專利名稱：重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體、其編碼基因、其制備和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一類重組多肽及其編碼基因，尤其涉及一類具有抑制凝血因子Xa(Factor Xa，F(xiàn)Xa)活性的重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體(rAcAP5m)以及編碼該重組多肽的基因。此外，本發(fā)明還涉及該重組多肽的制備，包括該重組多肽表達載體的構(gòu)建，將所構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，誘導重組多肽的表達并對所表達的多肽進行純化；本發(fā)明另外還涉及該重組多肽在治療血栓性疾病中的應用，屬于生物技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
各種原因所引起的血管損傷會啟動凝血反應，正常情況下血液凝固可防止進一步出血，但在許多病理條件下，過度的凝血會導致血栓形成，從而引發(fā)一系列血栓栓塞性疾病。凝血反應是一系列放大的級聯(lián)反應，在反應過程中血漿中的多種絲氨酸蛋白酶被水解激活。凝反應可導致形成由纖維蛋白和細胞成分所構(gòu)成的不溶物，從而進一步形成血栓(Mann，K.G.，Nesheim，M.E.，Church，W.R.，Haley，P.and Krishnaswamy，S.(1990)Blood 761-16.and Lawson，J.H.，Kalafatis，M.，Stram，S.，and Mann，K.G.(1994)J.Biol.Chem.26923357-23366)。
FXa是內(nèi)源性和外源性凝血途徑的交匯點，它是一種絲氨酸蛋白酶，可裂解凝血酶原生成凝血酶。FXa是凝血酶原酶復合物的重要組成部分，它在鈣離子存在下，與輔因子FVa在活化的血小板膜磷脂表面形成凝血酶原酶復合物。游離的FXa的催化活性是很低的，但是一旦形成凝血酶原酶復合物，F(xiàn)Xa的活性會顯著提高。凝血酶原被快速的裂解，大量的凝血酶在血管損傷部位聚集，最終形成血栓(Fuster，V.，Badimon，L.，Badimon，J.J.and Chesebro，J.H.(1992)New Engl.J.Med.326310-318)。
抗凝血藥物是血栓性疾病的治療和預防中的重要藥物(Kessler，C.M.(1991)Chest9997S-112S and Cairns，J.A.，Hirsh，J.，Lewis，H.D.，Resnekov，L.，and Theroux，P.(1992)Chest 10456S-481S)。但現(xiàn)有抗凝劑如肝素類、直接凝血酶抑制劑，在使用過程中均表現(xiàn)出嚴重的出血等副反應，限制了它們的應用。因此臨床上迫切需要新的、更有效的、副作用更小的抗凝血藥。FXa抑制劑可抑制凝血酶的生成從而抑制凝血，由于它不抑制已生成的凝血酶的活性因而極少引起出血副反應，一分子的FXa可催化生成大于1000分子的凝血酶，也就是說，血液中的FXa濃度較凝血酶低1000倍以上，F(xiàn)Xa抑制劑發(fā)揮藥效時的血藥濃度較凝血酶抑制劑低得多。因此抑制FXa比抑制凝血酶產(chǎn)生的抗凝效果更好，出血及其它副作用更小，故FXa抑制劑已成為抗凝血藥物研究的熱點。嗜血動物如蜱、蝙蝠、水蛭、線蟲、人虱等它們的唾液中都含有不同的具有克服宿主正常止血功能的物質(zhì)來幫助它們吸食血液。因此可從它們唾液中提取特異性FXa抑制劑(K.Y.MUMCUOGLU(1999)J.Insect Physilol 421083-1087)。
犬鉤蟲抗凝肽5(Ancylostoma caninum anticoagulant peptide，AcAP5)是從食血成年鉤蟲，犬鉤口線蟲(Ancylostoma caninum)可溶性提取物中分離出來的一種肽類FXa抑制劑，由77個氨基酸組成，分子量8.7KD，已獲得其重組產(chǎn)物rAcAP5。AcAP5是迄今為止報道的活性最強的多肽類特異性FXa抑制劑，能夠抑制動脈、靜脈血栓的形成(United States Patent5,427,937、6,534,629 et al.)。在犬冠狀動脈血栓模型中，僅皮下給藥一次就可維持藥效6小時，與其它蛋白類FXa抑制劑相比，AcAP5的一個突出優(yōu)點就是給藥方便和作用持續(xù)時間長(Sam S.Rebello，Howard S.(2000)Thrombosis Research98531-540)。但AcAP5的分子量略為偏大(分子量8.7KD)，臨床應用時，可能需要較大用量方能達到有效量，由此而來的結(jié)果可能會使其免疫原性提高，引發(fā)一系列不良反應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一類新的重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體(recombinant Ancylostoma caninum anticoagulant peptide 5 mutants，rAcAP5m)，該重組多肽抑制FXa活性或抗血栓活性與rAcAP5相當，但其分子量較原AcAP5要低，作為藥用則可減少外源蛋白的給予量，從而可能降低由于外源蛋白的進入而引發(fā)機體的一系列不良反應。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一類重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體(rAcAP5m)，其含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或
(b)將SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有抑制FXa活性或抗血栓活性或功能的多肽衍生物。
優(yōu)選的，本發(fā)明重組多肽rAcAP5m具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，由54個氨基酸組成，分子量為6.1KD，包含8個半胱氨酸殘基，與rAcAP5相比，本發(fā)明重組多肽rAcAP5m刪去了20余個氨基酸，分子量減小超過了1/4，降低了免疫原性，而體外抑制FXa活性和體內(nèi)抗血栓活性與rAcAP5相當(見試驗例1和2)，因此若作為藥用則可減少外源蛋白的給予量，從而可能降低由于外源蛋白的進入而引發(fā)機體的一系列不良反應。由于這些優(yōu)點，本發(fā)明重組多肽rAcAP5m有希望成為一類新型的治療血栓栓塞性疾病的藥物。
本文中，所述的“多個”通常意味著2～8個，優(yōu)選為2～4個，這些取決于犬鉤蟲抗凝肽5突變體三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的“替換”是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基；所述的“缺失”是指氨基酸序列的改變，其中分別缺少一個或多個氨基酸殘基；所述的“插入”是指氨基酸序列的改變，相對天然分子而言，所述改變導致添加一個或多個氨基酸殘基。
根據(jù)相關實驗資料的分析研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基礎上進行點突變產(chǎn)生的系列多肽，會增強多肽分子與FXa的結(jié)合能力和生物活性。因為突變后序列增加了與人凝血酶原(FXa的內(nèi)源性底物)活性部位氨基酸序列的相似性。例如，可以在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基礎上進行以下突變而產(chǎn)生出仍具有抑制FXa活性或抗血栓活性或功能的系列多肽將第3位的Try缺失掉；或?qū)⒌?2位的Leu替換為Glu；或?qū)⒌?3位的Pro替換為Asp；或同時分別將第22位的Leu替換為Glu、第23位的Pro替換為Asp；或?qū)⒌?1位的Phe替換為Ser。所以在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基礎上所進行的替換、缺失或插入而獲得的仍具有抑制FXa活性和抗血栓活性多肽衍生物應包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種編碼rAcAP5m的cDNA序列。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種編碼rAcAP5m的cDNA序列，該cDNA序列具有以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(b)在嚴謹條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列，且該核苷酸序列編碼具有抑制FXa活性或抗血栓活性的多肽；或(c)編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有抑制FXa活性或抗血栓活性的多肽衍生物的核苷酸序列(例如具有如SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示的核苷酸序列)，該多肽衍生物通過將SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。
優(yōu)選的，本發(fā)明編碼rAcAP5m的cDNA序列具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
所述的“嚴謹條件”是指雜交液為5～6×SSC，42～75℃雜交過夜，室溫至37℃用2×SSC洗滌一至兩次，優(yōu)選的，所述的“嚴謹條件”為雜交液為6×SSC，68℃雜交過夜，37℃用2×SSC洗滌兩次。
本發(fā)明所述的cDNA可通過以下方法制備得到(a)根據(jù)蛋白的氨基酸序列及酵母對密碼子的偏愛性設計cDNA分子的核苷酸序列；(b)利用化學合成的方法合成該cDNA分子。
本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建含有本發(fā)明編碼rAcAP5m重組表達載體的方法。
本發(fā)明重組表達載體可通過本領域的常規(guī)方法構(gòu)建而成，即將SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使SEQ ID NO1所示的核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的5′端引入SEQ.ID.NO8和SEQ.ID.NO9所示的核苷酸序列；再將該融合序列插入到質(zhì)粒pPIC9K上的EcoRI和NotI限制性酶切位點之間，使該序列位于AOX1啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達載體pPIC9K-rAcAP5m。
本發(fā)明所構(gòu)建的重組酵母表達載體可通過常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化宿主細胞，所述的宿主細胞可為畢赤酵母細胞(Pichic pastoris)、啤酒酵母細胞(Saccharomyces cerevisiae)或乳酸酵母細胞(Hansenula polymorpha)。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將重組酵母表達載體pPIC9K-rAcAP5m轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞(Pichic pastoris)GS115，得到重組酵母細胞。
本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是提供一種制備rAcAP5m的方法。
本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種制備rAcAP5m的方法，包括以下步驟培養(yǎng)用本發(fā)明表達載體所轉(zhuǎn)化的宿主細胞，誘導rAcAP5m的表達，回收并純化所表達的rAcAP5m。
上述制備rAcAP5m的方法中，優(yōu)選的，所述的重組表達載體是酵母表達載體pPIC9K-rAcAP5m；所述的宿主細胞是畢赤酵母細胞(Pichic pastoris)GS115；所述的誘導方法為用甲醇誘導rAcAP5m的表達；所述的純化方法包括以下步驟(a)利用NTA-Ni2+親和層析純化重組產(chǎn)物；(b)純化后腸激酶切去N末端的6×His標簽。
本發(fā)明分別通過體內(nèi)和體外的試驗分別對本發(fā)明重組多肽rAcAP5m的抑制FXa的活性和抗血栓活性進行了測定(a)在體外，利用發(fā)色底物Spectrozyme FXa的方法，測定本發(fā)明重組多肽rAcAP5m對FXa的抑制作用；(b)在體內(nèi)，利用小鼠下腔靜脈結(jié)扎，造成下腔靜脈血栓模型，皮下給予該重組多肽來評價其抗靜脈血栓的作用。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明重組多肽rAcAP5m的體外抑制FXa活性和體內(nèi)抗血栓活性與rAcAP5相當，有希望成為一類新型的治療血栓栓塞性疾病的藥物。
本發(fā)明重組多肽rAcAP5m的用藥量取決于具體劑型，以及病人的年齡、體重、健康狀況等因素。作為指導皮下注射時，成人的用量為0.145mg/kg體重。


圖1為質(zhì)粒pPIC9K的圖譜。pPIC9K含有9726個核苷酸。含有942bp長的AOX1基因啟動子5′PAOX1，用于甲醇誘導的外源基因的高水平表達，其來源于AOX1基因的轉(zhuǎn)錄終止序列(TT)，用于外源基因的mRNA的終止與polyA化，3′AOX1序列來源于AOX1基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)3′下游，在質(zhì)粒載體與宿主菌基因組同源整合時是必需的；還含有296bp的α-Factor信號肽序列，編碼分泌所需的信號肽。在多克隆位點上有10個單一酶切序列的位點，以插入外源基因，其中Not I，Bgl II，Sal I，Sac I單酶切位點用于線性化質(zhì)粒，從而進行同源重組，產(chǎn)生Mut+或Mut-重組子；含有HIS4，為Pichia Pastoris的野生型基因，編碼組氨酸脫氫酶(約2200bp)，用于互補Pichia Pastoris His4-菌株，為重組菌選擇標記；所含ColE1復制起點和氨芐抗性基因(Apr)可以使質(zhì)粒在細菌中復制與傳代，并產(chǎn)生氨芐抗性。
圖2為載體構(gòu)建示意圖。本發(fā)明cDNA與pPIC9K經(jīng)EcoRI/NotI雙酶切后，由T4DNA連接酶連接，將cDNA序列插入質(zhì)粒中的“S”與“3′AOX1”之間。
圖3為測序圖譜，其中384-545個核苷酸為蛋白的編碼序列。
圖4為0.8％瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1空泳道；泳道2DNA分子量標準(564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6507bp、9416bp、23130bp)；泳道3質(zhì)粒pPIC9K-rAcAP5m(9.52kb)；泳道4經(jīng)Sac I單酶切后的pPIC9K-rAcAP5m。
圖5為表達產(chǎn)物經(jīng)15％SDS-PAGE電泳圖。泳道1蛋白質(zhì)分子量標準(6.5KD，14.2KD，20KD，24KD，29KD，36KD，45KD，66KD)；泳道2和4GS115/pPIC9K表達培養(yǎng)液上清；泳道3GS115/pPIC9K-rAcAP5m表達培養(yǎng)液上清，在7.6KD處有一明顯條帶(此為融合蛋白的分子量6.1KD+1.5KD)。
圖6為Bradford法檢測蛋白含量的標準曲線。以牛血清白蛋白(BSA)濃度(mg/ml)為縱坐標，595nm處吸光值(OD595)為橫坐標做曲線。
圖7為不同濃度的本發(fā)明重組多肽rAcAP5m對FXa活性的抑制百分率對數(shù)曲線。以濃度為橫坐標，抑制百分率為縱坐標做曲線。
圖8為不同濃度的rAcAP5對FXa活性的抑制百分率對數(shù)曲線。以濃度為橫坐標，抑制百分率為縱坐標做曲線。
以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。
具體實施例方式
說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。
實施例1 編碼rAcAP5m的cDNA分子的合成一.引物設計，引物序列如下GAATTCCACCACCACCACCACCACGGTGGTGACGACGACGACAAGAAGGCTTACCCAGA[SEQ.ID.NO10]GGACACTCGTTCTCACCACACTCTGGGTAAGCCTTCTTGTCG[SEQ.ID.NO1]
GTGTGGTGAGAACGAGTGTCCAATCTGTAGAAGTAGAGGTTGTTTGT[SEQ.ID.NO12]CAGACACAAGCTGGTGGCAACAAACAACCTCTACTTCTACAGATT[SEQ.ID.NO13]TGCCACCAGCTTGTGTCTGTAAGGACGGTTTCTACAGAGACA[SEQ.ID.NO14]GACACAGTCACCGATGACGGTGTCTCTGTAGAAACCGTCCTTA[SEQ.ID.NO15]CCGTCATCGGTGACTGTGTCAGAGAGGAGGAGTGTGACCAG[SEQ.ID.NO16]GCGGCCGCTCATCAGACATGGATGATCTCATGCTGGTCACACTCCTCCTCTCT[SEQ.ID.NO17]二.合成引物三.實驗室合成1.把引物用去離子水稀釋成相同的濃度(5pmol/ul)；2.引物混合PCR(引物各1ul混合)混合引物 8ul10×PCR緩沖液2ulH2O 8uldNTP 1ul酶 1ulV20ul在PCR擴增條件為94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，25個循環(huán)。
3.電泳檢測回收目的條帶。
實施例2 表達載體的構(gòu)建1、pPIC9k載體(購自invitrogen公司)和目的片段(實施例1所合成的cDNA)用EcoRI/NotI進行雙酶切。
2、T4DNA連接酶連接連接示意圖見圖2。
3、轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨芐培養(yǎng)基篩選陽性克隆。
4、培養(yǎng)陽性克隆。
5、提取、純化質(zhì)粒。
6、以5′AOX1(5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)[SEQ.ID.NO.18]和3′AOX1(5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)[SEQ.ID.NO.19]為測序引物進行基因測序(測序結(jié)果見圖3)，測序結(jié)果表明，含有目的片段的重組表達載體已構(gòu)建成功，將該重組表達載體命名為pPIC9K-rAcAP5m。以上各操作方法參見《分子克隆實驗指南》(第三版)，J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著。
實施例3 化學法將重組表達載體轉(zhuǎn)化入表達宿主畢赤酵母GS115中1、試劑的配制(注所用試劑均需滅菌處理高壓滅菌或過濾除菌)YPD培養(yǎng)基1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。
(1)稱取10g酵母提取物，20g蛋白胨溶于900ml去離子水中(固體培養(yǎng)基再加入20g瓊脂粉)；(2)高壓滅菌20分鐘；(3)代冷卻至60℃時加入20％葡萄糖溶液100ml。
MD酵母基本氮源(YNB)1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖2％。
(1)高壓滅菌800ml水；(2)待冷卻后加入100ml 13.4％YNB、2ml 0.02％生物素、20％葡萄糖溶液100ml；(3)若配制固體培養(yǎng)基在第(1)步中加入15g瓊脂粉。
MM酵母基本氮源(YNB)1.34％，生物素4×10-5％，甲醇0.5％。
(1)高壓滅菌800ml水；(2)代冷卻后加入100ml 13.4％YNB、2ml 0.02％生物素、5％甲醇溶液100ml；(3)若配制固體培養(yǎng)基在第(1)步中加入15g瓊脂粉。
SCED(1M山梨醇、10mM檸檬酸鈉，PH7.5、10mM EDTA，10mM DTT)。
2、轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的線性化轉(zhuǎn)入酵母的質(zhì)粒DNA必須線性化，否則需要十倍量的DNA才能達到預期轉(zhuǎn)化效率。WizardPlus Minipreps DNA純化試劑盒，提取約10μg pPIC9K-rAcAP5m質(zhì)粒DNA，用Sac I單酶切，電泳檢測酶切完全后，用DNA純化試劑盒進行純化，溶于50μl ddH2O中。酶切反應條件如下
ddH2O5μl緩沖液 2μl10×BSA(1mg/ml)}混勻后37℃水浴4h，65℃滅活20minDNA 10μlSac I1μl酶切結(jié)果見圖4。
3、酵母感受態(tài)細胞的制備(1)在YPD培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)復蘇GS115菌株48h，挑取單克隆接種于3ml YPD中30℃，280r/m振蕩培養(yǎng)18h；(2)取50μl接種于50ml YPD培養(yǎng)液中30℃，280r/m振蕩培養(yǎng)16-18h，至OD600≈0.8-1.0；(3)4000×g室溫離心5min，去除上清，用25ml滅菌蒸餾水重懸細胞；(4)1500×g室溫離心10min，棄去水，重懸細胞于1ml 100mM LiCl中；(5)轉(zhuǎn)移細胞懸浮液至1.5ml EP管中；(6)5000×g室溫離心15min，棄去LiCl；(7)重懸細胞于400μl 100mM LiCl中；(8)取50μl細胞懸浮液至1.5ml EP管中，準備轉(zhuǎn)化。
4.酵母感受態(tài)細胞的LiCl轉(zhuǎn)化(1)將2mg/ml單鏈鮭魚精DNA煮沸5min，然后立即冰??；(2)將上述第8步中的LiCl-cells液體4000×g室溫離心5min，棄去上清；(3)向每一轉(zhuǎn)化管中加入下列試劑240μl 50％PEG3350、36μl 1M LiCl、25μl2mg/ml鮭魚精DNA、50μl質(zhì)粒DNA；(4)漩渦混合直至細胞團塊完全混勻；(5)30℃溫育30min，無需振蕩；(6)42℃水浴熱休克20～25min；(7)7000rmp離心5min，棄去轉(zhuǎn)化液；(8)100μl涂MD板，28℃培養(yǎng)3～5天，可見MD培養(yǎng)基上長出單克隆菌落5、His+/Mut+表型菌的篩選鑒定由于His+重組子中會出現(xiàn)Mut+和MutS兩種基因型，為了選擇His+/Mut+表型菌，我們將第一步中篩到的His+菌體同時點種到MM和MD平板上，根據(jù)Mut+和MutS兩種基因型在MM(碳源為甲醇)培養(yǎng)基上和MD(碳源為葡萄糖)培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)的差異，區(qū)分出Mut+和MutS兩種表型。Mut+可以快速利用甲醇為碳源，因而在MD和MM兩種平板上的生長狀況無差別；而MutS利用甲醇的速度遠遠低于利用葡萄糖的速度，因此生長一段時間后同一菌落在不同平板上的大小有明顯差異，根據(jù)這中方法區(qū)分出His+/Mut+和His+/MutS轉(zhuǎn)化子。挑取His+轉(zhuǎn)化子同時接入MM及MD平板，28℃培養(yǎng)2-3天后，MD上出現(xiàn)菌落而MM上無菌落或者較小菌落者為MutS型，否則為Mut+。挑取在MD和MM上均生長良好的菌落進行PCR鑒定，鑒定目的基因是否正確整合入酵母染色體DNA中。
5、轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定挑取MD和MM上均生長良好的單菌落，按如下方法提取酵母基因組DNA1.在10mlMD中28℃培養(yǎng)單菌落至OD600＝5-10(約20h)，1500×g室溫下離心10min；2. 10ml滅菌水洗滌菌體后，室溫下1500×g再次離心10min；3.重懸細胞于2ml新配制的SCED溶液中，加入0.1mg水解酵素，37℃放置50min；4.加入2ml 1％的SDS溶液，輕輕振勻，冰浴5min；5.加入1.5ml 5M KAc，4℃10,000×g離心5min；6.上清中加入2倍體積的無水乙醇，室溫下15min；7. 4℃10,000×g離心20min；8.輕輕重懸細胞于0.4ml TE buffer(pH＝7.4)中，輕移至EP管；9.等體積酚/氯仿(1∶1)冰浴5min抽提，再用等體積的氯仿/異丙醇(24∶1)冰浴5min抽提，轉(zhuǎn)移上層水相至兩個EP管中；10.加入1/2體積7.5M醋酸銨(pH＝7.5)，再加入2倍體積無水乙醇，冰浴20min，-20℃放置60min；11.4℃10,000×g離心20min，用1ml 70％乙醇洗滌后，再次離心10min；12.重懸于TE(pH＝7.4)中，-20℃保存待用；以提取的各基因組DNA為模板，用5′AOX1(5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)[SEQ.ID.NO.18]和3′AOX1(5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)[SEQ.ID.NO.19]引物進行PCR反應，鑒定陽性重組子，用不含插入基因的pPIC9K轉(zhuǎn)化子DNA作為對照。PCR反應條件如下94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，30個循環(huán)。用1％瓊酯糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明，編碼rAcAP5m的cDNA分子正確整合入酵母染色體DNA中。
實施例4 重組多肽rAcAP5m的分泌表達1、培養(yǎng)基的配制配制及滅菌方法同實施例3，各營養(yǎng)成分含量如下BMGY甘油1％，酵母抽提物1％，蛋白胨2％，YNB1.34％，生物素4×10-5％，0.1M磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)；BMMY甲醇0.5％，酵母抽提物1％，蛋白胨2％，YNB1.34％，生物素4×10-5％，0.1M磷酸鉀緩沖液(PH 6.0)；2、誘導表達方法挑取轉(zhuǎn)化子單菌落，接種于10mlBMGY中，28℃300r/min振蕩培養(yǎng)至OD600＝2-6(約20h)，2000×g室溫離心5min，收獲細胞，棄去上清，在BMMY培養(yǎng)基中重懸細胞達到OD600＝1，在表達過程中每隔24h補加一次甲醇。定時取出培養(yǎng)液，5000×g室溫離心5min取上清。
3、SDS-PAGE電泳分析表達結(jié)果取500μl發(fā)酵液上清，經(jīng)15％三氯乙酸(TCA)-20℃沉淀1h以上，12,000r/min，離心10min，小心吸出上清，加入1ml丙酮，輕搖后，12,000r/min，離心5min，小心吸出上清。沉淀于37℃烘干后溶于30μl體系中，以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株的發(fā)酵液為對照進行15％的SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，以紫外薄層掃描直接分析目的條帶在總蛋白中的含量。(電泳具體操作方法參見《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著)，電泳結(jié)果見圖5。
紫外薄層掃描結(jié)果見表1表1

紫外薄層掃描結(jié)果表明，目的蛋白占總蛋白的60.1％。
4、Bradford法檢測蛋白含量實驗方法參見《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著。
結(jié)果如下以牛血清白蛋白(BSA)濃度(mg/ml)為縱坐標，595nm處吸光值(OD595)為橫坐標做標準曲線(見圖6)，得到曲線方程y＝0.0202x-0.0002。根據(jù)標準曲線方程計算見表2。
表2表達培養(yǎng)液上清中的總蛋白濃度

培養(yǎng)上清中本發(fā)明重組多肽rAcAP5m的濃度為51.5×60.1％＝30.95mg/L。
實施例5 表達蛋白的純化1、試劑的配制緩沖液I(100mM Na2HPO4·NaH2PO4，pH7.8)；結(jié)合緩沖液(20mM Na2HPO4·NaH2PO4，500mM Nacl，pH7.8)；洗滌緩沖液(20mM Na2HPO4·NaH2PO4，500mM Nacl，pH6.0)；咪唑洗脫緩沖液(pH6.0)在洗滌緩沖液中加入適量3mol/L咪唑分別配成10mol/L、50mol/L、100mol/L和150mol/L的咪唑洗脫緩沖液。
2、純化過程表達上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，加入1/5體積的緩沖液I(pH7.8)和1/5體積的2.5M Nacl，上樣到NTA-Ni2+-瓊脂糖親和柱上，以10mol/L、50mol/L、100mol/L和150mol/L的咪唑洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。收集目的峰后用PBS(pH7.4)透析除去殘留的咪唑，真空冷凍干燥濃縮蛋白。NTA-Ni2+柱的處理及純化步驟如下所示(1)輕輕顛倒混勻Ni2+固化樹脂(5ml)；(2)3倍柱體積結(jié)合緩沖液平衡樹脂；(3)上樣前取10μl樣品測定Fxa抑制活性；(4)將樣品加到層析柱的頂端，流速為10個柱體積/h，用6個柱體積的結(jié)合緩沖液洗柱，用洗滌緩沖液洗柱(直至A280＜0.01)，用6個柱體積的含10mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫；(5)監(jiān)測A280，收集各蛋白峰，檢測洗脫液中樣品的活性；(6)依次分別用6個柱體積的含50mM、100mM、150mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫；(7)監(jiān)測A280，收集各蛋白峰，檢測洗脫液中的蛋白活性，收集蛋白進行透析，SDS-PAGE電泳檢測純化結(jié)果。
試驗例1 本發(fā)明重組多肽rAcAP5m體外抑制FXa活性的測定1、溶液配制緩沖液的配制0.05M Tris(pH 7.5)、0.15M NaCl、0.1％PEG-8000。
FXa溶液的配制取Bovine FXa 1μl，用緩沖液稀釋至11.43ml，混勻待用。
底物溶液的配制精確稱量發(fā)色底物Spectrozyme FXa 3.0mg，用緩沖液溶解并稀釋至12.1ml，混勻待用。
2、測定方法所有酶反應均于室溫下在96孔板中進行，F(xiàn)Xa在體系中的終濃度為1nM，發(fā)色底物終濃度為200μM。
(1)按實驗設計在96孔板中依次加入本發(fā)明重組多肽rAcAP5m、rAcAP5(參照invitrogen公司的Pichia Expression Kit說明書及Mehmet Inan等Enzyme andMicrobial Technology 1999，24438-445，利用重組的方法制備)、溶媒(PBS)對照5μl(第一排加入295μl緩沖液作為空白)，然后加入FXa 145μl，在室溫下預培育30min，使與酶充分結(jié)合。
(2)加入底物145μl啟動酶反應。發(fā)色底物與酶結(jié)合，釋放出對位硝基而產(chǎn)生顏色，在405nm波長下用BIO-RAD 550型酶標儀測量反應剛開始和10min時的OD值，計算10min內(nèi)OD值的增量，即為10min內(nèi)酶反應的平均速度(ΔOD10)。
(3)以溶媒的ΔOD10為最大反應速度，計算出樣品的抑制百分率(I％)。
I％＝(ΔOD10對照-ΔOD10樣品)/ΔOD10對照×100％結(jié)果如下表3不同濃度的rAcAP5m對FXa活性的抑制結(jié)果

以濃度為橫坐標，抑制百分率為縱坐標做曲線(見圖7)，得到方程y＝14.404Ln(x)+21.462。
根據(jù)公式計算得IC50(50％的FXa活性被抑制時的rAcAP5m濃度)＝7.25nM。
表4不同濃度的rAcAP5對FXa抑制的活性

以濃度為橫坐標，抑制百分率為縱坐標做曲線(見圖8)，得到方程y＝16.578Ln(x)+45.808。
根據(jù)公式計算得IC50(50％的FXa活性被抑制時的rAcAP5濃度)＝1.28nM。
試驗例2 本發(fā)明重組多肽rAcAP5m和rAcAP5抗血栓活性測定試驗方法雄性昆明小鼠，體重35～40g，隨機分為空白對照組、rAcAP5m組(劑量1.45mg/kg)、rAcAP5組(劑量1.45mg/kg)，參照invitrogen公司的PichiaExpression Kit說明書及Mehmet Inan等Enzyme and Microbial Technology1999，24438-445，利用重組的方法制備)和肝素組(劑量1030U/kg)共四個組。皮下給藥15min后，0.6g/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。開腹行下腔靜脈結(jié)扎術(shù)，6小時后取出血栓稱重，結(jié)果見表5。
表5本發(fā)明重組多肽rAcAP5m和rAcAP5對小鼠下腔靜脈血栓形成試驗的原始數(shù)據(jù)

表6本發(fā)明重組多肽rAcAP5m和rAcAP5對小鼠下腔靜脈血栓形成的抑制作用

**p＜0.01與空白對照相比。
序列表<110>北京大學<120>重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體、其編碼基因、其制備和應用<130>p0885<160>19<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>162<212>DNA<213>artificial<220>
<223>
<220>
<221>CDS<222>(1)..(162)<400>1aag gct tac cca gag tgt ggt gag aac gag tgt cca atc tgt aga agt48Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Cys Pro Ile Cys Arg Ser1 5 10 15aga ggt tgt ttg ttg cca cca gct tgt gtc tgt aag gac ggt ttc tac96Arg Gly Cys Leu Leu Pro Pro Ala Cys Val Cys Lys Asp Gly Phe Tyr20 25 30aga gac acc gtc atc ggt gac tgt gtc aga gag gag gag tgt gac cag 144Arg Asp Thr Val Ile Gly Asp Cys Val Arg Glu Glu Glu Cys Asp Gln35 40 45cat gag atc atc cat gtc 162His Glu Ile Ile His Val50<210>2<211>54<212>PRT<213>artificial<220>
<223>Synthetic Construct<400>2Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Cys Pro Ile Cys Arg Ser1 5 10 15Arg Gly Cys Leu Leu Pro Pro Ala Cys Val Cys Lys Asp Gly Phe Tyr20 25 30Arg Asp Thr Val Ile Gly Asp Cys Val Arg Glu Glu Glu Cys Asp Gln35 40 45His Glu Ile Ile His Val50<210>3<211>159<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>3aaggctccag agtgtggtga gaacgagtgt ccaatctgta gaagtagagg ttgtttgttg 60ccaccagctt gtgtctgtaa ggacggtttc tacagagaca ccgtcatcgg tgactgtgtc120agagaggagg agtgtgacca gcatgagatc atccatgtc 159<210>4<211>162<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
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<223>
<400>5aaggcttacc cagagtgtgg tgagaacgag tgtccaatct gtagaagtag aggttgtttg 60ttgaagccag cttgtgtctg taaggacggt ttctacagag acaccgtcat cggtgactgt120gtcagagagg aggagtgtga ccagcatgag atcatccatg tc 162<210>6<211>162<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>6aaggcttacc cagagtgtgg tgagaacgag tgtccaatct gtagaagtag aggttgtttg 60gagaagccag cttgtgtctg taaggacggt ttctacagag acaccgtcat cggtgactgt120gtcagagagg aggagtgtga ccagcatgag atcatccatg tc 162<210>7<211>162<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
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<211>21<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
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<223>
<400>9gacgacgacg acaag 15<210>10<211>59<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>10gaattccacc accaccacca ccacggtggt gacgacgacg acaagaaggc ttacccaga 59<210>11<211>42<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>11ggacactcgt tctcaccaca ctctgggtaa gccttcttgt cg42<210>12<211>47<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>12gtgtggtgag aacgagtgtc caatctgtag aagtagaggt tgtttgt 47<210>13<211>45<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>13cagacacaag ctggtggcaa caaacaacct ctacttctac agatt 45<210>14<211>42<212>DNA<213>Artificial
<220>
<223>
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<223>
<400>15gacacagtca ccgatgacgg tgtctctgta gaaaccgtcc tta 43<210>16<211>41<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>16ccgtcatcgg tgactgtgtc agagaggagg agtgtgacca g 41<210>17<211>53<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>17gcggccgctc atcagacatg gatgatctca tgctggtcac actcctcctc tct53<210>18<211>21<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>18gactggttcc aattgacaag c 21<210>19<211>21<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>19gcaaatggca ttctgacatc c 2權(quán)利要求
1.一類重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體，其含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有抑制FXa活性或抗血栓活性或功能的多肽衍生物。
2.按照權(quán)利要求1的重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體，其特征是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一種編碼權(quán)利要求1的重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體的cDNA序列，該cDNA序列具有以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(b)在嚴謹條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列，且該核苷酸序列編碼具有抑制FXa活性或抗血栓活性的多肽；或(c)編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有抑制FXa活性或抗血栓活性的多肽衍生物的核苷酸序列，該多肽衍生物通過將SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。
4.按照權(quán)利要求3的cDNA序列，其特征是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
5.一種表達載體，其特征是含有權(quán)利要求3的cDNA序列。
6.按照權(quán)利要求5的表達載體，其特征是所述的表達載體是酵母表達載體pPIC9k-rAcAP5m。
7.一種宿主細胞，其特征是含有權(quán)利要求5或6所述的表達載體。
8.一種制備權(quán)利要求1的重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體的方法，包括以下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細胞，誘導重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體的表達，回收并純化所表達的重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其特征是所述的宿主細胞是畢赤酵母細胞(Pichicpastoris)GS115；所述的誘導方法為用甲醇誘導重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體的表達；所述的純化方法包括以下步驟(a)利用NTA-Ni2+親和層析純化重組產(chǎn)物；(b)純化后用腸激酶切去N末端的6×His標簽。
10.權(quán)利要求1或2所述的任一重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體在制備抗凝血藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類具有抑制凝血因子Xa活性的重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體(rAcAP
文檔編號A61P7/00GK101041690SQ20061006564
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月22日
發(fā)明者王銀葉, 張曉雪, 劉曉巖, 李潔璇 申請人:北京大學