專利名稱：禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗藥性基因型的分型檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種禾谷鐮孢菌多菌靈抗性菌株基因型的分子檢測(cè)和SNP分型方法， 可用于苯并咪唑類殺菌劑(多菌靈)抗性禾谷鐮孢菌的診斷和抗藥性病原群體發(fā)展動(dòng)態(tài)監(jiān) 測(cè)，進(jìn)行不同抗藥性水平的小麥赤霉病流行預(yù)測(cè)；并且能夠進(jìn)行SNP分型，為抗藥性治理提 供分子水平的理論依據(jù)。
背景技術(shù)：
小麥赤霉病是由禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum Schwabe引起的一種世界性 病害，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。長期以來采用苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的 復(fù)配劑進(jìn)行化學(xué)防治。苯并咪唑類殺菌劑作為一類高效、廣譜內(nèi)吸性殺菌劑在生產(chǎn)上應(yīng)用， 解決了保護(hù)性殺菌劑的環(huán)境毒性問題，提高了人類控制該病害的能力。苯并咪唑類殺菌劑 包括多菌靈、苯菌靈、噻菌靈、硫菌靈等。這些殺菌劑具有相同的抗菌譜和抗菌機(jī)制，他們 也具有相同的抗藥性機(jī)制，相互之間存在正交互抗藥性。由于這類藥劑的高度專化性，作 用位點(diǎn)單一，加上施用頻率高，使用多年后許多植物病原真菌群體中就會(huì)出現(xiàn)抗藥性優(yōu)勢(shì) 生理小種，使藥劑防治完全失去效果。經(jīng)過近幾年的努力，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑實(shí)驗(yàn)室研 究發(fā)現(xiàn)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈的抗藥性菌株主要是由于禾谷鐮孢菌β 2-微管蛋白基因 (FGSG_06611. 3)突變?cè)斐桑摶蚓幋a第167位、198位、200位氨基酸密碼子的突變均可引 起該菌對(duì)多菌靈抗性的產(chǎn)生。已知編碼167位氨基酸密碼子突變是病原菌產(chǎn)生田間抗藥性 的主要原因，占所有突變類型總量的97%以上，表現(xiàn)中等水平抗藥性；編碼198位氨基酸密 碼子突變約占抗藥性基因型的0. 5%左右，變現(xiàn)高水平抗藥性；編碼200位氨基酸密碼子突 變的抗藥性水平與167位突變類似。發(fā)明人已經(jīng)研究證明因病原菌在自然界的數(shù)量巨大，在禾谷鐮孢菌群體中抗藥性 個(gè)體的比例達(dá)到3% 5%和適宜發(fā)病的環(huán)境條件下，即可發(fā)生抗藥性小麥赤霉病流行，使 藥劑防治失敗。傳統(tǒng)的抗性檢測(cè)方法是根據(jù)藥劑不同劑量對(duì)菌絲生長的抑制效應(yīng)來鑒別 的，耗時(shí)長，測(cè)定抗藥性水平的工作量更大，無法早期預(yù)測(cè)抗藥性病害流行。本發(fā)明在抗 藥性機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)β 2-微管蛋白基因點(diǎn)突變類型與抗藥性水平的相關(guān)性，應(yīng) 用Tetra-primer ARMSPCR技術(shù)檢測(cè)禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性。 Tetra-primer ARMSPCR技術(shù)較等位基因特異性PCR更為準(zhǔn)確，外引物作為陽性對(duì)照，內(nèi)引 物能特異地?cái)U(kuò)增不同基因型產(chǎn)物。因此，本發(fā)明具有的突出優(yōu)點(diǎn)是(1)準(zhǔn)確性高。通過內(nèi) 外兩對(duì)引物擴(kuò)增DNA特異性片段，可以防止可能的假陽性。⑵能夠診斷抗藥性菌株的基因 突變類型，判斷抗藥性水平，為抗性治理提供依據(jù)；(3)抗性檢測(cè)耗時(shí)短，僅需6小時(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種禾谷鐮孢菌多菌靈抗性菌株基因型的快速 診斷和分子檢測(cè)方法。本發(fā)明是在研究禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗藥性機(jī)制并已知存在三種基 因點(diǎn)突變類型的基礎(chǔ)上，首次研發(fā)的Tetra-primer ARMS PCR技術(shù)。根據(jù)抗藥性菌株可能的基因突變機(jī)制，使用三組引物快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)小麥赤霉病菌多菌靈抗性亞群體，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到95％0以上，對(duì)及時(shí)采取科學(xué)有效的措施控制當(dāng)季抗藥性病害流行，具有實(shí)用價(jià)值。[o005] 技術(shù)方案13 2一微管蛋白基因(FGSG一06611．3)作為禾谷鐮孢菌抗多菌靈的檢測(cè)基因，其編碼第167位、第198位、第200位氨基酸的密碼子發(fā)生點(diǎn)突變作為分子檢測(cè)的依據(jù)(表1)。
禾谷鐮孢菌多菌靈抗性基因型的分型檢測(cè)方法共分三步
第二步運(yùn)用三組引物對(duì)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得三組PCR產(chǎn)物。
]于Teera-prim(c ARMS P(R技術(shù)檢測(cè)的引物具有特異性，該引物對(duì)能對(duì)p，一微管蛋盾t 167位、。[98位、200位點(diǎn)突變進(jìn)行特異性識(shí)別(表1)。
(二1)擴(kuò)增禾谷鐮孢菌p，一微管蛋白基因片斷包含167位密碼子的特異性引物對(duì)
F-(’ut 1675’ GACCAC(．FTCAGGGTTTCCAG(．FGACG(3’[OOl 2] R-c’ut 1675’ GATCGGCGTACGAAGGATCGGCGAT(．FT 3’
F-inl671’5’ GTTCCCCGATCGCATGATGGCCA(．TTT 3’[oo 1 4] R-i n 1 6 7A5’ GAAAC(‘FTGGGCGAGGGCATAACGGGAT 3’
F-c’ut 1985’ AG(．FCGTTGAGGAAGCCATTGATGTT 3’
R-(’ut 1985’ CATGTTAACAGCGAG(．TTTCGCAGAT 3’
F-inl98A5’ GAACCAG(‘FCGTCGAGAACTC‘FGCCA 3’
R-inl98G5’ GAGC(．FCGTTATCGATACAGAAGGTAT(3’
⑧擴(kuò)增禾谷鐮孢菌p，一微管蛋白基因片斷包含200位密碼子的特異性引物對(duì)
F-c’ut2005’ ACAAC．FGGGCCAAGGGTCATTACAC(3’
R-(’ut2005’ AAGTCGGGGGAACGGAATCATGTTAAC3’
F-in2001’5’ CCAG(．FCGTCGAGAA(TC．FGACGAGA(．FTT 3’
R-in200A5’ ‘FCGTACAGAGCC．FCGTTATCGATACGGT 3’
P(R反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序
(1)包含167位密碼子的基因片段擴(kuò)增
P(R bui’fer(10X)2．5>I+
cINTP(2．5mMaCh)2>I+
Mg(l，(25mM)1．5>I+
F-c’utl67．／’R-(’utl67(10 u M)各o．2 u l
]了一inl67I’(10 u M)o．5>I+
R—inl67A(10 u M)o．8 u l
cIHo．O(滅菌蒸餾水)15．1>I+
Tac3(5U／’ L)o．2>I+
DNA模板2．O>I+
總體積25 1a i+
擴(kuò)增條件
預(yù)變性94℃5min
J
變性94℃15s
退火66℃30s
延伸72℃30s
35個(gè)循環(huán)
J
延伸72℃5min
(2)包含198位密碼子的基因片段擴(kuò)增
反應(yīng)體系
PCR buffer(10×)2．5 13 L
dN／P(2．5mM each)2 13 L
MgCl，(25mM)1．5 u L
F—outl98／R—outl98(10 13 M)各0．4 13 l
F—inl98A(10 13 M)0．15 u L
R—inl98G(10 13 M)0．4 13 l
dH，0(滅菌蒸餾水)15．45 u L
／aq(5u／13 L)0．2 13 L
DNA模板2．0 u L[0059]一一
總體積25 u L
擴(kuò)增條件
預(yù)變性94℃5min
J
變性94℃15s
退火65℃30s
延伸72℃30s
35個(gè)循環(huán)
J
延伸72℃5min
(3)包含200位密碼子的基因片段擴(kuò)增
反應(yīng)體系
PCR buffer(10×)2．5 13 L
dN／P(2．5mM each)2 13 L
MgCl，(25mM)1．5 u L
F—out200／R—out200(10 13 M)各0．8 13 l
F—in200T(10 13 M)0．5 13 L
R—in200A(10 13 M)0．5 13 l
dH20(滅菌蒸餾水)Taq (5U/ μ L)DNA 模坂_
14. 2μ L 0. 2μ L 2. 0μ L總體積擴(kuò)增條件預(yù)變性94°C5minI變性94°C15s退火55°C30s延伸72°C30s35個(gè)循環(huán)I延伸72°C5min第三步將獲得的PCR產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳圖譜可以準(zhǔn)確鑒定菌株基因型，并以此 判斷菌株抗藥性水平。有益效果本發(fā)明禾谷鐮孢菌多菌靈抗性菌株基因型的分子檢測(cè)和SNP分型方法， 與現(xiàn)有技術(shù)相比1.目前國內(nèi)外研究單位均采用菌絲生長法檢測(cè)禾谷鐮孢菌抗藥性，但該方法涉及 采樣、分離培養(yǎng)需要3 5天和室內(nèi)大量的藥劑敏感性測(cè)定實(shí)驗(yàn)至少要6天，周期較長。同 時(shí)每個(gè)菌株需要在包括對(duì)照在內(nèi)的6個(gè)系列藥劑濃度處理下進(jìn)行測(cè)定和統(tǒng)計(jì)分析，才能判 斷其抗藥性水平。此外，還會(huì)因工作量過大或藥劑配置誤差等原因造成準(zhǔn)確性下降。目前 尚未有成熟的抗多菌靈小麥赤霉病菌分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用。因此，Tetra-primer ARMS PCR技 術(shù)的研究應(yīng)用填補(bǔ)了這一空白，能夠在發(fā)病前期進(jìn)行檢測(cè)，為及時(shí)采取合理的防治策略贏 得時(shí)間。2.由于測(cè)定菌株抗藥性水平的工作量過大，傳統(tǒng)的抗藥性檢測(cè)方法常用鑒別劑量 進(jìn)行檢測(cè)。這種方法只能區(qū)分抗藥性菌株和敏感菌株，不能確定抗藥性水平，更無法知道其 抗藥性突變的基因型。本發(fā)明對(duì)位于β2-微管蛋白基因第167位、第198位、第200位密 碼子進(jìn)行SNP分型，能夠準(zhǔn)確診斷抗藥性突變的類型和判斷抗藥性水平，為科學(xué)采用抗藥 性治理技術(shù)提供理論依據(jù)。
四

圖ITetra-primerARMS-PCR檢測(cè)β 2_微管蛋白基因第167位密碼子點(diǎn)突變基因 型的電泳2Tetra-primerARMS-PCR檢測(cè)β 2_微管蛋白基因第198位密碼子點(diǎn)突變基因 型的電泳3Tetra-primerARMS-PCR檢測(cè)β 2_微管蛋白基因第200位密碼子點(diǎn)突變基因 型的電泳圖五、具體實(shí)施案例
實(shí)施例1、檢測(cè)第167位密碼子發(fā)生點(diǎn)突變的基因型菌株(167位)提取菌株ZF-43，ZF-21，ZF-52，R9基因組DNA，用擴(kuò)增禾谷鐮孢菌β 2-微管蛋白 基因包含167位密碼子DNA片段的特異性引物擴(kuò)增對(duì)F-outl67 5' GACCACCTTCAGGGTTTCCAGCTGACGC 3'R-out167 5' GATCGGCGTACGAAGGATCGGCGATCTT 3'F-inl67T 5' GTTCCCCGATCGCATGATGGCCACTTT 3'R-inl67A 5' GAAACCTTGGGCGAGGGCATAACGGGAT 3'25 μ 1 PCR 體系中含 DNA 模板2μ 1，2· 5μ 1 10 X buffer, 2 μ 1 dNTP (2. 5mM each), 1. 5μ 1 MgC12 (25mM), F-outl67/R-outl67 (10 μ Μ)各 0. 2 μ 1，F(xiàn)_inl67T (10 μ Μ) 0. 5 μ 1， R-inl67A(10yM)0. 8μ 1, TaqDNA 聚合酶 1U(大連寶生物，Takara)。反應(yīng)在 PTC-200(Bio-rad,Inc.)上進(jìn)行，反應(yīng)條件-MV 5min ；94°C 15s，66°C 30s, 72°C 30s，35 個(gè) 循環(huán)；72°C5min;4°C保存。取8μ1 PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖TBE膠上電泳，紫外觀察拍照得 到電泳圖譜(圖1)。檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期一致，所有菌株都得到一條292bp的參照片段，敏感菌株(ZF-43， ZF-21)擴(kuò)增得到一條201bp特異性片段，中抗菌株(ZF-52，R9)擴(kuò)增得到一條146bp的特 異性片段。實(shí)施例2、檢測(cè)第198位密碼子發(fā)生點(diǎn)突變的基因型菌株(198位)提取菌株ZF43，ZF-21，J2，ZF43-6基因組DNA，用擴(kuò)增禾谷鐮孢菌β 2-微管蛋白 基因包含198位密碼子DNA片段的特異性引物擴(kuò)增對(duì)F-OUt198 5' AGCTCGTTGAGGAAGCCATTGATGTT 3'R-out198 5' CATGTTAACAGCGAGCTTTCGCAGAT 3'F-inl98A 5' GAACCAGCTCGTCGAGAACTCTGCCA 3'R-inl98G 5' GAGCCTCGTTATCGATACAGAAGGTATC 3'25 μ 1 PCR 體系中含 DNA 模板2μ 1，2· 5μ 1 10 X buffer, 2 μ 1 dNTP (2. 5mM each), 1. 5μ 1 MgC12(25mM), F_outl98/R-outl98 (10 μ Μ)各 0.4 μ 1，F(xiàn)_inl98A (10 μ Μ) 0· 15 μ 1， R-inl98G0. 4 μ 1，TaqDNA 聚合酶 IU (大連寶生物，Takara)。反應(yīng)在 PTC-200 (Bio-rad，Inc.) 上進(jìn)行，反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 15s，65°C 30s, 72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 5min ;4°C保 存。取8μ1 PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖TBE膠上電泳，紫外觀察拍照得到電泳圖譜(圖2)。檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期一致，所有菌株都得到一條440bp的參照片段，敏感菌株(ZF-43， ZF-21)擴(kuò)增得到一條288bp特異性片段，高抗菌株(J2，ZF43-6)擴(kuò)增得到一條206bp的特 異性片段。實(shí)施例3、檢測(cè)第200位密碼子發(fā)生點(diǎn)突變的基因型菌株(200位)提取菌株ZF43，ZF-21，NT_7，tl基因組DNA，用擴(kuò)增禾谷鐮孢菌β 2-微管蛋白基 因包含200位密碼子的DNA片段特異性引物擴(kuò)增對(duì)F-out200 5' ACAACTGGGCCAAGGGTCATTACACC 3'R-out200 5' AAGTCGGGGGAACGGAATCATGTTAAC 3'F-in200T 5' CCAGCTCGTCGAGAACTCTGACGAGACTTT 3'R-in200A 5' TCGTACAGAGCCTCGTTATCGATACGGT 3'25 μ 1 PCR 體系中含 DNA 模板2μ 1，2· 5μ 1 10 X buffer, 2 μ 1 dNTP (2. 5mM each),1. 5 μ 1 MgCl2 (25mM)，F(xiàn)-out200/R-out200 (10 μ Μ)各 0· 8 μ 1，F(xiàn)_in200T/R-in200A (10 μ Μ) 各 0.5μ1，TaqDNA 聚合酶 IU (大連寶生物，Takara)。反應(yīng)在 PTC-200 (Bio_rad，Inc.)上 進(jìn)行，反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 15s，55°C 30s, 72°C 30s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C 5min ；4°C保存。 取8μ1 PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖TBE膠上電泳，紫外觀察拍照得到電泳圖譜(圖3)。檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期一致，所有菌株都得到一條494bp的參照片段，敏感菌株(ZF-43， ZF-21)擴(kuò)增得到一條221bp特異性片段，中抗菌株(NT-7，tl)擴(kuò)增得到一條331bp的特異 性片段。表1禾谷鐮孢菌來源、對(duì)多菌靈抗性表型及抗藥性表型與基因型的關(guān)系
對(duì)多菌靈的敏感性菌株名稱菌株來源165166密碼子位點(diǎn) 167 198199200敏感(mbcs)zf-43,zf-21浙江省gccacctttgagaccttc中抗(mbcmr)zf-52,r9浙江省gccacc10tgagaccttc中抗(mbcmr)nt-7,tl江蘇省GCCACCTTTGAGACC調(diào)C26]高抗(MBChr)J2, zf-43-6* 江蘇省GCCACCTTT|a|agACCTTC *ZF-43_6為誘導(dǎo)抗性菌株。
權(quán)利要求
禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)多菌靈抗性菌株基因型的分子檢測(cè)和分型方法，其特征在于采用Tetra primer ARMS PCR(Tetra primer Amplification Refractory Mutation System PCR)技術(shù)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出田間具有多菌靈抗性基因的抗藥性禾谷鐮孢菌菌株，并對(duì)抗藥性基因進(jìn)行SNP分型。禾谷鐮孢菌具有抗多菌靈基因的菌株檢測(cè)方法，共分三步第一步采用常規(guī)的苯酚·氯仿·異戊醇法，分別提取待測(cè)樣品的核基因組DNA。第二步運(yùn)用三組引物對(duì)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得三組PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序(1)氨基酸167位擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR buffer(10×)2.5μLdNTP(2.5mM each)2μLMgCl2(25mM) 1.5μLF out167/R out167(10μM)各0.2μlF in167T(10μM) 0.5μLR in167A(10μM) 0.8μldH2O(滅菌蒸餾水)15.1μLTaq(5U/μL) 0.2μLDNA模板 2.0μL 總體積 25μL擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃5min ↓變性94℃ 15s退火66℃ 30s延伸72℃ 30s35個(gè)循環(huán) ↓延伸72℃ 5min(2)氨基酸198位擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR buffer(10×)2.5μLdNTP(2.5mM each)2μLMgCl2(25mM) 1.5μLF out198/R out198(10μM)各0.4μlF in198A(10μM) 0.15μLR in198G(10μM) 0.4μldH2O(滅菌蒸餾水)15.45μLTaq(5U/μL) 0.2μLDNA模板 2.0μL 總體積 25μL擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃5min ↓變性94℃ 15s退火65℃ 30s延伸72℃ 30s35個(gè)循環(huán) ↓延伸72℃ 5min(3)氨基酸200位擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR buffer(10×) 2.5μLdNTP(2.5mM each) 2μLMgCl2(25mM)1.5μLF out200/R out200(10μM) 各0.8μlF in200T(10μM)0.5μLR in200A(10μM)0.5μldH2O(滅菌蒸餾水) 14.2μLTaq(5U/μL)0.2μLDNA模板2.0μL 總體積 25μL擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃5min ↓變性94℃ 15s退火55℃30s延伸72℃30s35個(gè)循環(huán)↓延伸72℃5min第三步將獲得的PCR產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳圖譜可以準(zhǔn)確鑒定菌株基因型，并以此判斷菌株抗藥性水平。
2. 5μ L 2μ L 1. 5μ L 各 0· 4μ 1 0. 15 μ L 0. 4μ 1 15. 45 μ LTaq (5U/ μ L)0. 2 μ LDNA 模板2. 0 μ L總體積25 μ L擴(kuò)增條件預(yù)變性94°C 5min變性94°C15s退火65°C30s延伸72°C30s 35個(gè)循環(huán)延伸72°C 5min (3)氨基酸200位擴(kuò)增 反應(yīng)體系PCR buffer (IOX)2. 5 μ LdNTP(2. 5mM each)2 μ LMgCl2 (25mM)1. 5μ LF-out200/R-out200(10μ Μ) 各 0. 8 μ 1F-in200T(10yM)0. 5 μ LR-in200A(10yM)0. 5 μ 1dH20(滅菌蒸餾水)14. 2yLTaq (5U/ μ L)0. 2 μ LDNA 模板2. 0 μ L總體積25 μ L擴(kuò)增條件預(yù)變性94°C 5min變性94°C 退火55°C 延伸72°C 35個(gè)循環(huán)I延伸72°C 5min第三步將獲得的PCR產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳圖譜可以準(zhǔn)確鑒定菌株基因型，并以此判斷 菌株抗藥性水平。2.根據(jù)權(quán)利要求1，禾谷鐮孢菌群體中多菌靈抗性菌株基因型的分子檢測(cè)和SNP分型 方法其特征在于用于Tetra-primer ARMS PCR技術(shù)檢測(cè)的引物具有特異性，該引物特異性識(shí)別β 2-微管蛋白第167位、第198位、第200位密碼子發(fā)生的點(diǎn)突變①擴(kuò)增禾谷鐮孢菌β2-微管蛋白基因片斷167位特異性引物對(duì) F-out167 5' GACCACCTTCAGGGTTTCCAGCTGACGC 3'R-out167 5' GATCGGCGTACGAAGGATCGGCGATCTT 3' F-inl67T 5' GTTCCCCGATCGCATGATGGCCACTTT 3' R-inl67A 5' GAAACCTTGGGCGAGGGCATAACGGGAT 3'②擴(kuò)增禾谷鐮孢菌β2-微管蛋白基因片斷198位特異性引物對(duì) F-out198 5' AGCTCGTTGAGGAAGCCATTGATGTT 3'R-out198 5' CATGTTAACAGCGAGCTTTCGCAGAT 3' F-inl98A 5' GAACCAGCTCGTCGAGAACTCTGCCA 3' R-inl98G 5' GAGCCTCGTTATCGATACAGAAGGTATC 3'③擴(kuò)增禾谷鐮孢菌β2-微管蛋白基因片斷200位特異性引物對(duì) F-out200 5' ACAACTGGGCCAAGGGTCATTACACC 3' R-out200 5' AAGTCGGGGGAACGGAATCATGTTAAC 3' F-in200T 5' CCAGCTCGTCGAGAACTCTGACGAGACTTT 3' R-in200A 5' TCGTACAGAGCCTCGTTATCGATACGGT 3'
全文摘要
本發(fā)明屬于禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)多菌靈抗性基因型的分子檢測(cè)和SNP分型方法，可用于引起小麥赤霉病的禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑抗藥性監(jiān)測(cè)及抗藥性基因型診斷。該檢測(cè)方法共分3個(gè)主要步驟，(1)提取待測(cè)菌株的核基因組DNA；(2)運(yùn)用三組引物對(duì)，進(jìn)行PCR反應(yīng)；(3)根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳圖譜鑒定菌株對(duì)多菌靈抗性的基因型。采用Tetra-primer ARMS PCR(Tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR)技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出禾谷鐮孢菌抗藥性菌株及其基因型，并以此判斷抗藥性水平。檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)95％以上。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101988122SQ20101024707
公開日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者周明國, 王建新, 羅卿權(quán), 陳長軍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)