一種能夠與TfR1特異性結(jié)合的活性肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于一種生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種能夠與TfRl特異性結(jié)合的活性肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)鐵蛋白又名運(yùn)鐵蛋白transferrin, TRF, siderophilin)是血衆(zhòng)中主要的含鐵蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)運(yùn)載由消化管吸收的鐵和由紅細(xì)胞降解釋放的鐵。以TRF-Fe3+的復(fù)合物形式進(jìn)入骨髓中，供成熟紅細(xì)胞的生成。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrinreceptor, TfR)是機(jī)體介導(dǎo)鐵代謝的重要蛋白質(zhì)分子，在鐵的運(yùn)輸、轉(zhuǎn)化和利用中起著關(guān)鍵作用。近年來隨著對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)一步的研究后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)鐵蛋白及其受體除運(yùn)輸鐵的功能外，還與細(xì)胞生長和增殖及其腫瘤細(xì)胞的代謝有關(guān)。目前已知兩種不同類型的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體即轉(zhuǎn)鐵蛋白受體I (TfRl)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2( TfR2)。
[0003]TfRl在許多細(xì)胞中都表達(dá)，如紅血細(xì)胞、肝細(xì)胞、單核細(xì)胞和血腦屏障。TfRl是一種II型跨膜糖蛋白，是由同源二聚體(ISOkDa)的兩個亞基通過兩條二硫鍵交聯(lián)而成。每個單體含760個氨基酸，分子量為90?95kDa，包含一個大的胞外C端區(qū)域￠71個氨基酸)，一個單跨膜區(qū)域(28個氨基酸)及一個短的N端區(qū)域(61個氨基酸)。C端區(qū)域是一個外功能區(qū)，它包含轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的結(jié)合位點(diǎn)，3個N連接糖基化位點(diǎn)及一個O連接糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的糖基化作用是TfRl功能所必需的。TfRl能夠根據(jù)環(huán)境pH的變化而改變構(gòu)像，并把構(gòu)像變化結(jié)果轉(zhuǎn)換為對轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合力強(qiáng)弱的變化。
[0004]TfR2是一種II型跨膜糖蛋白，是Kawa-bata從Tf細(xì)胞和HL-60細(xì)胞cDNA文庫中克隆出的TfRl同源基因，同TfRl有45%的相同序列，胞外區(qū)域同TfRl有66%的相似性，但TfR2與轉(zhuǎn)鐵蛋白的親和性較低，比TfRl低25倍。TfR2主要在肝臟表達(dá)，其mRNA編碼和非編碼區(qū)域缺乏調(diào)控鐵離子成分，這就表明TfR2的表達(dá)不是由鐵離子響應(yīng)蛋白反饋機(jī)制來調(diào)控的。
[0005]研究顯示鼻咽癌、胃癌、肝癌、血液系統(tǒng)腫瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞與它們的正常組織相比，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體呈現(xiàn)高表達(dá)情況，并且轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)常常與細(xì)胞增殖活動有關(guān)。胃癌患者血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平較良性胃病病人及正常人明顯增高，同時II1、IV期腫瘤病人的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體也明顯高于1、II期腫瘤病人。說明轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)增加使腫瘤細(xì)胞獲得了異常的增殖活性。此外，轉(zhuǎn)鐵蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體系統(tǒng)可通過胞吞作用提高生理屏障如腸道黏膜、血腦屏障對藥物的通透性。血腦屏障的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體被認(rèn)為幾乎完全被轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和，轉(zhuǎn)鐵蛋白作為藥物腦靶向載體受到限制。然而，由于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合位點(diǎn)不同，且不相互干擾，因而可采用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體進(jìn)行藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。偶聯(lián)有藥物的抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體(0X26)可由轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)內(nèi)吞，跨過血腦屏障進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，并且0X26顯示出較強(qiáng)的進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力。
[0006]由于小分子多肽結(jié)構(gòu)簡單穿透腫瘤組織的能力強(qiáng)，且不易被免疫系統(tǒng)所排斥，因此尋找能夠與TfRl特異性結(jié)合的活性小肽可以以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為靶點(diǎn)開發(fā)新的腫瘤靶向藥物，進(jìn)行腦源性疾病的靶向治療，并且對以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為目標(biāo)的腫瘤發(fā)生發(fā)展的預(yù)測、診斷具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種能夠與TfRl特異性結(jié)合的活性肽及其應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明具體技術(shù)方案如下:
一種能夠與TfRl特異性結(jié)合的活性肽CPU-312-01，氨基酸序列為NRAHSLH (SEQ IDNO:1)，分子量為 1193.5Da。
[0009]可采用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法對本發(fā)明所述活性肽進(jìn)行修飾。多肽類藥物常用修飾方法包括主鏈末端的修飾、中間殘基的修飾、環(huán)化、氨基酸替換、糖基化修飾及PEG修飾坐寸ο
[0010]例如多肽類藥物常用的主鏈末端修飾方法是N端的乙?；饔煤虲端的酰胺化作用，分別對肽鏈兩端氨基和羧基進(jìn)行保護(hù)，使多肽不會很快地被相應(yīng)的多肽蛋白酶降解。目前這一技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多肽的化學(xué)合成中。N端乙?；ǔＪ窃诠滔嗪铣啥嚯姆磻?yīng)的整個肽鏈組合完畢后，加入乙酸酐使其乙?；端的酰胺化則是通過選擇裂解產(chǎn)物為酰胺的樹脂或者選擇不同裂解方式來完成。主鏈末端連接不同長度的脂肪酸、主鏈C端或N端的PEG修飾及糖基化修飾，其基本原理都是增加多肽分子的相對分子量和空間位阻，提高其對多肽水解酶的穩(wěn)定性，減少腎小球的濾過作用。替換肽鏈中的某幾個氨基酸是另一種推遲酶降解使多肽藥物的半衰期延長的方式，替換對象通常為肽鏈中的易酶解的氨基酸。此外，將L型氨基酸替換為D型非天然氨基酸也是氨基酸替換的一種常規(guī)方法。
[0011]本發(fā)明還提供了上述活性肽的修飾肽，對活性肽進(jìn)行修飾，在活性肽的N端、C端或中間殘基上連接化學(xué)基團(tuán)、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)或PEG。
[0012]本發(fā)明還提供了上述活性肽的修飾肽，將所述活性肽序列中的一種或多種氨基酸替換成相應(yīng)的氨基酸衍生物或特殊氨基酸。
[0013]本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明所述與TfRl特異性結(jié)合的活性肽的基因，具有如SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
[0014]本發(fā)明所述的與TfRl特異性結(jié)合的活性肽或其修飾肽可以用于制備靶向腫瘤藥物。進(jìn)一步的，所述腫瘤為肝癌或乳腺癌。
[0015]本發(fā)明所述的與TfRl特異性結(jié)合的活性肽或其修飾肽可以用于制備透血腦屏障藥物。
[0016]本發(fā)明所述的與TfRl特異性結(jié)合的活性肽或其修飾肽可以用在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的檢測。
[0017]本發(fā)明所述轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合肽通過噬菌體展示技術(shù)獲得。噬菌體展示技術(shù)由Smith于1985年創(chuàng)建，以改構(gòu)的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因區(qū)，使外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)并展示于噬菌體表面，進(jìn)而通過親和富集法表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體。其建立基于三點(diǎn):(1)在PlII和pVDI衣殼蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面，不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時保持外源基因天然構(gòu)象，也能被相應(yīng)的抗體或受體所識別；(2)利用固定與固相支持物的靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒?，洗去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目的噬菌體；(3)外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導(dǎo)出來。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的轉(zhuǎn)換，已越來越廣泛地用于抗原表位分析、蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)分析、酶作用底物的分析、尋找具有生物功能的蛋白的模擬肽、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、分離與鑒定疾病特異性抗原模擬肽、篩選細(xì)胞和器官特異性結(jié)合肽、研究蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合特性、定位信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等。
[0018]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明所述轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合肽通過噬菌體展示技術(shù)獲得，是全新序列。易于通過生物及化學(xué)方法合成構(gòu)建。生物信息學(xué)技術(shù)表明該結(jié)合肽能與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，體外實(shí)驗(yàn)表明該結(jié)合肽能與高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)胞結(jié)合，并能將耦連的異硫氰酸熒光素(FITC)轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，可用來作為藥物載體以及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的檢測。因此本發(fā)明所述的結(jié)合肽可用于以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為靶點(diǎn)的腫瘤靶向藥物的開發(fā)，腦源性疾病的靶向治療，并且對以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為目標(biāo)的腫瘤發(fā)生發(fā)展的預(yù)測、診斷具有重要意義。
【附圖說明】
[0019]圖1是熒光酶標(biāo)儀檢測HepG2細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽和FITC的攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0020]圖2是熒光酶標(biāo)儀檢測H印G2細(xì)胞和L02細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0021]圖3是是熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽的吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0022]圖4是熒光顯微鏡觀察IfepG2細(xì)胞對FITC的吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下通過實(shí)施例說明本發(fā)明的具體步驟，但不受實(shí)施例限制。
[0024]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0026]在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0027]以下實(shí)施例所用材料和儀器設(shè)備為:
實(shí)施材料:大腸桿菌ER2738(美國New England B1labs公司)、噬菌體隨機(jī)7肽庫(美國New England B1labs公司)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受:體(德國CalB1chem公司)、HRP_M13抗體(GEHealthcare公司)、RPMI_1640 (Gibco公司)、小牛血清(Gibco公司)、膜蛋白酶(Gibco公司)。
[0028]實(shí)施例1
通過噬菌體展示的方法，得到轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合肽CPU-312-01:
(I)通過噬菌體隨機(jī)肽庫的篩選，得到轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合肽CPU-312-01的核苷酸序列:
A.噬菌體隨機(jī)7肽庫的生物淘洗:用包被液(0.1 M NaHC03, pH 8.6)將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體稀釋至100 μ g/ml,加入150ul至酶標(biāo)板的一個孔中，反復(fù)旋轉(zhuǎn)直到表面完全濕潤，保持濕潤狀態(tài)，4°C過夜。倒掉包被液，拍板除去殘液，加滿封閉液(0.1 M NaHC03, pH 8.6,5 mg/ml BSA)，4°C至少作用一個小時。倒出封閉液，用 0.1%TBST[TBS + 0.1% (v/v)Tween-20]洗6次，每次拍板。用100 μ I TBST稀釋10 μ I原始噬菌體肽庫，加入用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體包被的孔中，室溫溫育I小時，傾倒未結(jié)合的噬菌體，用0.P/oTBST沖洗10次，每次拍板。然后加入100 μ I洗脫液[0.2Μ Glycine-HCl (ph2.2)，lmg/mLBSA]室溫輕微震蕩15min，吸出洗脫液，再用15 μ I的IM Tris-HCL中和上述洗脫液。吸取I μ I已中和的洗脫液測定滴度，其余液體加入20mlLB培養(yǎng)基(含20 μ I四環(huán)素+200 μ I過夜培養(yǎng)