合物進(jìn)行編碼的基因融合的融合基因；以及與上述融合基因操作性地結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如 Iac啟動子)；(ii)將上述表達(dá)載體的文庫導(dǎo)入至適合的宿主細(xì)胞的步驟；(iii)培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，形成重組噬菌體或噬菌粒病毒粒子，使得融合蛋白質(zhì)展示在表面上的步驟；(iv) 使生物學(xué)靶分子與上述病毒粒子接觸，而使粒子與靶分子結(jié)合的步驟；以及(ν)分離不與靶分子結(jié)合的粒子的步驟。利用噬菌體展示來構(gòu)建肽文庫，在美國專利第5，723，286號、第5，432，018號、 第 5，580，717 號、第 5，427，908 號、第 5，498，530 號、第 5，770，434 號、第 5，734，018 號、第 5，698，426號、第5，763，192號及第5，723，323號中公開了對這些文庫進(jìn)行淘選的方法。包含雙齒肽結(jié)合物基因的表達(dá)載體的制造方法能夠根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法而實(shí)施。例如能夠在公知的噬菌?；蛲淌奢d體(例如PIGT2、fUSE5、fAFFl、fd-CATU m663、 fdtetDOG、pHENl、pComb3、pComb8、pCANTAB 5E (Pharmacia)、LamdaSurfZap、pIF4、PM48、 PM52、PM54, fdH及p8V5)插入雙齒肽結(jié)合物基因而制造表達(dá)載體。雖然大部分噬菌體展示方式利用絲狀噬菌體來實(shí)施，但λ噬菌體展示(W0 95/34683 ；美國專利第 5，627，024 號)、Τ4 噬菌體展示(Renet al. (1998)Gene 215 :439 ； Zhu(1997)CAN 33 :534)及T7噬菌體展示(美國專利第5，766，905號)也能利用于雙齒肽結(jié)合物的文庫構(gòu)建。將載體文庫導(dǎo)入至適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞的方法能根據(jù)多種轉(zhuǎn)化方法而實(shí)施，最優(yōu)選地，根據(jù)電穿孔(electroporation)法而實(shí)施(參照美國專利第5，186，800號、第 5，422，272號、第5，750，373號)。適合于本發(fā)明的宿主細(xì)胞是如E. coli的革蘭氏陰性菌細(xì)胞，適合的 E. coli 宿主細(xì)胞包含 JM101、E. coli K12 strain 294,Ε. coli strain W3110 以及Ε. coli XL-IBlue (Mratagene)，但不限于此。宿主細(xì)胞優(yōu)選在轉(zhuǎn)化之前準(zhǔn)備為感受態(tài) MM (Sambrook, J. et al. ,Molecular Cloning. ALaboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)) 0對于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的淘選一般在包含抗生素(例如四環(huán)素及氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞而實(shí)施。在存在輔助噬菌體的情況下追加培養(yǎng)經(jīng)過淘選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞而生成重組噬菌體或噬菌體病毒粒子。適合用作上述輔助噬菌體的包含Ex輔助噬菌體、M13-K07、M13-VCS以及R408，但不限于此。與生物學(xué)靶分子結(jié)合的病毒粒子的淘選通常能夠通過生物淘選過程而實(shí)施 (Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual,3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001) ；Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press (2004))ο本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物的具體例子記載于序列目錄第20序列-第38序列及第40 序列-第41序列。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種對上述雙齒肽結(jié)合物進(jìn)行編碼的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的還一實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包含對雙齒肽結(jié)合物進(jìn)行編碼的核酸分子的雙齒肽結(jié)合物的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包含雙齒肽結(jié)合物的表達(dá)用載體的轉(zhuǎn)化體。本說明書中的術(shù)語“核酸分子”具有總括DNA (gDNA及cDNA)及RNA分子的意思，作為核酸分子的基本結(jié)構(gòu)單位的核苷酸不僅包含天然的核苷酸，還包含由糖基或堿基區(qū)變形 i^MU^ (analogue) (Scheit，Nucleotide Analogs, John Wiley,New York(1980) ；Uhlman R Peyman, Chemical Reviews, 90 :543-584(1990))。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的載體除了對雙齒肽結(jié)合物進(jìn)行編碼的核酸分子以外還包含能夠?qū)ι鲜龊怂岱肿舆M(jìn)行轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)效啟動子(例如tac啟動子、Iac啟動子、 lacUV5啟動子、Ipp啟動子、pLX啟動子、pRX啟動子、rac5啟動子、amp啟動子、recA啟動子、SP6啟動子、trp啟動子及T7啟動子等)、用于開始翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄/ 翻譯終結(jié)序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的載體還能夠在對雙齒肽結(jié)合物進(jìn)行編碼的核酸分子的5‘_方向側(cè)包含信號序列(例如pelB)。而且，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的載體還能夠包含用于確認(rèn)雙齒肽結(jié)合物在噬菌體表面上是否表達(dá)好的標(biāo)記序列(例如 myc tag) 0根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的載體包含對噬菌體外殼蛋白質(zhì)，優(yōu)選為如Ml3 的絲狀噬菌體的基因III或基因VIII的外殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的載體包含細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(例如ColEl)和/或細(xì)菌噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)。 另一方面，本發(fā)明的載體作為選擇標(biāo)志能夠包含通常利用于本領(lǐng)域中的抗生素抗性基因， 例如能夠包含對氨芐青霉素、慶大霉素、羧芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、遺傳霉素、 新霉素以及四環(huán)素的抗性基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選為如E. coli的革蘭氏陰性菌細(xì)胞，適合的E. coli 宿主細(xì)胞包含 JM101、E. coli K12 strain 294, Ε. coli strainW3110 及 Ε. coli XL-IBlue(Stratagene)，但不限于此。將本發(fā)明的載體運(yùn)送到宿主細(xì)胞內(nèi)的方法能夠通過 CaC12法(Cohen, S. N. et al. ,Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9 :2110-2114 (1973))、Hanahan方法(Cohen, S. N. et al. , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9 :2110-2114(1973)；以及 Hanahan，D.， J. Mol.Biol.，166 :557-580(1983))及電穿孔法(美國專利第 5，186,800 號、第 5,422, 272 號、第5，750，373號)等而實(shí)施。本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物提供一種表現(xiàn)出極低水平(例如nM水平)的KD值(解離常數(shù))，而對生物學(xué)靶分子表現(xiàn)出十分高的親和力的肽。如以下實(shí)施例所述，與以單齒 (monopodal)方式制造的結(jié)合物進(jìn)行比較時(shí)，雙齒肽結(jié)合物表現(xiàn)出高達(dá)約102-105倍(優(yōu)選為約103-104倍)的高親和力。本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物不僅具有醫(yī)藥用途，同時(shí)還能用于生物體內(nèi)物質(zhì)檢測、體內(nèi)分子成像、體外細(xì)胞成像以及藥物傳遞用靶向，并且用作保護(hù)分子也非常有效。歸納本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)為如下(i)本發(fā)明提供一種具有新型組織的雙齒肽結(jié)合物。(ii)本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物中結(jié)合在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩個(gè)末端的末梢的 (distal)兩個(gè)靶結(jié)合區(qū)相互配合地(cooperatively)、協(xié)同地(synergetically)與靶結(jié)合。(iii)因此，本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物表現(xiàn)出極低水平(例如nM水平)的KD值(解離常數(shù))，對靶分子表現(xiàn)出十分高的親和力。(iv)本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物不僅具有醫(yī)藥用途，還能用于生物體內(nèi)物質(zhì)檢測、體內(nèi)分子成像、體外細(xì)胞成像以及藥物傳遞用靶向，并且用作保護(hù)分子也非常有效。

圖Ia表示包含作為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的β-發(fā)夾(hairpin)的雙齒肽結(jié)合物(bipodal-peptide binder)的不意圖。圖Ib表示包含作為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的通過連接物連接的β -折疊的雙齒肽結(jié)合物 (bipodal-peptide binder)的不意圖。圖Ic表示包含作為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的通過連接物連接的亮氨酸拉鏈的雙齒肽結(jié)合物(bipodal-peptide binder)的示意圖。圖Id表示包含作為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的通過連接物連接的富亮氨酸基序 (leucine-rich motif)的雙齒肽結(jié)合物(bipodal-p印tide binder)的示意圖。圖2表示用于克隆雙齒肽結(jié)合物文庫的策略。在PIGT2噬菌粒載體圖中，pelB信號序列、myc tag是用于確認(rèn)靶基因在噬菌體表面上是否表達(dá)好的標(biāo)記序列。將Iac啟動子用作了啟動子。圖3表示纖維連接蛋白ED-B生物淘選過程中對于輸入的噬菌體(Input phage) 的ED-B、鏈霉親和素以及BSA的生物淘選結(jié)果。圖4表示纖維連接蛋白ED-B生物淘選過程中對于在雙齒肽結(jié)合物文庫的生物淘選的第三步驟中回收的60種重組噬菌體的ED-B及BSA的ELISA結(jié)果。圖fe表示與纖維連接蛋白ED-B蛋白質(zhì)結(jié)合的特定雙齒肽結(jié)合物的親和力的測定結(jié)果。圖恥表示與VEGF結(jié)合的特定雙齒肽結(jié)合物的親和力的測定結(jié)果。圖5c表示與VCAMl結(jié)合的特定雙齒肽結(jié)合物的親和力的測定結(jié)果。圖 5d 表示與 nAchR(Nicotinic acetylcholine rec印tor)結(jié)合的特定雙齒肽結(jié)合物的親和力的測定結(jié)果。圖&表示與HAS (Human Serum Albumin)結(jié)合的特定雙齒肽結(jié)合物的親和力的測
定結(jié)果。圖6a表示為了檢測纖維連接蛋白ED-B的特異性，將具有雙齒肽結(jié)合物的重組噬菌體針對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行ELISA而測定吸光度的結(jié)果。從左側(cè)條開始是關(guān)于鏈霉親和素、 ED-B、乙酰膽堿α l、BSA、VCAM、TNF-a、凝血酶、肌紅蛋白、溶菌酶及內(nèi)臟脂肪素的結(jié)果。圖6b表示為了檢測VEGF的特異性，將具有雙齒肽結(jié)合物的重組噬菌體針對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行ELISA而測定吸光度的結(jié)果。圖6c表示為了檢測VCAMl的特異性，將具有雙齒肽結(jié)合物的重組噬菌體針對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行ELISA而測定吸光度的結(jié)果。圖6d表示為了檢測nAchR片段肽的特異性，將具有雙齒肽結(jié)合物的重組噬菌體針對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行ELISA而測定吸光度的結(jié)果。圖6e表示為了檢測HSA的特異性，將具有雙齒肽結(jié)合物的重組噬菌體針對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行ELISA而測定吸光度的結(jié)果。圖6f表示為了檢測MyD88的特異性，將具有雙齒肽結(jié)合物的重組噬菌體針對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行ELISA而測定吸光度的結(jié)果。圖7表示用于證明雙齒肽結(jié)合物的共同作用效果的親和力的測定結(jié)果。圖8表示在雙齒肽結(jié)合物中將結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的色氨酸拉鏈替代為各種β-發(fā)夾基序而測定雙齒肽結(jié)合物的親和力的結(jié)果。圖9表示在雙齒肽結(jié)合物中將結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的色氨酸拉鏈替代為亮氨酸拉鏈而測定雙齒肽結(jié)合物的親和力的結(jié)果。圖10表示對作為癌癥生物標(biāo)記物的纖維連接蛋白ED-B顯現(xiàn)特異性的雙齒肽結(jié)合物的癌癥靶向結(jié)果。隨著時(shí)間的經(jīng)過能夠觀察到雙齒肽結(jié)合物蓄積在癌細(xì)胞上。當(dāng)分離各器官而測定熒光時(shí)，也能觀察到雙齒肽結(jié)合物大量蓄積在癌細(xì)胞上。圖11表示對存在于細(xì)胞內(nèi)的抑制MyD88活性的特異性雙齒肽結(jié)合物的效果進(jìn)行了證明的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。這些實(shí)施例只是為了更具體地說明本發(fā)明而提出的，根據(jù)本發(fā)明的原理，很顯然對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域不由這些實(shí)施例決定。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施例1文庫的制造雙齒肽結(jié)合物基因制造及向噬菌粒載體的插入合成了 2 個(gè)寡核苷酸 Beta-Fl (5 ‘ -TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC (NNK) 6GGATCTTGGACA TGGGAAAACGGAAAA-3‘)及 Beta-Bl(5‘ -AACAGTTTCTGCGGCCGCTCCTCC TCC(MNN)6TCCCTTC CATGTCCATTTTCCGTT-3 ‘ ) (N 為 A、T、G 或 C ;K 為 G 或 T ;M 為 C 或 A)。為了制造雙鏈，混合 Beta-Fl 4 μ M、Beta_B14 μ Μ、2· 5mM dNTP 混合液 4 μ 1、ExTaq DNA 聚合酶 1 μ 1 (Takara 公司，首爾，韓國)及10XPCR緩沖液5μ 1后添加蒸餾水使其總量為50 μ 1而制造了 25種混合液。使該混合液進(jìn)行PCR反應(yīng)(在94°C條件下進(jìn)行5分鐘，60周期在30°C條件下進(jìn)行30秒，在72°C條件下進(jìn)行30秒，以及在72°C條件下進(jìn)行7分鐘)而制造成雙鏈后，利用 PCR純化試劑盒(GeneAll公司，首爾，韓國)進(jìn)行純化而得到雙齒肽結(jié)合物基因。為了將待插入于雙齒肽結(jié)合物的基因與PIGT2噬菌粒載體(Igtherapy，春川，韓國)連接，用限制酶對插入基因與PIGT2噬菌粒載體進(jìn)行處理。對約Ilyg的插入DNA用SfiI (New England Biolabs (NEB, Ipswich)及NotI (NEB，Ipswich)分別進(jìn)行4小時(shí)的反應(yīng)之后利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。而且，對約40 μ g的pIGT2噬菌粒載體用SfiI及NotI分別進(jìn)行4個(gè)小時(shí)的反應(yīng)之后，投入 CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)而進(jìn)行1小時(shí)的反應(yīng)之后利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。用UV-可見光分光光度計(jì)(Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)對其進(jìn)行定量后，利用T4 DNA連接酶(Bioneer公司，大田，韓國)使2. 9 μ g的插入基因與pIGT2噬菌粒載體12 μ g，在18°C條件下連接15小時(shí)后， 用乙醇進(jìn)行沉淀，用TE緩沖液100 μ 1溶解DNA。準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞在LB 瓊脂平板上劃線涂抹 Ε. coli XLl-BLUE 細(xì)胞(American Type Culture Collection公司，馬納薩斯，美國)。將在瓊脂平板培養(yǎng)基生長的群落接種到5ml的LB培養(yǎng)基后，在37°C條件下以200rpm的速度進(jìn)行混合而培養(yǎng)一天。將培養(yǎng)的IOml的各細(xì)胞接種到21的LB培養(yǎng)基后，以相同的方式進(jìn)行培養(yǎng)，直至吸光度在600nm的波長中達(dá)到0. 3-0. 4 為止。將培養(yǎng)的燒瓶在冰上放置30分鐘后，在4°C條件下以4，OOOXg進(jìn)行離心分離20分鐘，由此去除除了沉淀的細(xì)胞以外的所有上清液，并且用11的經(jīng)冷卻的滅菌蒸餾水進(jìn)行懸浮。以相同的方法重新對其進(jìn)行離心分離去除上清液后，用11的經(jīng)冷卻的滅菌蒸餾水重新進(jìn)行懸浮，并以相同的方式用10%的甘油溶液40ml反復(fù)清洗而離心分離后，每一次分注 200 μ 1而在液態(tài)氮的條件下進(jìn)行冷凍后，在-80°C條件下保管。電穿孔法將在噬菌粒載體12 μ g和雙齒肽結(jié)合物中使2. 9 μ g的插入DNA進(jìn)行連接反應(yīng)的 100 μ 1的反應(yīng)溶液分注為25份進(jìn)行電穿孔法。在冰上解凍感受態(tài)細(xì)胞，將200 μ 1的感受態(tài)細(xì)胞與經(jīng)過連接反應(yīng)的4μ 1溶液混合后進(jìn)行冷卻而放入到準(zhǔn)備好的0. 2cm試管中，然后在冰上放置1分鐘。在200 Ω條件下，以25yF及2. 5kV的條件，對電穿孔儀(BioRad， Hercules, CA)進(jìn)行程序設(shè)定后，去除準(zhǔn)備好的試管上的水分，并將其定位于電穿孔儀之后施加脈沖(時(shí)間常數(shù)為4.5-5mSec)。而后立即將其放入到準(zhǔn)備好的37°C的包含20mM葡萄糖的Iml的LB液體培養(yǎng)基，將得到的總共為25ml的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到IOOml試管中。在37°C條件下，以200rpm混合而培養(yǎng)一小時(shí)后，為了測定文庫的數(shù)量稀釋10 μ 1而涂抹在氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基上。將剩下的細(xì)胞放入到11的LB，其中放入20mM葡萄糖及50 μ g/ml的氨芐青霉素，在30°C條件下培養(yǎng)一天。在4°C條件下，以4，OOOXg進(jìn)行20分鐘的離心分離，由此去除除了沉淀的各細(xì)胞以外的所有上清液，并且用40ml的LB重新進(jìn)行懸浮后放入達(dá)到最終濃度20 %以上的甘油，并在-80 V條件下保管。文庫中重組噬菌體的生產(chǎn)和PEG的沉淀在_80°C條件下貯存的雙齒肽結(jié)合物文庫中生產(chǎn)重組噬菌體。在500ml燒瓶中放入添加了氨芐青霉素(50 μ g/ml)及20mM葡萄糖的IOOml的LB液體培養(yǎng)基后，填加在_80°C條件下貯存的文庫1ml，并在37°C條件下，以150rpm混合而培養(yǎng)一小時(shí)。其中放入 IX IO11Pfu的Ex輔助噬菌體(Ig therapy，春川，韓國)以相同的條件重新培養(yǎng)一小時(shí)。以 1，000 Xg進(jìn)行10分鐘的離心分離，由此去除上清液，向此放入包含氨芐青霉素(50 μ g/ml) 及卡那霉素(25 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基IOOml之后培養(yǎng)一天，從而生產(chǎn)重組噬菌體。在以3，OOOXg對培養(yǎng)液進(jìn)行10分鐘的離心分離而得到的IOOml上清液中混合25ml的PEG/ NaCl，然后在冰上放置1小時(shí)后，在4°C條件下，以10，000 X g進(jìn)行20分鐘的離心分離，由此謹(jǐn)慎地去除上清液，并用2ml的PBS(pH 7. 4)重新對顆粒進(jìn)行懸浮。實(shí)施例2:準(zhǔn)備蛋白質(zhì)如下地準(zhǔn)備了將在實(shí)施例中用到的纖維連接蛋白(Fibronectin) ED-B, VEGF(vascular endothelial growth factor)> VCAMl(vascular cell adhesion molecule-1)、nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)、HSA(Human serum albumin) 及 MyD88。纖維連接蛋白ED-B基因制造及向表達(dá)載體的插入從韓國生命工程研究院中接收了部分人體纖維連接蛋白ED-B(ID = KU017225)基因。通過合成弓丨物 EDB_F1 (5 ‘ -TTCATAACATATGCCAGAGGTGCCCCAA-3 ‘)及 EDB_B1 (5 ‘ -A TTGGATCCTTACGTTTGTTGTGTCAGTGTAGTAGGGGCACTCTCGCCGCCATTAATGAGAGTGATMCGCTGATATCA TAGTCAATGCCCGGCTCCAGCCCTGTG-3 ‘)，制造了混合 EDB-F1 20pmol、EDB-B1 20pmol、2. 5mM dNTP混合液4 μ UExTaq DNA聚合酶1 μ 1 (10U)及10 X PCR緩沖液5 μ 1后添加蒸餾水使其總量為50 μ 1的混合液。對該混合液進(jìn)行PCR反應(yīng)(在94°C條件下5分鐘，30周期在55°C 條件下30秒，在72°C條件下1分鐘以及在94°C條件下30秒)而制造EDB插入基因后，利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。為了將EDB插入基因與pET28b原核表達(dá)載體(Novagen)進(jìn)行連接，用限制酶對EDB插入基因及ρΕΤ2^3原核表達(dá)載體進(jìn)行處理。用BamHI (NEB, Ipswich) 及NdeI (NEB, Ipswich)對約2 μ g的插入DNA分別進(jìn)行4小時(shí)的反應(yīng)后，利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。而且，使約2 μ g的pIGT2噬菌粒載體分別與BamHI和NdeI反應(yīng)3小時(shí)后，放入CIAP反應(yīng)一小時(shí)后，利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。對其添加載體與插入基因至載體與插入基因的摩爾比約為1 3，利用T4DNA連接酶(Bioneer公司，大田，韓國)，在18°C條件下連接10小時(shí)，并轉(zhuǎn)化到XL-I感受態(tài)細(xì)胞后，涂抹在包含卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基上。將生長在瓊脂平板培養(yǎng)基的群落接種到5ml的LB培養(yǎng)基后，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)一天后，利用質(zhì)粒提取試劑盒(GeneAll公司，首爾，韓國)對質(zhì)粒進(jìn)行純化，通過測序確認(rèn)克隆是否成功。VEGF121基因制造及向表達(dá)載體的插入從細(xì)胞因子庫(全州，韓國)中接收了部分人體VEGF(ID = G157)基因。通過合成引物 VEGF_F1 (5 ‘ -ATAGAATTCGCACCCATGGCAGAA-3 ‘)及 VEGF_B1 (5 ‘ -ATTAAGCTTTCACC GCCTCGGCTTGTCACAATTTTCTTGTCTTGC-3')，制造了混合 VEGF-F1 20pmol、VEGF_Bl 20pmol、 2. 5mM dNTP混合液4 μ 1、ExTaq DNA聚合酶1 μ 1 (IOU)及IOXPCR緩沖液5 μ 1后添加蒸餾水使其總量為50μ1的混合液。對該混合液進(jìn)行PCR反應(yīng)(在94°C條件下5分鐘，30 周期在55°C條件下30秒，在72°C條件下1分鐘以及在94°C條件下30秒)而制造VEGF 插入基因后，利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。為了將VEGF插入基因與pET3h原核表達(dá)載體(Novagen)進(jìn)行連接，用限制酶對VEGF插入基因及pET3h原核表達(dá)載體進(jìn)行處理。用 EcoRI (NEB, Ipswich)與 HindIII (NEB, Ipswich)對約 2 μ g 的插入 DNA 分別進(jìn)行 4 小時(shí)的反應(yīng)后，利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。對其添加載體與插入基因至載體與插入基因的摩爾比約為1 3，利用T4DNA連接酶(Bioneer公司，大田，韓國)，在18°C條件下連接10小時(shí)，并轉(zhuǎn)化到XL-I感受態(tài)細(xì)胞后，涂抹在包含氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基上。將生長在瓊脂平板培養(yǎng)基的群落接種到5ml的LB培養(yǎng)基后，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)一天后，利用質(zhì)粒提取試劑盒(GeneAll公司，首爾，韓國)對質(zhì)粒進(jìn)行純化，通過測序確認(rèn)克隆是否成功。VCAM1基因制造及向表達(dá)載體的插入從韓國生命工程研究院中接收了人體VCAMl基因。為了將VCAMl插入基因與 pET32a原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，用限制酶對VCAMl插入基因及pET3h原核表達(dá)載體進(jìn)行處理。對其添加載體與插入基因至載體與插入基因的摩爾比約為1 3，利用T4DNA連接酶 (Bioneer公司，大田，韓國)，在18°C條件下連接10小時(shí)，并轉(zhuǎn)化到XL-I感受態(tài)細(xì)胞后，涂抹在包含氨芐青霉素(ampicillin)的瓊脂培養(yǎng)基上。將生長在瓊脂平板培養(yǎng)基的群落接種在5ml的LB培養(yǎng)基后，在37 °C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)一天后，利用質(zhì)粒提取試劑盒(GeneAll公司，首爾，韓國)對質(zhì)粒進(jìn)行純化，通過測序確認(rèn)克隆是否成功。纖維連接蛋白ED-B的表達(dá)及純化對纖維連接蛋白ED-B進(jìn)行克隆的pET28b原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21細(xì)胞后，將其涂抹在包含卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基上。將生長在瓊脂平板培養(yǎng)基的群落接種到包含卡那霉素(25 μ g/ml)的5ml的LB培養(yǎng)基后，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)移到包含卡那霉素(25 μ g/ml)的50ml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3小時(shí)。將培養(yǎng)的E. coli接種到包含卡那霉素(25 μ g/ml)的21的LB而培養(yǎng)至OD = 0. 6-0. 8。之后放入ImM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)8小時(shí)。 以4，OOOXg進(jìn)行20分鐘的離心分離，由此去除除了沉淀的細(xì)胞以外的所有上清液，并用裂解緩沖液(50mM的磷酸鈉(pH 8. 0)、300mM的NaCl及5mM的咪唑)進(jìn)行懸浮。在_80°C 條件下保管一天后，利用超聲波破碎儀溶解Ε. coli后，以15，000Xg進(jìn)行一小時(shí)的離心分離，由此使上清液與Ni-NTA親和樹脂(Elpisbio公司，大田，韓國)結(jié)合。用裂解緩沖液清洗樹脂后，利用洗脫緩沖液(50mM的磷酸鈉(pH8. 0)、300mM的NaCl及300mM的咪唑)洗脫而獲得 N-末端 His-tagED-B 蛋白質(zhì)。利用 Superdex75 色譜柱(GE Healthcare,United Kingdom)及PBS(pH 7. 4)緩沖液通過凝膠過濾法(gel filtration)獲得高純度ED-B蛋白質(zhì)。為了進(jìn)行生物淘選，將生物素與ED-B蛋白質(zhì)連接。在常溫下，在存在0. IM磷酸鈉的條件下，使 6mg 的生物素標(biāo)記試劑(Sulfo-NHS-SS-Biotin) (PIERCE, Illinois, USA)及 1. 5mg 的 ED-B蛋白質(zhì)反應(yīng)2小時(shí)，為了去除未反應(yīng)的生物素標(biāo)記試劑，利用SuperdeX75色譜柱(GE Healthcare, United Kingdom)及 PBS(pH 7.4)緩沖液通過凝膠過濾法(gel filtration) 對生物素-EDB蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。VEGF121與VCAMl-iTrx的表達(dá)及純化將對VEGF121與VCAMl進(jìn)行克隆的pET3h原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到AD494細(xì)胞之后涂抹在包含氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基上。將在瓊脂平板培養(yǎng)基生長的群落接種到包含氨芐青霉素(25 μ g/ml)的5ml的LB培養(yǎng)基后，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)移到包含氨芐青霉素(25 μ g/ml)的50ml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3小時(shí)。將培養(yǎng)的E. coli接種到包含氨芐青霉素(25 μ g/ml)的21的LB而培養(yǎng)至OD = 0. 6-0. 8。之后放入ImM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)8小時(shí)。以4，OOOXg進(jìn)行20分鐘的離心分離，由此去除除了沉淀的細(xì)胞以外的所有上清液，并用裂解緩沖液(50mM的磷酸鈉(pH 8. 0)、300mM的NaCl及5mM的咪唑)進(jìn)行懸浮。在-80 0C條件下保管一天后，利用超聲波破碎儀溶解E. C01 i后，以15，000 X g進(jìn)行一小時(shí)的離心分離，由此將上清液與Ni-NTA親和樹脂(Elpisbio公司，大田，韓國)結(jié)合。用裂解緩沖液清洗樹脂后，利用洗脫緩沖液(50mM的磷酸鈉(pH 8. 0)、300mM的NaCl及300mM 的咪唑)洗脫而獲得iTrx-VEGFUl蛋白質(zhì)。利用Superdex75色譜柱(GE Healthcare，英國)及PBS(pH 7.4)緩沖液，并通過凝膠過濾法(gel filtration)獲得高純度VEGF-Trx 及VCAMl-Trx蛋白質(zhì)。為了獲得純粹的VEGF，用凝血酶切斷VEGF與Trx之間而獲得了 VEGF121。另一方面，HAS是從 Genetex 公司(Irvine)購入使用。nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)的片段肽biotin-SGEWVIKEARGWKHWVFYSCCPTTPYLDIITH(32mer) 是在anygen(韓國，光州)合成的。Human MyD88從Santa Cruz Biotechnology (sc-4540WB) (California)購得。實(shí)施例3:生物淘選方法Biotin纖維連接蛋白(Fibronectin) ED-B蛋白質(zhì)和Biotin-nAchR肽的生物淘選方法將2ml的鏈親和素(10 μ g/ml)以每孔50 μ 1的量放入到96孔ELISA板(Corning) 的40個(gè)孔，在4°C條件下放置一晚，次日僅針對其中的20個(gè)孔用0. 的PBST(tween-20)清洗3次之后，分別放入生物素ED-B和生物素IiAchRdO μ g/ml)并在常溫下放置1小時(shí)。 然后，用0. 1 % PBST清洗3次上述40個(gè)孔，通過使用用PBS稀釋的2%的BSA在常溫下封阻2小時(shí)后，倒掉全部溶液并用0. 1% PBST清洗3次。對其混合包含雙齒肽結(jié)合物重組噬菌體的溶液800μ 1及10%BSA200l·! 1，為了去除結(jié)合于鏈親和素及BSA的各噬菌體而放入到涂敷有鏈親和素及BAS的20個(gè)孔，在27°C條件下放置1小時(shí)?；厥丈锨逡翰⑥D(zhuǎn)移至結(jié)合有ED-B和nAchR的20個(gè)孔，在27°C條件下放置45分鐘。去除20個(gè)孔的全部溶液，并使用0. 5% PBST清洗15次后，將Iml的0. 2M甘氨酸/HCl (pH 2. 2)以每孔50 μ 1的量放入到各孔，由此洗脫噬菌體20分鐘，將Iml溶液收集到管中并放入150 μ 1的2MTris-base (pH 9.0)而對溶液進(jìn)行中和。為了測定每次進(jìn)行生物淘選時(shí)的輸入的噬菌體及洗脫下來的噬菌體(Eluted phage)的數(shù)量，混合至OD = 0. 7的XL-1 BLUE細(xì)胞并涂抹至包含氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基。為了反復(fù)進(jìn)行淘選，與IOml的E. coli XLl-BLUE細(xì)胞混合而在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)1小時(shí)左右?；旌习逼S青霉素(50 μ g/ml)及20mM葡萄糖后，添加2 X IOlOpfu的Ex輔助噬菌體并在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)1 小時(shí)。對培養(yǎng)液以1，OOOXg進(jìn)行離心分離10分鐘后，去除上清液并將沉淀的細(xì)胞用包含氨芐青霉素(50 μ g/ml)及卡那霉素(25 μ g/ml)的40ml的LB液體培養(yǎng)基重新進(jìn)行懸浮， 在30°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)一天。在4，000Xg、20分鐘及4°C條件下，對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離。上清液中添加8ml的切PEG/NaCl[20% PEG(w/v)及15% NaCl (w/ ν)]后，在4°C條件下放置1小時(shí)。離心分離后徹底去除PEG溶液，用Iml的PBS溶液溶解噬菌體肽顆粒后將其用于第2輪生物淘選。各個(gè)淘選步驟均使用上述方法，只有清洗過程按不同步驟分別增加25次及35次(0. 5% PBST)。VEGF、VCAMl-I^uHumanserum albumin (HAS)以及 MyD88 的生物淘選方法將VEGF、VCAMl-trx、HAS 以及 MyD 88 (5 μ g/ml)以每孔 50 μ 1 的量放入到 96 孔 ELISA板(Corning)的10個(gè)孔，并在4°C條件下放置一晚，次日使用2% BSA在常溫下封阻2 小時(shí)后，倒掉全部溶液并用0. PBST清洗3次。對其混合包含雙齒肽結(jié)合物重組噬菌體的溶液800 μ 1及10% BSA 200 μ 1，并轉(zhuǎn)移至結(jié)合有VEGF、VCAMI-Trx以及HAS的10個(gè)孔，并在常溫下放置1小時(shí)。去除10個(gè)孔的全部溶液，使用0. 1 % PBST清洗10次后，將Iml的0. 2M 甘氨酸/HCl (pH2. 2))以每孔50 μ 1的量放入到各孔內(nèi)，洗脫噬菌體20分鐘，將Iml溶液收集到管中并放入150 μ 1的2Μ Tris-base(pH 9. 0)對溶液進(jìn)行中和。為了測定每進(jìn)行生物淘選時(shí)的輸入的噬菌體及洗脫下來的噬菌體的數(shù)量，混合至OD = 0. 7的XL-IBLUE細(xì)胞并涂抹至包含氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基。為了反復(fù)進(jìn)行淘選，與IOml的E. coli XLl-BLUE細(xì)胞混合，并在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)1小時(shí)。混合氨芐青霉素(50 μ g/ ml)及20mM葡萄糖后，添加2 X liTpfu的Ex輔助噬菌體，并在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)1小時(shí)。對培養(yǎng)液以1，OOOXg進(jìn)行10分鐘的離心分離后，去除上清液并將沉淀的細(xì)胞用包含氨芐青霉素(50 μ g/ml)及卡那霉素(25 μ g/ml)的40ml的LB液體培養(yǎng)基重新進(jìn)行懸浮，在30°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)一天。在4，000X g、20分鐘及4°C條件下，對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離。上清液中添加8ml的切PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 及15% NaCl(W/v)]后，在4°C條件下放置1小時(shí)。離心分離后徹底去除PEG溶液，用Iml的 PBS溶液溶解噬菌體肽顆粒后將其用于第2輪生物淘選。各個(gè)淘選步驟均使用上述方法，只有清洗過程按不同步驟分別增加20次及30次(0. 1% PBST)。
實(shí)施例4纖維連接蛋白ED-B的輸入的噬菌體的ELISA關(guān)于雙齒肽結(jié)合物文庫的各個(gè)輸入的噬菌體的ELISA，針對鏈親和素、BSA及ED-B 實(shí)施。將10 μ g/ml的鏈親和素以每孔50 μ 1的量放入到96孔ELISA板的18個(gè)孔，將10 μ g/ ml的BSA以每孔50 μ 1的量放入到9個(gè)孔，并在4°C條件下放置一晚。次日僅針對含有鏈親和素的18個(gè)孔中的9個(gè)孔用0. 的PBST(tween-20)清洗3次，放入生物素ED-B(10 μ g/ ml)并在常溫條件下放置1小時(shí)。然后，用0.1% PBST清洗3次上述全部孔，使用用PBS稀釋的2%BSA在常溫條件下封阻2小時(shí)后，倒掉全部溶液并用0. 1%PBST清洗3次。對其混合作為雙齒肽結(jié)合物重組噬菌體的第一個(gè)、第二個(gè)及第三個(gè)輸入的噬菌體800 μ 1及10% BSA 200 μ 1之后將其分注到ED-B、鏈親和素及BSA孔等三個(gè)孔內(nèi)各100 μ 1，在27°C條件下放置1小時(shí)30分鐘。使用0. 1 % PBST溶液清洗10次后，以1 1，000比例稀釋HRP-綴合物抗-M13抗體(GEHealthcare)，并在27°C條件下反應(yīng)1小時(shí)。使用0. 1% PBST清洗5次后，分注作為過氧化物酶的基質(zhì)的四甲基聯(lián)苯胺(TMB) (BDScience)溶液100 μ 1而引發(fā)顯色反應(yīng)之后，添加100 μ 1的IM HCl而中止反應(yīng)。然后在450nm中測定吸光度。實(shí)施例5特異于纖維連接蛋白ED-B，VEGF, VCAMl，nAchR，HSA, MyD88蛋白質(zhì)的噬菌體肽搜索(噬菌體ELISA)將在輸出的噬菌體/輸入的噬菌體比例最高的生物淘選步驟中回收的噬菌體感染至XLl-BLUE細(xì)胞后進(jìn)行涂抹，使得每個(gè)板上存在100 200個(gè)噬斑。利用滅菌的吸頭將 60個(gè)噬斑接種至2ml的LB-氨芐青霉素(50 μ g/ml)培養(yǎng)液后，在37°C條件下進(jìn)行5小時(shí)的振蕩培養(yǎng)，在OD = 0. 8-1時(shí)添加5 X IOi3Pfu的Ex輔助噬菌體，在37°C條件下以200rpm 的速度混合而培養(yǎng)1小時(shí)。對培養(yǎng)液以1，OOOXg進(jìn)行10分鐘的離心分離后，去除上清液并用包含氨芐青霉素(50 μ g/ml)及卡那霉素(25 μ g/ml)的Iml的LB液體培養(yǎng)基重新對沉淀的細(xì)胞進(jìn)行懸浮，在30°C條件下，以200rpm的速度混合而培養(yǎng)一天。在10，000X g、20 分鐘及4°C條件下，對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，回收上清液后放入2%脫脂牛奶并將其用于噬菌體肽搜索。將 5μ g/ml 的 Fibronectin ED-B、VEGF、VCAMl、Nicotinic acetylcholine receptor (nAchR) >Human serum albumin 以及 MyD88 以每孑L 50 μ 1 的量放入至Ij 96 孑L ELISA 板的30個(gè)孔，將10 μ g/ml的BSA以每孔50 μ 1的量放入到30個(gè)孔并4°C條件下放置一天。 次日用0. PBST清洗3次上述全部孔，使用用PBS稀釋的2%脫脂牛奶在常溫條件下封阻2小時(shí)后，倒掉全部溶液并用0. 1% PBST清洗3次。將按照各個(gè)克隆增幅的噬菌體肽溶液分注到所有槽各100μ 1，在27°C條件下放置1小時(shí)30分鐘。使用0. 1% PBST溶液清洗 5次后，以1 1，000比例稀釋HRP-綴合物抗-Ml3抗體(GEHealthcare)并在27°C條件下反應(yīng)1小時(shí)。使用0. 1% PBST清洗5次后，分注TMB溶液100 μ 1而引發(fā)顯色反應(yīng)之后，添加100 μ 1的IM HCl而中止反應(yīng)。然后在450nm中測定吸光度，選擇相比BSA吸光度高的各克隆。將這些克隆的噬菌體感染至XLl細(xì)胞后進(jìn)行涂抹，使得每個(gè)板上存在100 200個(gè)噬斑。利用滅菌的吸頭將噬斑接種至細(xì)1的LB-氨芐青霉素(50yg/ml)培養(yǎng)液后，在37°C 條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)1天，利用質(zhì)粒提取試劑盒對質(zhì)粒進(jìn)行純化并委托測序(Genotech公司，大田，韓國)。測序引物使用作為載體順序的5' -GATTACGCCAAGCTTTGGAGC-3‘。實(shí)施例6纖維連接蛋白ED-B、VEGF, nAchR結(jié)合分析合成了特異于在DNA測序中重復(fù)出現(xiàn)的ED-B、VEGF, nAchR的雙齒肽結(jié)合物的肽 (Anyzen公司，韓國)。親和力的測定則采用了 BIAcore X(Biacore AB，烏普薩拉，瑞典)。ED-B與nAchR通過在鏈親和素SA芯片(Biacore)上滴落2，OOORU的生物素-EDB而進(jìn)行固定。VEGF利用EDC/NHS固定于CM5芯片(Biacore)。作為電泳緩沖液使用PBS (pH 7. 4)，流量為每分鐘滴落30 μ 1并采用各種濃度測定動力學(xué)之后，通過BIAevaluation軟件(Biacore AB，烏普薩拉，瑞典)計(jì)算親和力。實(shí)施例7特異于作為癌癥生物標(biāo)志物的纖維連接蛋白ED-B的雙齒肽結(jié)合物的癌癥靶向在50mM硼酸鈉緩沖液(pH 9. 7)中，在常溫條件下，使Cy5. 5-NHS熒光染料 (flurorescence dye) (Amersham Pharmacia, Piscataway)與對癌癥中分布較多的纖維連接蛋白ED-B進(jìn)行靶向的雙齒肽結(jié)合物(肽2)反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)后通過kphadex G25 (Pharmacia Biotech，烏普薩拉，瑞典)分離Cy5. 5和雙齒肽結(jié)合物_Cy5. 5。將Human U87MG (ATCC) 2xl06cell注入到Balb/c裸鼠的皮下組織并培養(yǎng)癌細(xì)胞10天之后，通過靜脈注射法注射0. 5nmol的雙齒肽結(jié)合物-Cy5. 5后，通過IVIS(Caliper Life Sience， Hopkinton)測定熒光。該實(shí)驗(yàn)說明特異于作為癌癥生物標(biāo)志物的纖維連接蛋白ED-B的雙齒肽結(jié)合物將蓄積在動物體內(nèi)的癌細(xì)胞，同時(shí)也表示作為實(shí)際癌癥診斷劑的應(yīng)用性(圖 11)。實(shí)施例8特異于細(xì)胞內(nèi)存在的MyD88的雙齒肽結(jié)合物的活性抑制實(shí)驗(yàn)由于MyD88是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，能夠利用雙齒肽結(jié)合物的Loop的賴氨酸 (lysine)殘基，并利用 EDC/NHS (Sigma)使作為細(xì)胞穿透肽(cell penetrating peptide) 的9個(gè)精氨酸(arginine) (Anyzen，韓國)與雙齒肽結(jié)合物進(jìn)行共價(jià)鍵合以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穿透。 由于MyD88的活性被激活時(shí)MMP-13的量將會增加，因而只要測定MMP-13的量就能夠判別 MyD88的活性是否被抑制。將用于激活MyD88活性的IL-Ibeta(10ng/ml) (R&D systems, Minneapolis MN)處理至軟骨細(xì)胞。然后將特異于MyD88的雙齒肽結(jié)合物(表3f的肽1)對軟骨細(xì)胞進(jìn)行10 μ M處理，經(jīng)過12小時(shí)后分離mRNA之后，對MMP-13和GAPDH進(jìn)行RT-PCR。 并且，破壞軟骨細(xì)胞而獲得細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)后，利用Anti-MMP 13抗體(Abcam，ab3208, Cambridge)禾口半干 transfer 器械(Amersham Bioscience, Piscataway)實(shí)施免疫印跡法而測定MMP-13的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例9雙齒肽結(jié)合物文庫的制造作為雙齒肽結(jié)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)采用穩(wěn)定的發(fā)夾基序。特別采用在色氨酸-色氨酸氨基酸的相互作用下能夠確保β-發(fā)夾基序結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的色氨酸拉鏈(Andrea et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 98 :5578-5583 (2001))。在作為骨架的色氨酸拉鏈的 N-及 C-末端部分隨機(jī)排列各6個(gè)氨基酸，從而在兩個(gè)部分生成可變區(qū)(圖la)。將它命名為雙齒肽結(jié)合物，由于兩邊具有可變區(qū)，能夠協(xié)同地結(jié)合于抗原，因而具有高親和力及特異性。并且，如圖Ib至圖Ie所示，雙齒肽結(jié)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)能夠構(gòu)成為各種結(jié)構(gòu)。將合成的2個(gè)隨機(jī)序列寡核苷酸通過PCR反應(yīng)作成雙鏈后，用作為限制酶的SfiI 及NotI切割后，將其克隆至pIGT2噬菌體載體而構(gòu)建8 X IO8以上的文庫(圖2)。實(shí)施例10生物淘選結(jié)果關(guān)于雙齒肽結(jié)合物文庫，對纖維連接蛋白ED-B、VEGF、VCAMl、nAchR、HSA蛋白質(zhì)實(shí)施3-5輪的生物淘選并決定在各個(gè)淘選步驟中回收的各噬菌體肽的輸出的噬菌體/輸入的噬菌體比例(表la)。表la針對纖維連接蛋白ED-B蛋白質(zhì)的生物淘選結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種與靶結(jié)合的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，包含如下步驟(a)提供一種雙齒肽結(jié)合物的文庫的步驟，上述雙齒肽結(jié)合物包含(i)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)，其包含形成有鏈間非共價(jià)鍵的平行線、反平行線或平行和反平行氨基酸鏈，以及(ii) 靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)II，與上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩個(gè)末端結(jié)合，并包含隨機(jī)選擇的各η及 m個(gè)氨基酸；(b)使上述文庫和靶接觸的步驟；以及(c)選擇與上述靶結(jié)合的雙齒肽結(jié)合物的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，形成于上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的鏈間非共價(jià)鍵是氫鍵、靜電相互作用、疏水性相互作用、范德瓦爾斯相互作用、 n-n相互作用、陽離子-η相互作用或它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的各氨基酸鏈通過連接物相連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)為發(fā)夾、通過連接物連接的折疊、亮氨酸拉鏈、通過連接物連接的亮氨酸拉鏈、富亮氨酸基序或通過連接物連接的富亮氨酸基序。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)為β-發(fā)夾。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述β-發(fā)夾包含選自由序列目錄第1序列至第19序列構(gòu)成的組的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述β-發(fā)夾包含選自序列目錄第2序列、第14序列或第18序列的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述β-發(fā)夾以如下的通式I表示通式IX1-Trp (X2) X3-X4-X5 (X ‘ 2) X6-X7X1 為 Ser 或 Gly-GlujX2 及 X' 2 相互獨(dú)立地為 Thr、His、Val、Ile、Phe 或 Tyr5X3 為 Trp 或TyrJ4S I型、Γ型、II型、II'型或III型或III'型換向序列，&為Trp或Wie，& 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述β-發(fā)夾以如下的通式II表示通式IIX1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4X1SArgjly-Glu 或 Lys-LysJ2 SGln 或 ThrJ3* I 型、I'型、II 型、ΙΓ 型或 III 型或III'型換向序列，X4為Gin、Thr-Glu或Gln-Glu0
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述β-發(fā)夾以如下的通式III表示通式IIIX1-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7X1 為 Lys 或 Lys-Lys, X2 為 Trp 或 Tyr, X3 為 Val 或 Thr，X4 為 I 型、I'型、II 型、II'型或111型或ΙΙΓ型換向序列，&為Trp或Ala，&為Trp或Val，X7為Glu或Gln-Glu。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述β-發(fā)夾以如下的通式IV表示通式IVX1-X2-X3-Trp-X4X1為Lys-Thr或Gly，X2為Trp或Tyr，&為I型、Γ型、II型、II ‘型或III型或 Iir型換向序列，)(4為Thr-Glu或Gly。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述β-發(fā)夾在上述通式I中&為Ser或Gly-Glu，I2IV 2相互獨(dú)立地為Thr、His或Val，X3為Trp或 TyrJ4為I型、Γ型、II型或ΙΓ型序列，&為Trp或Phe，&為Trp或Val，X7為Lys或 Thr-Glu0
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述靶結(jié)合區(qū)I的氨基酸數(shù)量η為2-20。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述靶結(jié)合區(qū)II的氨基酸數(shù)量m為2-20。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述文庫由質(zhì)粒、 細(xì)菌噬菌體、噬菌粒、酵母或細(xì)菌制造而成。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)II協(xié)同作用于靶而進(jìn)行結(jié)合。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，在上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)、靶結(jié)合區(qū)I或靶結(jié)合區(qū)II追加結(jié)合有功能性分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述功能性分子為產(chǎn)生能夠檢測的信號的標(biāo)記物、化學(xué)藥物、生物藥物、細(xì)胞穿透肽(CPP)或納米粒子。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙齒肽結(jié)合物的制造方法，其特征在于，上述靶為生化物質(zhì)、肽、多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞、組織、化合物、金屬或非金屬物質(zhì)。
20.一種雙齒肽結(jié)合物，特異性地與靶結(jié)合，其特征在于，該雙齒肽結(jié)合物具有(a)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)，其包含形成有鏈間非共價(jià)鍵的平行線、反平行線或平行和反平行氨基酸鏈；以及(b)靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)II，與上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩個(gè)末端結(jié)合，并包含隨機(jī)選擇的各η及m個(gè)氨基酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，形成于上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的鏈間非共價(jià)鍵是氫鍵、靜電相互作用、疏水性相互作用、范德瓦爾斯相互作用、η-η相互作用、陽離子-η相互作用或它們的組合。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的各氨基酸鏈通過連接物相連接。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)為β-發(fā)夾、通過連接物連接的β -折疊、亮氨酸拉鏈或通過連接物連接的亮氨酸拉鏈、富亮氨酸基序。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)為β-發(fā)夾。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述發(fā)夾選自由序列目錄第1序列至第19序列構(gòu)成的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述β-發(fā)夾選自序列目錄第 2序列、第14序列或第18序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求M所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述發(fā)夾以如下的通式I 表不通式IX1-Trp (X2) X3-X4-X5 (X ‘ 2) X6-X7X1 為 Ser 或 Gly-GlujX2 及 X' 2 相互獨(dú)立地為 Thr、His、Val、Ile、Phe 或 Tyr5X3 為 Trp 或Tyrj4S I型、Γ型、II型、II'型或III型或III'型換向序列，&為Trp或Wie，& 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。
28.根據(jù)權(quán)利要求M所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述發(fā)夾以如下的通式 II表示通式IIX1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4X1SArgjly-Glu 或 Lys-LysJ2 SGln 或 ThrJ3* I 型、I'型、II 型、ΙΓ 型或 III 型或III'型換向序列，X4為Gin、Thr-Glu或Gln-Glu0
29.根據(jù)權(quán)利要求M所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述發(fā)夾以如下的通式 III表示通式IIIX1-X2-X3-T Tp-X4-X5-Thr-X6-X7X1 為 Lys 或 Lys-Lys, X2 為 Trp 或 Tyr, X3 為 Val 或 Thr，X4 為 I 型、I'型、II 型、II' 型或111型或ΙΙΓ型換向序列，&為Trp或Ala，&為Trp或Val，X7為Glu或Gln-Glu。
30.根據(jù)權(quán)利要求M所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述發(fā)夾以如下的通式 IV表示通式IVX1-X2-X3-Trp-X4X1為Lys-Thr或Gly，X2為Trp或Tyr，&為I型、Γ型、II型、II ‘型或III型或 Iir型換向序列，)(4為Thr-Glu或Gly。
31.根據(jù)權(quán)利要求25所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述β-發(fā)夾在上述通式I中 X1為Ser或Gly-GlujX2及X' 2相互獨(dú)立地為Thr,His或Val，X3為Trp或Tyr5X4為I型、 I'型、II 型或 ΙΓ 型序列，& STrp 或 Phe J6 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。
32.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述靶結(jié)合區(qū)I的氨基酸數(shù)量 η 為 2-20。
33.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述靶結(jié)合區(qū)II的氨基酸數(shù)量m為2-20。
34.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū) II協(xié)同作用于靶而進(jìn)行結(jié)合。
35.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，在上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)、靶結(jié)合區(qū)I或靶結(jié)合區(qū)II追加結(jié)合有功能性分子。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述功能性分子為產(chǎn)生能夠檢測的信號的標(biāo)記物、化學(xué)藥物、生物藥物、細(xì)胞穿透肽(CPP)或納米粒子。
37.根據(jù)權(quán)利要求20所述的雙齒肽結(jié)合物，其特征在于，上述靶為生化物質(zhì)、肽、多肽、 核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞、組織、化合物、金屬或非金屬物質(zhì)。
38.一種核酸分子，其特征在于，對上述權(quán)利要求20至37中任一項(xiàng)的雙齒肽結(jié)合物進(jìn)行編碼。
39.一種雙齒肽結(jié)合物的表達(dá)用載體，其特征在于，包含上述權(quán)利要求38的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異性地與靶結(jié)合的雙齒肽結(jié)合物及其制造方法，上述靶包含(a)形成鏈間非共價(jià)鍵的平行、反平行或平行和反平行氨基酸鏈的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)；以及(b)結(jié)合至上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化區(qū)的兩個(gè)末端，并包含隨機(jī)選擇的各n及m個(gè)氨基酸的靶結(jié)合區(qū)I及靶結(jié)合區(qū)II。本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物表現(xiàn)出極低水平(例如nM水平)的KD值(解離常數(shù))，對靶表現(xiàn)出十分高的親和力。本發(fā)明的雙齒肽結(jié)合物不僅具有醫(yī)藥用途，還能用于體內(nèi)分子成像、體外細(xì)胞成像以及藥物傳遞用靶向，并且用作保護(hù)分子也非常有效。
文檔編號C07K7/00GK102224162SQ200980146415
公開日2011年10月19日 申請日期2009年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月20日
發(fā)明者全相镕, 樸世湖, 金成鉉 申請人:光州科學(xué)技術(shù)院