專利名稱：乙肝病毒s抗原的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能識(shí)別乙肝病毒(HBV)s抗原(HBs抗原)的新穎表位的探針與利用該探針檢測(cè)HBV或HBs抗原的方法。
背景技術(shù)：
主要通過(guò)檢測(cè)病毒或病毒相關(guān)組分(蛋白質(zhì)或核酸)或通過(guò)檢測(cè)病毒感染后活體產(chǎn)生的特異性抗體來(lái)診斷病毒感染。
一般通過(guò)確認(rèn)存在HBs抗原或HBc抗體來(lái)獲知HBV感染。乙肝病毒e抗原(HBe抗原)的含量、該抗原的抗體含量或HBV的DNA(HBV-DNA)含量可作為HBV感染與HBV攜帶者的臨床狀態(tài)或?qū)︻A(yù)后和治療效果判斷的指標(biāo)來(lái)檢測(cè)。
在構(gòu)成HBV病毒顆粒(HBV顆粒)的抗原中，HBs抗原是感染性HBV顆粒表面的主要組成型包膜蛋白，其錨定在包裹了含HBV-DNA的核心顆粒的源自肝細(xì)胞的脂雙層中。感染了HBV的患者血液中由HBs抗原構(gòu)成的非感染性小球形顆?；蚬軤铑w粒。該小球形顆粒在血液中含量最豐富，每一個(gè)或幾個(gè)HBV顆?？捎^察到約1000個(gè)小球形顆粒。目前可購(gòu)得的大多數(shù)HBs抗原檢驗(yàn)試劑主要檢測(cè)小球形顆粒形式的HBs抗原。
HBs抗原是由226個(gè)氨基酸殘基(氨基酸號(hào)1-226)構(gòu)成，穿過(guò)脂雙層4次的膜蛋白。雖然HBs抗原的跨膜結(jié)構(gòu)的模型尚未完全闡明，Howard等(Howard等，《病毒性肝炎與肝臟疾病》(Viral Hepatitis and Liver Disease)，(ZuckermanAJ，Alan R編)，第1094-1101頁(yè)，Liss Inc.，紐約，1988)提出HBs抗原由以下部分構(gòu)成脂雙層外，由HBs抗原的N末端1-11位構(gòu)成的(ER腔側(cè))區(qū)；由12-28位構(gòu)成，穿過(guò)脂雙層的疏水性跨膜區(qū)域；脂雙層內(nèi)由29-80位構(gòu)成的區(qū)域；由81-97位構(gòu)成的疏水性跨膜區(qū)域；由98-156位構(gòu)成的親水性ER腔區(qū)域；與157-226位構(gòu)成的兩個(gè)疏水性跨膜區(qū)域(

圖1)。
常規(guī)方法檢測(cè)HBs抗原所用的主要共有“a”決定子位于氨基酸110-156位，其包含在位于ER腔側(cè)的98-156位氨基酸中，即病毒顆粒的表面。據(jù)報(bào)道此共有“a”決定子由其中存在至少4個(gè)表位的復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成(岡本宏明，Nippon Rinsho，Bunshi Kan-En Uirusubyogaku，Kiso-Rinsho-Yobo(日本臨床，分子肝炎病毒學(xué)，基礎(chǔ)臨床預(yù)防)，下卷，甲型、乙型、丁型、戊型肝炎病毒，第212-222頁(yè)，1995年10月26日出版)。
HBV是DNA病毒，但已知HBV可發(fā)生與RNA病毒相當(dāng)?shù)耐蛔儯驗(yàn)樵诓《驹鲋称陂g，其DNA復(fù)制為RNA，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶從此RNA合成DNA。因此，據(jù)估計(jì)，感染了HBV的個(gè)體中會(huì)發(fā)生具有各種突變的突變體。當(dāng)給這種個(gè)體中的HBV施加外部選擇壓力，例如中和抗體時(shí)，會(huì)發(fā)生對(duì)壓力敏感的HBV病毒株減少的現(xiàn)象，而對(duì)壓力耐受或不敏感的突變體增加。近年來(lái)，逐漸成問(wèn)題的所謂“逃避突變體”是在該主要共有的“a”決定子中發(fā)生氨基酸取代、缺失或插入，從而該突變體可通過(guò)逃避識(shí)別突變前的“a”決定子的抗體來(lái)維持其感染能力。
發(fā)生逃避突變體的相關(guān)問(wèn)題是此突變體可維持持久的感染能力，因?yàn)樗芤?guī)避通過(guò)接種利用突變前的“a”決定子的疫苗所誘導(dǎo)的抗體。
另一問(wèn)題是常規(guī)HBs抗原檢測(cè)方法不能檢測(cè)此逃避突變體。在共有“a”決定子上具有突變的逃避突變體一般與針對(duì)野生型HBV的共有“a”決定子的單克隆抗體具有較低的反應(yīng)性，因此，常規(guī)HBs抗原檢測(cè)方法所用的、針對(duì)野生型共有“a”決定子的單克隆抗體不能識(shí)別逃避突變型HBV的HBs抗原，從而不能發(fā)現(xiàn)實(shí)際發(fā)生的HBV感染。例如，據(jù)報(bào)道145Arg突變體，即其中145位的氨基酸從野生型的Gly改變?yōu)锳rg的突變體，與針對(duì)共有“a”決定子的單克隆抗體的反應(yīng)性顯著降低(岡本宏明，Nippon Rinsho，Bunshi Kan-EnUirusubyogaku，Kiso-Rinsho-Yobo(日本臨床，分子肝炎病毒學(xué)，基礎(chǔ)臨床預(yù)防)，下卷，甲型、乙型、丁型戊型肝炎病毒，第212-222頁(yè)，1995年10月26日出版)。實(shí)際上，據(jù)報(bào)道，在用常規(guī)HBs抗原檢測(cè)試劑進(jìn)行的HBV篩選測(cè)試中呈HBs抗原陰性的輸血導(dǎo)致了HBV感染(Thiers等，Lancet，ii，1273-1276，1988)。
在HBV急性感染中，報(bào)道了HBV感染的患者在感染最初階段是HBs抗原陽(yáng)性，然后轉(zhuǎn)變?yōu)镠Bs抗原陰性同時(shí)變?yōu)镠bs抗體陽(yáng)性的現(xiàn)象?；颊咦?yōu)镠Bs抗體陽(yáng)性的原因在于患者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)HBs抗原的共有“a”決定子的抗體。該患者針對(duì)共有“a”決定子的抗體與HBs抗原測(cè)試試劑所用的單克隆抗體所識(shí)別的共有“a”決定子的同一區(qū)域相結(jié)合，從而導(dǎo)致兩種抗體間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)降低了HBs抗原測(cè)試試劑的靈敏度，進(jìn)而阻止了測(cè)試試劑對(duì)HBV的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題常規(guī)HBs抗原測(cè)試試劑利用針對(duì)野生型HBV的共有“a”決定子的單克隆抗體，故其不能檢測(cè)在共有“a”決定子上具有突變的逃避突變體，當(dāng)將以此測(cè)試試劑判斷為陰性的血液用于輸血時(shí)，可能導(dǎo)致HBV感染。本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)一種能檢測(cè)這種HBV逃避突變體的探針與利用此探針檢測(cè)HBs抗原的方法。
本發(fā)明的另一目的是開(kāi)發(fā)一種不被針對(duì)共有“a”決定子的患者抗體所阻止，即使在受感染患者的HBs抗體陽(yáng)性樣品中也能檢測(cè)HBs抗原的探針，以及利用此探針檢測(cè)HBs抗原的方法。
解決問(wèn)題的方法本發(fā)明人利用抗體作為探針成功地解決了上述問(wèn)題，所述抗體能識(shí)別位于由SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位。
即，本發(fā)明涉及的探針能識(shí)別位于對(duì)應(yīng)于乙肝病毒s抗原中26-80位氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位，具體地說(shuō)該探針能識(shí)別位于SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位。
本發(fā)明也涉及檢測(cè)乙肝病毒或乙肝病毒抗原的方法，所述方法包括利用上述探針。
在本說(shuō)明書(shū)中，226個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的HBs抗原中部分氨基酸序列的位置以指定該抗原的N-末端氨基酸殘基為數(shù)字1來(lái)表示。在HBV基因的S區(qū)域中有Pre-S1、Pre-S2和S基因來(lái)編碼由389-400個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，受Pre-S1基因+Pre-S2基因+S基因控制的大S蛋白；由281個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，受Pre-S2基因+S基因控制的中等S蛋白；由226個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，受S基因控制的小S蛋白(三田村圭二，Nippon Rinsho，Bunshi Kan-En Uirusubyogaku，Kiso-Rinsho-Yobo(日本臨床，分子肝炎病毒學(xué)，基礎(chǔ)臨床預(yù)防)，下卷，第13-27頁(yè)，1995年10月26日出版)。除非另有說(shuō)明，本文所用的術(shù)語(yǔ)“HBs抗原”一般表示小S蛋白。然而，本發(fā)明的檢測(cè)方法也可檢測(cè)所有大S蛋白、中等S蛋白與小S蛋白，因此該方法檢測(cè)的乙肝病毒s抗原(HBs抗原)包含以上3種蛋白。
本發(fā)明探針能識(shí)別SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位，通常是能特異性識(shí)別該表位的多克隆抗體或單克隆抗體。該抗體的具體例子是雜交瘤細(xì)胞株1C10、4A3或6G6產(chǎn)生的單克隆抗體，這些細(xì)胞株在2004年9月9日由日本，茨城縣，Tsukuba市，東1丁目1番地1，中央第6的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心以登錄號(hào)FERM ABP-10115、ABP-10116和ABP-10117保藏。
SEQ ID NO1所示的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于HBs抗原的26-80位的氨基酸序列，即HBs抗原脂雙層內(nèi)的親水性區(qū)域。此表位位于HBV病毒顆粒、小球形顆?；蚬軤铑w粒內(nèi)，與位于ER腔側(cè)、含HBs抗原共有“a”決定子的區(qū)域不同，該表位不經(jīng)受選擇壓力，例如能誘導(dǎo)逃避突變體的中和抗體。因此，與常規(guī)方法所用的共有“a”決定子相比，以上表位中的突變幾乎不經(jīng)受選擇壓力，利用本發(fā)明表位，很少或從不發(fā)生只有特定突變體占據(jù)優(yōu)勢(shì)從而造成只有不與HBs抗原檢測(cè)試劑發(fā)生反應(yīng)的突變體增加的情況。
當(dāng)利用本發(fā)明的探針檢測(cè)HBs抗原時(shí)，其幾乎不受患者針對(duì)HBs抗原的抗體干擾。這可能是因?yàn)楸景l(fā)明探針?biāo)R(shí)別的表位處于HBV顆粒、小球形顆粒與管狀顆粒的內(nèi)部，因而與HBs抗原的共有“a”決定子相比，此表位不易在感染HBV的患者體內(nèi)起到免疫原的作用，因此抑制了患者產(chǎn)生針對(duì)該表位的抗體。
通過(guò)利用本發(fā)明的探針，即使在共有“a”決定子上具有突變的逃避突變體中，亦可能可靠地檢測(cè)HBs抗原。
為利用本發(fā)明探針檢測(cè)樣品的HBV顆粒、小球形顆?；蚬軤铑w粒中的HBs抗原，位于脂雙層內(nèi)部或球形或管狀顆粒中的HBs抗原26-80位的氨基酸序列上的表位應(yīng)處于可與該探針接觸的狀態(tài)。
本發(fā)明的另一方面是檢測(cè)樣品中HBV或HBs抗原的方法，所述方法包括向樣品中加入能使脂雙層或蛋白質(zhì)凝聚物變性的變性劑，通常是蛋白質(zhì)變性劑，例如表面活性劑、離液離子等，特別是表面活性劑從而能用本發(fā)明探針檢測(cè)樣品中的HBs抗原。
在本發(fā)明中，利用變性劑使HBV顆粒、小球形顆粒與管狀顆粒變性，從而使由HBs抗原26-80位的氨基酸序列構(gòu)成的它們的內(nèi)部區(qū)域，即存在于HBs抗原的脂雙層內(nèi)部的親水性區(qū)域與外部相接觸。本文可用的變性劑是能破壞HBV顆粒的脂雙層并斷裂小球形顆粒和管狀顆粒中HBs抗原問(wèn)的鍵(凝聚)但不使本發(fā)明探針失活的變性劑，通常可用諸如十二烷基硫酸鈉的表面活性劑。
本發(fā)明也提供檢測(cè)HBV病毒的方法，所述方法包括利用本發(fā)明的探針、變性劑與能特異性識(shí)別除HBs抗原以外的HBV抗原的探針，以及具有這種構(gòu)成的檢測(cè)HBV的試劑，即該試劑包括本發(fā)明的探針、變性劑與能特異性識(shí)別除HBs抗原以外的HBV抗原的探針。
通過(guò)與本發(fā)明的探針聯(lián)用的某探針檢測(cè)除HBs抗原以外的HBV抗原，例如HBcr抗原(WO02/14871)，可將因只檢測(cè)HBs抗原而錯(cuò)誤判斷為HBV陰性的HBV患者樣品可靠地判斷為HBV陽(yáng)性。
如上所述，已知HBs抗原能以與RNA病毒相當(dāng)?shù)母哳l率發(fā)生突變。因此，突變型HBs抗原也可由不同于HBs抗原26-80位的氨基酸序列中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的序列構(gòu)成。
然而，即使具有這種突變的HBs抗原，如果確定了其氨基酸序列，也能根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)與純化。得到針對(duì)這種純化的突變型HBs抗原的探針，將其用于檢測(cè)HBs抗原。因此，在本發(fā)明中，對(duì)應(yīng)于HBs抗原26-80位的氨基酸序列的序列不限于識(shí)別SEQ ID NO1所示氨基酸序列上表位的探針或利用所述探針的檢測(cè)方法。
本發(fā)明的作用利用本發(fā)明的探針與利用該探針檢測(cè)HBV或HBs抗原的方法，能高度敏感性地檢測(cè)在HBs抗原的共有“a”決定子上具有突變、不能用常規(guī)HBs抗原檢測(cè)方法檢測(cè)的逃避突變體等，從而可高度可靠地判斷HBV感染。即使如果針對(duì)HBs抗原的共有“a”決定子的患者抗體抑制了HBs抗原的檢測(cè)，采用本發(fā)明的檢測(cè)方法也能可靠地判斷HBV感染。
即使患者的抗體與本發(fā)明的探針競(jìng)爭(zhēng)并抑制了HBs抗原的檢測(cè)，通過(guò)聯(lián)用酸化劑或堿化劑與變性劑預(yù)處理能可靠地判斷HBV感染。
聯(lián)用本發(fā)明的探針與能識(shí)別另一HBV抗原的探針來(lái)同時(shí)檢測(cè)HBs抗原與另一HBV抗原，能更可靠地檢測(cè)HBV感染。
附圖簡(jiǎn)述圖1闡述了HBs抗原的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的探針可以是能特異性識(shí)別對(duì)應(yīng)于HBs抗原26-80位的氨基酸序列(例如SEQ ID NO1所示氨基酸序列)構(gòu)成的肽上表位的任何探針，通常可用針對(duì)抗原，例如上述肽或HBs抗原產(chǎn)生的抗體，特別是單克隆抗體。
可通過(guò)利用編碼該肽的基因的重組基因技術(shù)或化學(xué)合成制備SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽，采用本身已知的各種方法或儀器等可得到這種制備工藝。
可通過(guò)從HBV患者血清中分離病毒基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增該目標(biāo)基因來(lái)制備含有編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的核苷酸序列的基因片段。利用源自PCR期間加入的接頭的限制性酶切位點(diǎn)或源自基因片段所插入的質(zhì)粒的限制性酶切位點(diǎn)，可將該基因克隆入表達(dá)載體。
將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主，例如大腸桿菌中，培養(yǎng)大腸桿菌得到位于脂雙層內(nèi)部的HBs(26-80)抗原。采用諸如超聲破碎細(xì)胞、離心與各種層析技術(shù)的常規(guī)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)從經(jīng)培養(yǎng)得到的微生物中收集與純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。即，當(dāng)采用上述方法有效地表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)時(shí)，許多蛋白質(zhì)在微生物中形成內(nèi)含體。利用此特征，可在生理?xiàng)l件(例如生理鹽水)下將這些微生物懸浮在緩沖液中，然后超聲破碎細(xì)胞，離心破碎的微生物物質(zhì)回收不可溶組分。用6M脲提取回收的不可溶組分，凝膠過(guò)濾得到高純度的trpE-HBs(26-80)抗原，然后將其用作免疫原。
可通過(guò)單用上述HBs(26-80)抗原或多肽(下文稱為本發(fā)明抗原)或?qū)⑴cBSA、KLH等偶聯(lián)的本發(fā)明抗原與佐劑(例如完全弗氏佐劑)的混合物周期性免疫動(dòng)物，例如大鼠、家兔、山羊或綿羊，然后收集其血清來(lái)制備本發(fā)明的探針，例如多克隆抗體。為獲得具有特異性識(shí)別位點(diǎn)的多克隆抗體，有可利用目標(biāo)區(qū)域中的部分肽作為免疫原的方法。
熟知利用雜交瘤制備單克隆抗體。例如，單用本發(fā)明抗原或其與BSA、KLH等的偶聯(lián)物作為與佐劑(例如完全弗氏佐劑)的混合物周期性免疫動(dòng)物，例如BALB/c小鼠。當(dāng)血液中的抗體滴度增加時(shí)，在最后一次免疫中將本發(fā)明抗原給予尾靜脈，無(wú)菌切下脾臟，將脾細(xì)胞與合適的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合得到雜交瘤。可采用Kohler和Milstein的方法(Nature，256495-497，1975)實(shí)施此方法。
在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)采用上述方法得到的雜交瘤，然后選擇并克隆產(chǎn)生能與本發(fā)明抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞。為克隆產(chǎn)生抗體的雜交瘤，不只可采用有限稀釋也能采用軟瓊脂方法(Eur J Immuno1.，6511-519，1976)?？稍谂囵B(yǎng)基或小鼠腹腔中培養(yǎng)此雜交瘤從而在培養(yǎng)基或腹水中制備單克隆抗體。
可采用例如蛋白A的柱層析的方法純化血清中的多克隆抗體或培養(yǎng)基或腹水中制備的單克隆抗體。可采用，例如利用載體固定的抗原的親和層析方法處理多克隆抗體，從而只純化能與特定抗原反應(yīng)的抗體，也可以類(lèi)似方式得到不與特定抗原反應(yīng)的抗體。
除了單克隆抗體與多克隆抗體，可制備用作探針的分子。例如，Hoogenboon的綜述(Trends in Biotechnology，1562-70，1997)詳述了重組抗體。
本發(fā)明所用的變性劑可以是能破壞HBV顆粒的脂雙層結(jié)構(gòu)并斷裂小球形顆粒和管狀顆粒中HBs抗原間的鍵(凝聚)的任何變性劑。例如，可利用脲、酸化劑與堿化劑，表面活性劑特別有效。表面活性劑包括非離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、兩性表面活性劑與陰離子表面活性劑，以上任一種只要能破壞脂雙層的結(jié)構(gòu)就可用。例如，非離子表面活性劑，如吐溫20與Nonidet P-40能有效地破壞脂雙層結(jié)構(gòu)從而使本發(fā)明的表位暴露，雖然它們的表面活性不是很強(qiáng)。
認(rèn)為陰離子表面活性劑，例如SDS與Sarcosyl具有強(qiáng)表面活性，這種表面活性劑也能使本發(fā)明的表位暴露。用強(qiáng)表面活性劑處理可能破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象表位，因而在某些情況中識(shí)別構(gòu)象表位的抗體不能與抗原結(jié)合；在此情況中，可利用能識(shí)別HBs抗原的線性表位的探針來(lái)檢測(cè)抗原。
變性劑的作用不只能有效地釋放存在于樣品中的HBs抗原，也能使單克隆抗體易于和HBs抗原結(jié)合。
在本發(fā)明中，特別優(yōu)選利用能特異性地與用上述表面活性劑變性的抗原相結(jié)合的探針。當(dāng)將抗體用作探針時(shí)，該抗體應(yīng)是能與通過(guò)上述變性處理而暴露和變性的本發(fā)明表位相結(jié)合的探針。
例如，當(dāng)利用具有強(qiáng)表面活性的具體表面活性劑時(shí)，需要選擇針對(duì)利用該表面活性劑而暴露和變性的表位的單克隆抗體。因此，需要用已用表面活性劑變性處理過(guò)的、對(duì)應(yīng)于HBs抗原26-80位的氨基酸(序列)構(gòu)成的肽(例如，SEQID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽)免疫動(dòng)物，也需要用所述肽選擇抗體。
為篩選抗體，將經(jīng)變性處理的肽抗原固定在固相上，在含有表面活性劑的溶液中篩選與該抗原反應(yīng)的單克隆抗體，從而得到適合于免疫測(cè)定的本發(fā)明抗體。由于篩選溶液含有表面活性劑，可得到能耐受表面活性劑的變性作用的單克隆抗體。
可采用免疫測(cè)定，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、酶免疫斑點(diǎn)測(cè)定、放射性免疫測(cè)定與基于凝集的試驗(yàn)或其它熟知的免疫測(cè)定來(lái)檢測(cè)樣品中經(jīng)變性處理的HBs抗原。當(dāng)利用標(biāo)記的抗體檢測(cè)時(shí)，可使用標(biāo)記物諸如熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)或酶。
例如，當(dāng)采用根據(jù)ELISA夾心反應(yīng)原理的方法來(lái)檢測(cè)樣品中的HBs抗原時(shí)，所述方法包括以下步驟。首先，將能識(shí)別位于脂雙層內(nèi)部的表位的抗體等與固體支持物(例如，微滴定孔的內(nèi)壁)結(jié)合。然后，用牛血清白蛋白等封閉以防止非特異性反應(yīng)。向此支持物加入用表面活性劑等處理過(guò)的樣品，從而使固定于其上的抗體捕獲HBs抗原。針對(duì)捕獲的HBs抗原的標(biāo)記抗體等可與該HBs抗原反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。待與固體支持物結(jié)合的抗體可以是能與位于脂雙層內(nèi)部的表位結(jié)合的任何抗體。標(biāo)記的抗體可以是能與HBs抗原結(jié)合的任何抗體。它們的組合是隨意的，可選擇能實(shí)現(xiàn)高選擇性與高特異性的組合。
上述可用的固體支持物包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯微滴定板、試管、毛細(xì)管、珠(乳膠顆粒、紅細(xì)胞、金屬化合物等)、膜(脂質(zhì)體等)與過(guò)濾器等?？蓹z測(cè)其中的本發(fā)明HBs抗原的樣品包括生物學(xué)體液，例如全血、血漿、血清、尿、唾液與腦脊液以及組織，例如肝臟組織。
將樣品中的HBs抗原處理為適合于和探針，例如單克隆抗體(發(fā)生)結(jié)合反應(yīng)的狀態(tài)而不涉及復(fù)雜過(guò)程的方法對(duì)本發(fā)明很重要。即，溶解樣品所含HBs抗原的脂雙層從而使原來(lái)不暴露于病毒顆粒表面的表位變得暴露是重要的。
實(shí)施例以下實(shí)施例是為說(shuō)明本發(fā)明，而不是要限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1trpE-HBs(26-80)抗原的表達(dá)與純化(A)構(gòu)建表達(dá)TrpE-HBs(26-80)抗原的質(zhì)粒采用以下方法構(gòu)建HBs(26-80)區(qū)域的表達(dá)質(zhì)粒。將100μl HBV患者的血清與100μl DNA提取物[10μl 1M Tris-HCl(pH 8.4)，8μl 250mM EDTA，40μl 10％SDS，8μl 5M NaCl，10μl 20mg/ml蛋白酶K，1μl tRNA(5μg/μl)，與23μl無(wú)菌水]混合，54℃培育30分鐘。將樣品與200μl苯酚/氯仿(1/1)溶液混合，然后15Krpm離心5分鐘得到上清液，向上清液中加入150μl異丙醇與7μl 5M NaCl，-20℃靜置1小時(shí)。4℃，15Krpm離心5分鐘后，用70％乙醇洗滌沉淀物，然后再4℃以15Krpm離心5分鐘。風(fēng)干沉淀物，溶解于20μl無(wú)菌水得到HBV DNA溶液。
5μl此HBV DNA溶液利用兩種引物(即，5’-GAATTCCTCACAATACCACAGAGTCTA-3’(SEQ ID NO2)和5’-GGATCCTTAAAAACGCCGCAGACACATCCAGCG-3’(SEQ ID NO3))進(jìn)行PCR。利用GeneAmpTM(Perkin Elmer Cetus制造的DNA擴(kuò)增試劑試劑盒)以95℃1分鐘DNA變性、55℃1分鐘退火與72℃1分鐘DNA合成為條件進(jìn)行PCR，采用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，玻璃粉方法(glass powder method)(GeneClean)純化得到的DNA片段。37℃，用20μl限制性酶切反應(yīng)溶液[50mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，15 U EcoRI酶與15 U BamHI酶]消化0.5μg該擴(kuò)增的HBs(26-80)基因片段1小時(shí)，然后進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳來(lái)純化約180-bp的EcoRI-BamHI片段。
然后，在37℃用20μl限制性酶反應(yīng)溶液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，15 U EcoRI酶與15 U BamHI酶]消化0.5μg DNA(即表達(dá)載體pATtrpE)1小時(shí)，再向反應(yīng)溶液中加入39μl水，接著將溶液在70℃加熱處理5分鐘，向其中加入1μl(250 U/μl)細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)，37℃培育1小時(shí)。
苯酚提取該反應(yīng)溶液，乙醇沉淀得到的水相，干燥沉淀物。將0.5μg所得的EcoRI-BamHI-處理的載體DNA與上述180-bp HBs(26-80)片段加入1μl(350U/μl)T4連接酶與5μl 10×連接酶緩沖液[660 mM Tris-HCl(pH7.5)，66mMMgCl2，100mM二硫蘇糖醇，1mM ATP]制備的混合物中，然后用水調(diào)節(jié)至50μl，16℃培育過(guò)夜進(jìn)行連接反應(yīng)。為獲得表達(dá)質(zhì)粒pATtrpE-HBs(26-80)，利用此連接反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。
采用氯化鈣方法[Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159-162，(1970)]制備用于轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌菌株。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布在含有25μg/ml氨芐西林的LB平板(1％胰蛋白胨，0.5％NaCl，1.5％瓊脂)上，37℃培育過(guò)夜。利用鉑接種環(huán)將平板上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落轉(zhuǎn)移至含有25μg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃培育過(guò)夜。
離心1.5ml轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)液收集細(xì)菌，采用堿方法[Manniatis等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，(1982)]進(jìn)行質(zhì)粒DNA的少量制備。37℃，用20μl限制性酶切反應(yīng)溶液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，15 U EcoRI酶和15 UBamHI酶]消化1μg得到的質(zhì)粒DNA1小時(shí)，然后采用瓊脂糖凝膠電泳分離pATtrpE-HBs(26-80)表達(dá)質(zhì)粒得到約180-bp EcoRI-BamHI片段。
(B)TrpE-HBs(26-80)抗原的表達(dá)與純化將含有表達(dá)質(zhì)粒pATtrpE-HBs(26-80)的大腸桿菌HB 101菌株接種在含有50μg/ml氨芐西林的3ml 2YT培養(yǎng)液中(1.6％胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)，然后在37℃培養(yǎng)9小時(shí)。將1ml此培養(yǎng)液接種入含有50μg/ml氨芐西林的100ml M9-CA培養(yǎng)液(0.6％Na2HPO4，0.5％KH2PO4，0.5％NaCl，0.1％NH4Cl，0.1mM CaCl2，2mM MgSO4，0.5％酪蛋白氨基酸，0.2％葡萄糖)中，然后在37℃培養(yǎng)。當(dāng)OD600達(dá)到0.3時(shí)，加入吲哚-丙烯酸至終濃度為40mg/l，再培養(yǎng)16小時(shí)。以5 Krpm離心此培養(yǎng)液10分鐘收集微生物。
將微生物懸浮在20ml緩沖液A[50 mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，30mM NaCl]中，再次離心得到2.6g表達(dá)微生物。將得到的微生物懸浮在10ml緩沖液A中，然后超聲破碎大腸桿菌膜，再離心得到含有trpE-HBs(26-80)融合抗原的不可溶組分。
將此不可溶組分溶解于含有8M脲、10mM二硫蘇糖醇與1mM EDTA的3ml PBS中，有6M脲存在下經(jīng)Sephacryl S300HR柱凝膠過(guò)濾，從而使trpE-HBs(26-80)融合抗原達(dá)到幾乎均質(zhì)。
實(shí)施例2制備雜交瘤用6M脲溶解以上述方法制備的多肽[trpE-HBs(26-80)]，然后用含有0.15M NaCl的10mM磷酸緩沖液(pH7.3)(PBS)將其稀釋至終濃度為0.2-1.0mg/ml，與等體積的弗氏佐劑混合后以10-20μg的劑量腹膜內(nèi)給予4-6周齡的BALB/c小鼠。
以與上述相同的方式每2-4周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，將溶解在PBS中的10μgHBs給予尾靜脈進(jìn)行最終免疫。
最終免疫后3天時(shí)，無(wú)菌取出小鼠的脾臟，然后用剪刀與金屬篩網(wǎng)使其破碎為單個(gè)細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次。用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株Sp2/Oag14三次，將細(xì)胞以1∶5的比例與脾細(xì)胞混合。以200×g離心5分鐘后，棄去上清液，輕緩混合下將含有50％聚乙二醇(PEG)4000(Merck)的1ml RPMI-1640培養(yǎng)基緩慢加入細(xì)胞團(tuán)中，然后再加入10ml RPMI-1640培養(yǎng)基以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合。
離心(200×g，5分鐘)得到的融合細(xì)胞以除去PEG，融合懸浮在含有10％胎牛血清和次黃嘌呤、氨基蝶呤與胸腺嘧啶(HAT)的RPMI-1640培養(yǎng)液中，涂布到96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。培養(yǎng)約10天只使雜交瘤增殖后，采用ELISA方法選擇產(chǎn)生目標(biāo)抗體的克隆從而得到產(chǎn)生具有所需反應(yīng)特異性的單克隆抗體的雜交瘤。
采用有限稀釋將得到的雜交瘤制成單克隆從而得到產(chǎn)生抗體的雜交瘤。得到的雜交瘤分別命名為6G6、4A3和1C10。這些雜交瘤細(xì)胞在2004年9月9日由國(guó)際專利生物保藏單位(IPOD)，日本的國(guó)立高級(jí)工業(yè)科學(xué)與技術(shù)研究所(AIST)保藏。
實(shí)施例3單克隆抗體的制備與分析采用實(shí)施例2所述方法得到的各雜交瘤植入已給予降植烷的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，獲得在腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體。
利用蛋白A瓊脂糖柱通過(guò)親和層析純化含有單克隆抗體的IgG組分。
利用TrpE-HBs(26-80)抗原與由20個(gè)氨基酸構(gòu)成的各個(gè)合成肽分析所得的各單克隆抗體的靶表位，結(jié)果(如表1所示)發(fā)現(xiàn)這些單克隆抗體識(shí)別位于脂雙層內(nèi)部的HBs抗原表位(氨基酸號(hào)26-80)，所述合成肽根據(jù)源自HBs區(qū)域的序列合成。

表1

利用抗-小鼠Ig同種型抗體采用同種分型試劑盒(Zymed)鑒定各單克隆抗體的(亞)類(lèi)。結(jié)果如表2所示，6G6和4A3的亞類(lèi)是IgGl、κ，1C10的亞類(lèi)是IgG2a、κ。
能識(shí)別存在于本發(fā)明氨基酸號(hào)31-70區(qū)域中的抗原表位的抗體未見(jiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體6G6、4A3和1C10各自識(shí)別新穎的表位。
表2

實(shí)施例4檢驗(yàn)利用表面活性劑的檢測(cè)方法用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)將抗-HBs抗原的單克隆抗體6G6稀釋至6μg/ml的終濃度，然后以每孔80μl的體積移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。將微滴定板置于4℃過(guò)夜，用含有0.15M NaCl的0.35ml10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)洗滌兩次，然后加入含有0.5％酪蛋白-Na的0.35ml10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(下文稱為封閉溶液)，再于室溫培育2小時(shí)。
除去封閉溶液后，向各孔加入含有0.15M NaCl、1％BSA和0.5％酪蛋白-Na的40μl 100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(其中加入了終濃度為4％或8％的各種表面活性劑)與40μl檢測(cè)樣品，然后在室溫反應(yīng)1小時(shí)，用0.35 ml洗滌溶液洗滌5次后，加入80μl用過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記的單克隆抗體(5C3)，混合物在室溫反應(yīng)30分鐘。用0.35 ml洗滌溶液洗滌各孔6次，其與80μl底物(鄰苯二胺，下文稱為OPD)溶液在室溫反應(yīng)30分鐘后，向各孔加入80μl 2N硫酸溶液，然后檢測(cè)其在波長(zhǎng)為492nm處的吸光度(OD492)，以其在630nm處的吸光度用作參比值。
采用各種表面活性劑時(shí)檢測(cè)HBS陽(yáng)性血清的結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)利用不含表面活性劑的緩沖液檢測(cè)HBs抗原陽(yáng)性血清時(shí)，不能檢測(cè)HBs抗原，但當(dāng)利用含有各種表面活性劑(陰離子、陽(yáng)離子、兩性與非離子表面活性劑)的緩沖液檢測(cè)時(shí)可獲得足夠的信號(hào)從而能清楚地檢測(cè)HBs抗原。因此這說(shuō)明可以利用各種表面活性劑使表位暴露于外部來(lái)檢測(cè)存在于HBs抗原脂雙層內(nèi)部的新穎表位。
用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體5C3是通過(guò)表達(dá)由1-226位氨基酸序列構(gòu)成的抗原(即全長(zhǎng)HBs抗原)，然后純化此重組抗原并用它免疫小鼠獲得的一種單克隆抗體。證實(shí)如此獲得的抗體5C3能與以上重組HBs抗原結(jié)合。然而，當(dāng)根據(jù)HBs抗原1-226位的氨基酸序列合成各自由20個(gè)氨基酸構(gòu)成，彼此有10個(gè)氨基酸重疊的合成肽并通過(guò)與實(shí)施例3相同的方法檢驗(yàn)它們與抗體5C3的結(jié)合(情況)時(shí)，抗體5C3不與任何合成肽反應(yīng)。因此，據(jù)估計(jì)抗體5C3不識(shí)別HBs抗原的氨基酸序列的線性表位，而識(shí)別其構(gòu)象表位。
表3


實(shí)施例5檢測(cè)HBs抗原陰性樣品采用實(shí)施例4的改進(jìn)方法檢測(cè)HBs抗原陰性但懷疑感染了HBs的樣品中的HBs抗原。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)將抗-HBs抗原的單克隆抗體6G6稀釋至6μg/ml的終濃度，然后以每孔100μl的體積移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。將微滴定板置于4℃過(guò)夜，用含有0.15M NaCl的0.35ml10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)洗滌兩次，然后加入含有0.5％酪蛋白鈉與3％蔗糖的0.35ml 10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(封閉溶液)，將混合物置于室溫2小時(shí)。
除去封閉溶液后，向各孔加入含有0.15M NaCl、10mM EDTA-2Na、0.2％proclin、1％BSA、0.1％酪蛋白鈉、3％馬血清、2％小鼠血清和10％Brij 35的50μl 100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)與50μl檢測(cè)樣品，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用0.35ml洗滌溶液洗滌5次后，加入100μl用過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記的單克隆抗體(5C3)，混合物在室溫反應(yīng)30分鐘。
反應(yīng)后，用0.35ml洗滌溶液洗滌各孔6次，其與100μl底物(鄰苯二胺，下文稱為OPD)溶液在室溫反應(yīng)30分鐘后，向樣品中加入2N硫酸溶液，然后檢測(cè)樣品在波長(zhǎng)為492 nm處的吸光度(OD492)，以其在630nm處的吸光度作參比值。
所用的樣品購(gòu)自IIC日本；采用Abbott Laboratories的CLIA方法檢測(cè)HBs抗原與抗-HBs抗體；采用Gen-Probe Incorporated的TMA方法檢測(cè)HBN-DNA。
表4

表4所示的5份樣品通過(guò)TMA方法(檢測(cè))為HBV-DNA-陽(yáng)性。這些樣品通過(guò)Abbott Laboratories的CLIA方法也(檢測(cè))為HBs抗體陽(yáng)性，認(rèn)為它們是來(lái)自感染了HBV患者的血清。然而，第2、3和5號(hào)樣品通過(guò)Abbott Laboratories的HBsAg CLIA方法，即常規(guī)的HBs抗原檢測(cè)方法判斷為陰性。
當(dāng)通過(guò)本發(fā)明方法判斷這些HBs抗原陰性樣品時(shí)，在第2和5號(hào)樣品中檢測(cè)到HBs抗原。HBcrAg檢測(cè)方法能檢測(cè)到由本發(fā)明檢測(cè)方法與AbbottLaboratories的HBsAg CLIA方法判斷為HBs抗原陰性的第3號(hào)樣品，同時(shí)檢測(cè)HBs抗原與HBcr抗原可用于更精確地檢測(cè)HBV抗原。
實(shí)施例61)酸化劑的濃度將各種濃度的50μl鹽酸水溶液加入50μL HBV抗原陰性樣品或3份含有抗-HBs抗體的HBV抗原陽(yáng)性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過(guò)以下方法檢驗(yàn)作為檢測(cè)樣品的50μL混合物溶液。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)將抗-HBs抗原的單克隆抗體6G6稀釋至6μg/ml的終濃度，然后以每孔100μl的體積移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。將微滴定板于4℃培育過(guò)夜。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)洗滌微滴定板兩次，然后加入含有0.5％酪蛋白鈉的350μl 10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.1)，培育微滴定板2小時(shí)。除去封閉溶液后，向各孔加入含有中和抗體的100μl反應(yīng)緩沖液與每種經(jīng)樣品處理方法得到的各種檢測(cè)樣品，室溫振蕩反應(yīng)2小時(shí)，用含有0.05％吐溫20的350μl 10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(洗滌溶液)洗滌6次后，加入100μl用過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記的單克隆抗體(5C3)，混合物在室溫反應(yīng)30分鐘。用洗滌溶液洗滌各孔6次，然后與100μl底物(鄰苯二胺，下文稱為OPD)溶液培育30分鐘后，向各孔中加入100μl 2N硫酸溶液，然后檢測(cè)其在波長(zhǎng)為492nm處的吸光度(OD492)，以其在630nm處的吸光度作參比值。表中所示的鹽酸濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
即使將含有抗-HBs抗體的HBs抗原陽(yáng)性樣品(#990493、#990640、#990650)與不含鹽酸的溶液在室溫培育10分鐘，也幾乎檢測(cè)不到HBs抗原活性。處理時(shí)從0.05 N的鹽酸濃度開(kāi)始檢測(cè)到HBs抗原活性，在0.25-1.0N的濃度處出現(xiàn)峰值(表5)。
表5

實(shí)施例72)有酸化劑存在下的各種表面活性劑將溶解于1.0N鹽酸水溶液的每種30μL各種表面活性劑加入30μL HBV抗原陰性樣品或HBs抗原陽(yáng)性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過(guò)1)所述的方法檢驗(yàn)作為檢測(cè)樣品的50μL混合物溶液(表6-9)。表中所示的鹽酸濃度與表面活性劑濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
如表6-9所示，3份樣品中至少1份顯示反應(yīng)性高于各樣品判斷標(biāo)準(zhǔn)的表面活性劑判斷為有效的表面活性劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將各種表面活性劑與酸化劑，例如鹽酸或硫酸一起加入時(shí)，利用表面活性劑的HBs抗原陽(yáng)性樣品中HBs抗原的免疫反應(yīng)性增加。判斷為有效的表面活性劑是在其分子中具有直鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩性或陽(yáng)離子表面活性劑。
非離子表面活性劑，例如Triton X100和Bridj 35也檢測(cè)為有效的。具有固醇骨架的表面活性劑，例如CHAPS未顯示反應(yīng)性增加。此外，也檢測(cè)了陰離子表面活性劑，例如SDS和N-月桂酰肌氨酸鈉與脫氧膽酸，但這些表面活性劑在有酸化劑存在時(shí)溶解性不佳，因而不能對(duì)它們作出檢測(cè)。
向酸化劑中加入在分子中具有直鏈烷基與叔胺或季銨鹽的兩性或陽(yáng)離子表面活性劑能提高檢測(cè)靈敏度。將在處理溶液中存在酸化劑時(shí)有效的這種表面活性劑用于不存在酸化劑的處理溶液中時(shí)，其檢測(cè)靈敏度顯著降低。從上述可知，靈敏度增加的原因是酸化劑使作為HBs抗原檢測(cè)抑制因素的抗-HBs抗體失活，而加入表面活性劑使位于樣品中HBs抗原的脂雙層內(nèi)部的表位暴露于外部，因而顯著提高其與6G6的反應(yīng)性。
表6陽(yáng)離子(TAC型)

表7陽(yáng)離子(TAB型)
表8兩性
表9非離子


實(shí)施例83)有酸化劑存在下的蛋白變性劑將溶解于1.0N鹽酸水溶液的30μL蛋白變性劑(脲或鹽酸胍)加入30μLHBV抗原陰性樣品或3份HBs抗原陽(yáng)性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過(guò)1)所述的方法檢驗(yàn)作為檢測(cè)樣品的50μL混合物溶液。表10顯示了各HBs抗原陽(yáng)性樣品的免疫反應(yīng)性。表10所示鹽酸濃度與蛋白變性劑濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
樣品顯示在有酸化劑存在下利用蛋白變性劑的免疫反應(yīng)性高于只有酸化劑時(shí)的免疫反應(yīng)性；即，用脲使免疫反應(yīng)性增加約1.5-3倍，用鹽酸胍使免疫反應(yīng)性增加約2-3倍。用酸化劑處理時(shí)，血清蛋白等可能變性從而造成沉淀或者在一些情況中變得混濁進(jìn)而阻礙了移液過(guò)程，沉淀物往往是得到假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因。由于目標(biāo)抗原摻入這種沉淀物中，也可能降低靈敏度。發(fā)現(xiàn)在處理時(shí)加入濃度為0.5M或更高的脲或鹽酸胍可顯著減少這種沉淀物形成，在處理時(shí)加入濃度為1.5-4M的脲與濃度為2-3.5M的鹽酸胍此作用尤其更好。
表10

實(shí)施例94)有酸化劑存在下檢驗(yàn)還原劑將作為還原劑的二硫蘇糖醇、鹽酸2-巰基乙胺或鹽酸2-二乙基氨基乙硫醇溶解于1.0N鹽酸水溶液，將此30μL混合溶液加入30μL HBV抗原陰性樣品(正常血漿)或3份HBs抗原陽(yáng)性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過(guò)1)所述的方法檢驗(yàn)作為檢測(cè)樣品的50μL混合物溶液(表11)。
本文所用的還原劑濃度是其在樣品處理期間的濃度。甚至當(dāng)還原劑加入HBV抗原陰性樣品中時(shí)，未檢測(cè)到其信號(hào)有變化，但在一份HBs抗原陽(yáng)性樣品(#990640)中，利用濃度為1-5mM的二硫蘇糖醇時(shí)檢測(cè)到有30％或更高的增幅。
表11還原劑


實(shí)施例105)堿化劑的濃度將50μL各種濃度的氫氧化鈉水溶液加入50μL HBV抗原陰性樣品或三份含有抗-HBs抗體的HBV抗原陽(yáng)性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后在室溫培育10分鐘，按照以下檢測(cè)方法檢測(cè)作為檢測(cè)樣品的50μL混合物溶液。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)將抗-HBs抗原的單克隆抗體6G6稀釋至6μg/ml的終濃度，然后以每孔100μl的體積移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。將微滴定板于4℃培育過(guò)夜。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)洗滌微滴定板兩次，然后加入含有0.5％酪蛋白鈉的350μl 10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.1)，培育微滴定板2小時(shí)。除去封閉溶液后，向各孔加入含有中和抗體的100μl反應(yīng)緩沖液與經(jīng)各種樣品處理方法得到的各檢測(cè)樣品，室溫振蕩反應(yīng)2小時(shí)，用含有0.05％吐溫20的350μl 10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(洗滌溶液)洗滌6次后，加入100μl用生物素標(biāo)記的單克隆抗體(HBs124)?；旌衔镌谑覝胤磻?yīng)30分鐘。用洗滌溶液洗滌各孔6次，然后向其中加入100μl POD標(biāo)記的親和素D，混合物在室溫反應(yīng)30分鐘。用洗滌溶液洗滌各孔6次后，向其中加入100μl底物(鄰苯二胺，下文稱為OPD)溶液，培育30分鐘，向各孔中加入2N硫酸溶液后，檢測(cè)其在波長(zhǎng)為492nm處的吸光度(OD492)，以其在630nm處的吸光度作參比值。表中所示的氫氧化鈉濃度是樣品與處理試劑混合物后處理期間的濃度。
生物素標(biāo)記的單克隆抗體HBs124是如實(shí)施例1所述通過(guò)表達(dá)與純化全長(zhǎng)HBs抗原(即，由1-226位氨基酸序列構(gòu)成的抗原)，用該重組抗原免疫小鼠得到的單克隆抗體。證實(shí)抗體HBs124與以上重組HBs抗原結(jié)合。然而，當(dāng)根據(jù)HBs抗原1-226位的氨基酸序列合成各由20個(gè)氨基酸構(gòu)成，彼此有10個(gè)氨基酸重疊的合成肽并通過(guò)與實(shí)施例3相同的方法檢驗(yàn)它們與抗體HBs124的結(jié)合(情況)時(shí)，抗體HBs124不與任何合成肽反應(yīng)。因此，據(jù)估計(jì)抗體HBs124不識(shí)別HBs抗原的氨基酸序列的線性表位，而識(shí)別其構(gòu)象表位。
甚至通過(guò)在不含氫氧化鈉的溶液中室溫培育含有抗-HBs抗體的HBV陽(yáng)性樣品(#990493，#990640，#990650)10分鐘未檢測(cè)到HBs抗原活性，但用濃度為0.25-1N的氫氧化鈉處理檢測(cè)到HBs抗原的信號(hào)有增加(表12)。
表12

實(shí)施例116)有堿化劑存在下的各種表面活性劑濃度將溶解于1.0N氫氧化鈉水溶液的30μL各種表面活性劑加入30μL HBV抗原陰性樣品或三份HBs抗原陽(yáng)性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過(guò)5)所述的方法檢驗(yàn)作為檢測(cè)樣品的50μL混合物溶液(表13-17)。表中所示的氫氧化鈉水溶液與表面活性劑濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
如表13-17所示，3份樣品中至少1份顯示反應(yīng)性高于各樣品判斷標(biāo)準(zhǔn)的表面活性劑判斷為有效的表面活性劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將各種表面活性劑與堿化劑，例如氫氧化鈉一起加入時(shí)，利用表面活性劑的HBs抗原陽(yáng)性樣品中HBs抗原的免疫反應(yīng)性增加。判斷為有效的表面活性劑包括陰離子表面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉或N-月桂酰肌氨酸鈉與在其分子中具有直鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩性或陽(yáng)離子表面活性劑。
非離子表面活性劑，例如Triton X100、吐溫20和Bridj 35與具有固醇骨架的表面活性劑，例如CHAPS也檢測(cè)為有效的。
向堿化劑中加入陰離子表面活性劑或在分子中具有直鏈烷基與叔胺或季銨鹽的兩性或陽(yáng)離子表面活性劑能提高檢測(cè)靈敏度。將在處理溶液中存在堿化劑時(shí)有效的這種表面活性劑用于不存在堿化劑的處理溶液中時(shí)，未發(fā)現(xiàn)增加檢測(cè)靈敏度。認(rèn)為通過(guò)聯(lián)用堿化劑與表面活性劑，作為HBs抗原檢測(cè)抑制因素的抗-HBs抗體失活，樣品中HBs抗原的脂雙層內(nèi)部的表位暴露于外部，從而顯著提高其與6G6的反應(yīng)性。
表13陰離子
表14陽(yáng)離子(TAC型)

表15陽(yáng)離子(TAB型)

表16兩性
表17非離子

實(shí)施例127)有堿化劑存在下的蛋白變性劑將溶解于1.0N氫氧化鈉水溶液的30μL蛋白變性劑(脲或鹽酸胍)加入30μL HBs抗原陰性樣品或三份HBs抗原陽(yáng)性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過(guò)5)所述的方法檢驗(yàn)作為檢測(cè)樣品的50μL混合物溶液。表18顯示了各HBs抗原陽(yáng)性樣品的免疫反應(yīng)性。表18所示的氫氧化鈉濃度與蛋白變性劑濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
三份HBs抗原陽(yáng)性樣品顯示在有堿化劑存在下利用蛋白變性劑的免疫反應(yīng)性高于只有堿化劑時(shí)的免疫反應(yīng)性；即，用脲使免疫反應(yīng)性增加至少約8倍，用鹽酸胍使免疫反應(yīng)性增加至少約4.5倍。如果只用堿化劑處理，血清蛋白等在中和時(shí)可能變性從而造成沉淀或者在一些情況中變得混濁，進(jìn)而阻礙了移液過(guò)程，沉淀物往往是得到假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因。由于目標(biāo)抗原摻入這種沉淀物中，也可能降低靈敏度。發(fā)現(xiàn)在處理時(shí)加入濃度為1M或更高的脲或鹽酸胍可顯著減少這種沉淀物形成，在處理時(shí)加入濃度為2-4M的脲與濃度為2-3M的鹽酸胍此作用尤其更好。
表18

實(shí)施例138)有堿化劑存在下檢驗(yàn)還原劑將作為還原劑的二硫蘇糖醇、鹽酸2-巰基乙胺、鹽酸2-二乙基氨基乙硫醇、2-巰基乙醇或鹽酸三(2-羧乙基)膦溶解于1.0N氫氧化鈉，將此30μL溶液加入30μL HBV抗原陰性樣品或三份HBs抗原陽(yáng)性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過(guò)5)所述的方法檢驗(yàn)作為檢測(cè)樣品的50μL混合物溶液(表19)。
本文所用的還原劑濃度是其在樣品處理期間的濃度。甚至通過(guò)加入還原劑，HBV抗原陰性樣品幾乎不顯示信號(hào)有變化，但所有三份HBs抗原陽(yáng)性樣品顯示，分別利用濃度為20mM的鹽酸2-巰基乙胺、鹽酸二乙基氨基乙硫醇與2-巰基乙醇使信號(hào)增加約2-3倍。鹽酸三(2-羧乙基)膦更有效，2mM濃度時(shí)信號(hào)增加1.5倍，10mM時(shí)信號(hào)增加15倍或更多。
表19還原劑

序列表<110>株式會(huì)社先端生命科學(xué)研究所(Advanced Life Science Institute，INC.)<120>乙肝病毒s抗原的檢測(cè)方法<130>SAP-729-PCT<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>55<212>PRT<213>乙肝病毒<400>1Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe1 5 10 15Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr20 25 30Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg35 40 45Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe50 55<210>2<211>27<212>DNA<213>乙肝病毒<400>2gaattcctca caataccaca gagtcta 27<210>3<211>33<212>DNA<213>乙肝病毒<400>3ggatccttaa aaacgccgca gacacatcca gcg3權(quán)利要求
1.一種探針，其識(shí)別位于由對(duì)應(yīng)于乙肝病毒s抗原中26-80位的氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位。
2.一種探針，其識(shí)別位于由SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位。
3.如權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，所述探針能識(shí)別乙肝病毒s抗原并可利用作為抗原的肽而獲得，所述肽由對(duì)應(yīng)于用變性劑變性的乙肝病毒s抗原中26-80位的氨基酸序列或SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成。
4.一種檢測(cè)乙肝病毒或乙肝病毒s抗原的方法，所述方法包括利用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的探針。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法在有變性劑存在下進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述變性劑是表面活性劑。
7.如權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，通過(guò)用含有(1)酸化劑與(2)作為變性劑的表面活性劑和/或蛋白變性劑的處理試劑處理，以使乙肝病毒s抗原解離以及結(jié)合乙肝病毒s抗原的抗體滅活。
8.如權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，通過(guò)用含有(1)堿化劑與(2)作為變性劑的表面活性劑和/或蛋白變性劑的處理試劑處理，以使乙肝病毒s抗原解離以及結(jié)合乙肝病毒s抗原的抗體滅活。
9.如權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，通過(guò)用含有(1)堿化劑與(2)作為變性劑的表面活性劑和/或蛋白變性劑和/或還原劑的處理試劑處理，以使乙肝病毒s抗原解離以及結(jié)合乙肝病毒s抗原的抗體滅活。
10.如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，還利用除乙肝病毒s抗原以外的乙肝病毒抗原的探針。
11.一種用于檢測(cè)乙肝病毒s抗原的試劑，所述試劑包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的探針以及變性劑。
12.一種用于檢測(cè)乙肝病毒s抗原的試劑，所述試劑包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的探針、除乙肝病毒s抗原以外的乙肝病毒抗原的探針以及變性劑。
全文摘要
[問(wèn)題]要提供一種可用于檢測(cè)HBV或HBs抗原的探針，利用此探針能檢測(cè)樣品中可能存在的乙肝病毒(HBV)的逃避突變體；與利用此探針的方法。[解決問(wèn)題的方法]一種探針，其能識(shí)別位于包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的肽上的；以及利用此探針檢測(cè)乙肝病毒或乙肝病毒s抗原的方法。
文檔編號(hào)C07K14/02GK101023098SQ20058003144
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者槇昇, 福田泰之, 木村達(dá)治, 大植千春, 草野修 申請(qǐng)人:株式會(huì)社先端生命科學(xué)研究所