專利名稱：針對(duì)人表皮腫瘤細(xì)胞多藥抗藥性基因的反義核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種針對(duì)人表皮腫瘤多藥抗藥性基因的反義寡聚核苷酸的設(shè)計(jì)、篩選和化學(xué)修飾及其在逆轉(zhuǎn)人腫瘤多藥抗藥性中的應(yīng)用和抗腫瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多藥抗藥性(Multidrug Resistance，即MDR)是制腫瘤細(xì)胞在接觸抗癌藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理不同的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。腫瘤患者在化療過程中往往會(huì)表現(xiàn)出對(duì)這種多藥抗藥性。多藥抗藥性已成為腫瘤化療失敗的主要原因。腫瘤細(xì)胞多藥抗藥性的形成原因很復(fù)雜，但其產(chǎn)生的主要機(jī)理是由于mdr1基因的過量表達(dá)所致。Mdr1基因編碼一種分子量170kDa的P-糖蛋白(P-glycoprotein)，該蛋白位于細(xì)胞膜上，是一種能量依賴型藥物輸出泵，能將化療藥物從癌細(xì)胞中泵出而導(dǎo)致化療失敗。多藥抗藥性現(xiàn)象構(gòu)成臨床化療的一大障礙。為了克服這種多藥抗藥性，很多研究集中在它的逆轉(zhuǎn)劑上，如鈣離子通道阻斷劑，調(diào)鈣蛋白抑制劑、甾類和免疫抑制劑等藥物來破壞或干擾P-糖蛋白的功能，從而達(dá)到增強(qiáng)化療效果的目的。然而，這些藥物由于其抑制多藥抗藥性的能力有限，加上其毒副作用較高而無法推廣應(yīng)用。近年來隨著反義技術(shù)的興起，利用反義核酸來針對(duì)這一現(xiàn)象中的關(guān)鍵蛋白——P-糖蛋白進(jìn)行調(diào)控為克服這一難題帶來了希望。反義核酸作為藥物是基于通過互補(bǔ)序列能特異性地與靶mRNA或單鏈DNA結(jié)合而調(diào)控靶基因的表達(dá)，即所謂的反義策略。這是一類在基因水平調(diào)控的理想治療藥物(Cooney M，Czemuszewiez G，Postel E，H，et al，Science，241，456-459，1988)。然而反義核酸在實(shí)際的臨床應(yīng)用中還存在許多亟待解決的問題如反義核酸在體內(nèi)和胞內(nèi)的穩(wěn)定性、反義核酸與靶序列結(jié)合的穩(wěn)定性、細(xì)胞通透性和毒副作用等(Diasio R，B，Zhang R，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，7(3)，239-243，1997)。
編碼的mdr1基因有一個(gè)由4017個(gè)堿基組成的開放閱讀框架，從理論上分析，可作為調(diào)控對(duì)象的位點(diǎn)很多，但實(shí)際上不可能對(duì)所有位點(diǎn)加以考察。從已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的工作來看。較有效的調(diào)控區(qū)域大多集中在翻譯起始區(qū)(Liu C，Qureshi，A，Ding X，J，et al.J.Clinical Science，91，93-99，1996)，也有以成環(huán)區(qū)作為調(diào)控靶點(diǎn)。而Ho(Ho S，P，Britton D，H，O，Stone B，A，et al.Nucleic Acid Res.24，1901～1912，1996)等認(rèn)為選擇mRNA上易接近位點(diǎn)作為反義核酸的靶點(diǎn)較為有效，并用RNaseH酶切寡聚核苷酸庫與mdr1基因mRNA形成的雜交鏈，對(duì)mRNA上的易接近位點(diǎn)進(jìn)行定位。根據(jù)這些報(bào)導(dǎo)，我們合成了對(duì)應(yīng)于翻譯起始區(qū)和成環(huán)區(qū)和ATP結(jié)合位點(diǎn)的9段寡聚核苷酸，并考察了它們的抑制效果。
本發(fā)明在培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出對(duì)mdr1基因特異的反義核酸，設(shè)計(jì)其結(jié)合于mdr1基因的翻譯起始區(qū)和成環(huán)區(qū)和ATP結(jié)合位點(diǎn)，顯示出對(duì)mdr1基因表達(dá)的P-糖蛋白的抑制，目前研究顯示，其可抑制腫瘤生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所闡述的反義寡聚核苷酸藥物，其寡聚核苷酸的堿基排列順序與人腫瘤多藥抗藥性基因的一段序列互補(bǔ)，這些反義寡聚核苷酸藥物在細(xì)胞內(nèi)特異地與人腫瘤多藥抗藥性基因的翻譯起始區(qū)、成環(huán)區(qū)、ATP結(jié)合部位雜交，從而阻止多藥抗藥性基因編碼P-糖蛋白表達(dá)，達(dá)到逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥抗藥性目的。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了一系列可以結(jié)合于mdr1基因的不同區(qū)域的反義核酸分子，在培養(yǎng)細(xì)胞中篩選對(duì)mdr1基因表達(dá)特異性抑制的反義核酸，培養(yǎng)細(xì)胞采用具有很強(qiáng)多藥抗藥性的人表皮癌細(xì)胞KB-A-1細(xì)胞，設(shè)陰性對(duì)照AMDR00一個(gè)，陽性對(duì)照AMDR01(Anna，A，F(xiàn)，Dimitri，S，S，et al Biochemical Pharmacology，60，83-90，2000)、AMDR02(陳良安，劉又寧，中華醫(yī)學(xué)雜志，80，219-221，2000)兩個(gè)，所有進(jìn)行篩選的反義核酸長(zhǎng)度為15～20個(gè)核苷酸堿基，篩選結(jié)果表明，其中九個(gè)反義核酸均有不同程度的抑制KB-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)的特征，將它們分別定名為AMDR10、AMDR11、AMDR12、AMDR13、AMDR14、AMDR15、AMDR16、AMDR17、AMDR18、，其中AMDR12具有最高的抑制KB-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)的活性。
具有抑制人表皮癌細(xì)胞KB-A-1生長(zhǎng)活性的AMDR系列反義核酸堿基組成和序列如下所示AMDR105`-CAAGATCCATCCCGACC-3`17mer
AMDR115`-GTCCCCTTCAAGATCCAT-3` 18merAMDR125`-TCCTCCATTGCGGTCCCCTT-3`20merAMDR135`-ATCCCGACCTCGCGCTCCTT-3`20merAMDR145`-AAAGAATACAGTGAG-3` 15merAMDR155`-GCATCAGCTGGACTGTTGTG-3`20merAMDR165`-GGATCTTGGGGTTGCGAACC-3`20merAMDR175`-GGAGGATCTTGGGGTTGCGA-3`20merAMDR185`-GCAGGAGGATCTTGGGGTTC-3`20mer設(shè)立陽性對(duì)照兩個(gè)，是AMDR01和AMDR02，其序列如下所示AMDR015`-ATCCATCCCGACCTC-3`15merAMDR025`-CCATCCCGACCTCGCGCTCC-3` 20mer設(shè)立陰性對(duì)照一個(gè)，是MDR00，其序列如下所示AMDR005`-AAGGGGACCGCAATGGAGGA-3` 20mer以上所設(shè)計(jì)的反義核酸攻擊的目標(biāo)是人體腫瘤細(xì)胞多藥抗藥性基因-mdr1基因，這些反義核酸可以和mdr1基因特異結(jié)合，阻止mdr1基因大量表達(dá)P-糖蛋白，從而使P-糖蛋白的藥物泵作用難以發(fā)揮。
本發(fā)明所篩選出的反義核酸片段對(duì)抑制人表皮腫瘤細(xì)胞多藥抗藥性基因-mdr1的表達(dá)有明顯的作用，能夠發(fā)展為具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤藥物?？梢詫⒈景l(fā)明的反義核酸與藥用載體結(jié)合，用于動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物和人)。所用的藥用載體可為磷酸鹽緩沖液(pH7.4)以及其它常用的載體和緩沖液。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了一系列可以結(jié)合于mdr1基因的不同區(qū)域的反義核酸分子，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)篩選出具有特異性抑制人表皮腫瘤細(xì)胞多藥抗藥性基因-mdr1的表達(dá)的反義核酸片段。能夠發(fā)展為具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤藥物。所用的藥用載體可為磷酸鹽緩沖液(pH7.4)以及其它常用的載體和緩沖液。


圖1是不同作用靶點(diǎn)的反義核酸對(duì)KB-A-1細(xì)胞多藥抗藥性的抑制
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述。所舉之例并不限制本發(fā)明保護(hù)范圍。
實(shí)施例1MTT法篩選抑制具有多藥抗藥性的人表皮腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的反義核酸。
選用人表皮腫瘤多藥抗藥性細(xì)胞KB-A-1作為篩選實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株。將實(shí)驗(yàn)分為空白無處理組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、反義核酸處理組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KB-A-1細(xì)胞104個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml，用含10％小牛血清和1μg/ml阿霉素的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5％CO2及飽和濕度下培養(yǎng)至接近長(zhǎng)滿時(shí)，換成無血清培養(yǎng)液，分別加入1.0μM的各組反義核酸和20μg/ml的脂質(zhì)體，處理24小時(shí)，然后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)三天，用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)程度。以空白組數(shù)值為100％，作細(xì)胞生長(zhǎng)抑制圖(如圖1所示)。
圖1中淺色柱體代表針對(duì)mdr1基因的陽性對(duì)照反義核酸結(jié)果，黑色柱體代表陰性對(duì)照反義核酸結(jié)果，其余白色柱體代表AMDR系列反義核酸結(jié)果，可以看出，所設(shè)計(jì)的反義核酸對(duì)KB-A-1細(xì)胞生長(zhǎng)均有一定程度的抑制作用，其中AMDR12抑制程度最高。
實(shí)施例2含反義核酸的藥物組合物作為動(dòng)物體內(nèi)給藥的反義核酸或藥物組合物的組成如下反義核酸 3mg/ml一水合磷酸一氫鈉 1.73mg/ml七水合磷酸二氫鈉 14.33mg/ml氯化鈉 4.4mg/ml注射水 適量也可以用反義核酸 3mg/ml氯化鈉 4.4mg/ml注射水 適量本發(fā)明的反義核酸就采用上面兩種配方。
權(quán)利要求
1.一種反義寡聚核苷酸，其特征在于可特異性結(jié)合人腫瘤多藥抗藥性基因的不同區(qū)域，所述反義寡聚核苷酸序列選自1)位于翻譯起始區(qū)5`-CAAGATCCATCCCGACC-3`2)位于翻譯起始區(qū)5`-GTCCCCTTCAAGATCCAT-3`3)位于翻譯起始區(qū)5`-TCCTCCATTGCGGTCCCCTT-3`4)位于翻譯起始區(qū)5`-ATCCCGACCTCGCGCTCCTT-3`5)位于成環(huán)區(qū)5`-AAAGAATACAGTGAG-3`6)位于ATP結(jié)合位點(diǎn)5`-GCATCAGCTGGACTGTTGTG-3`7)位于ATP結(jié)合位點(diǎn)5`-GGATCTTGGGGTTGCGAACC-3`8)位于ATP結(jié)合位點(diǎn)5`-GGAGGATCTTGGGGTTGCGA-3`9)位于ATP結(jié)合位點(diǎn)5`-GCAGGAGGATCTTGGGGTTC-3`
2.如權(quán)利要求書1所述的反義寡聚核苷酸用于抑制腫瘤細(xì)胞多藥抗性。
3.如權(quán)利要求書1所述的反義寡聚核苷酸用于抗腫瘤反義核酸藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)、篩選系列特異的反義核酸，其堿基排列順序與人表皮腫瘤細(xì)胞的多藥抗藥性基因(mdr1基因)的一段序列互補(bǔ)。這些寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)能特異地與多藥抗藥性基因的一段結(jié)合，從而阻止多藥抗藥性基因編碼的P－糖蛋白的表達(dá)，達(dá)到逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥抗藥性。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1544454SQ200310108809
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者魏東芝, 任宇紅, 錢江潮 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)