專(zhuān)利名稱(chēng)：核盤(pán)菌群體中抗藥性基因頻率的高通量實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種核盤(pán)菌群體中抗藥性基因頻率的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，可用于監(jiān)測(cè)苯 唑類(lèi)殺菌劑抗性核 盤(pán)菌群體發(fā)展動(dòng)態(tài)，進(jìn)行抗藥性油菜菌核病的流行預(yù)測(cè)。 二、技術(shù)背褒
油菜菌核病是由核盤(pán)菌&&rotfn'a sc/mtftorum(Lib.) de Bay引起的一種世界性病害，嚴(yán)重影響油菜 的產(chǎn)紫和品質(zhì)，長(zhǎng)期以來(lái)采用苯并味唑類(lèi)殺菌劑或以這類(lèi)藥劑為主的復(fù)配劑進(jìn)行化學(xué)防治。苯并味唑 類(lèi)殺菌劑作為一類(lèi)高效、廣譜內(nèi)吸性殺菌劑在生產(chǎn)上應(yīng)用，解決了保護(hù)性殺菌劑的環(huán)境毒性問(wèn)題，提 髙了人類(lèi)控制該病害的能力。苯并咪唑類(lèi)殺菌劑包括多菌靈、苯菌靈、噻菌靈、硫竄靈等。這些殺菌 劑具有相同的抗菌譜和抗菌機(jī)制，他們也具有相同的抗藥性機(jī)制，相互之間存在正交互抗藥性。由于 這類(lèi)藥劑的商度專(zhuān)化性，作用位點(diǎn)單一，加上施用頻率離，使用2~3年后許多植物病原真菌群體中就 會(huì)出現(xiàn)抗藥性?xún)?yōu)勢(shì)生理小種，使藥劑防治完全失去效果。近年研究證明，核盤(pán)菌對(duì)多菌靈的抗藥性產(chǎn) 生是因?yàn)榧?xì)胞中P-微管蛋白基因發(fā)生突變，使編碼的蛋A質(zhì)二維構(gòu)象和電性分布改變，從而失去了與 藥劑分子的親和性。&魂管蛋白基因編碼198或200位氨基酸的密碼子發(fā)生點(diǎn)突變是導(dǎo)致大多數(shù)病原 菌產(chǎn)生田間抗藥性的主要原因。
由亍病原菌在自然界的數(shù)量巨大，抗藥性個(gè)體在群體中的比例很低時(shí)(1%~5%)即可引起抗藥性病害 流行，使藥劑防治失敗，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法霈要分離培養(yǎng)病原菌，然后在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再根據(jù)藥劑對(duì) 齒絲生長(zhǎng)的效應(yīng)鑒別抗藥性，這種對(duì)藥劑的敏感性測(cè)定方法通常霜要幾周時(shí)間，工作量大，測(cè)定樣本數(shù)量 有限，抗藥性基閔頻率在1%以下時(shí)難以發(fā)現(xiàn)。因此，傳統(tǒng)的抗藥性監(jiān)擁方法只能核實(shí)藥劑防治失敗是否 由于抗藥性造成，不能早期預(yù)醬。早期檢測(cè)病原群體中抗藥性生理小種航藥性基閉的頻率，及早實(shí)施抗 藥性治理策略和實(shí)施早期預(yù)警，是抗藥性治理最有效的措施。在抗藥性機(jī)制研究基礎(chǔ)上，根據(jù)基芮點(diǎn)突變 的原理，應(yīng)用常規(guī)的核黢技術(shù)如ASO"PCR技術(shù)等檢測(cè)病原真菌對(duì)多菌靈等苯并咪嗖類(lèi)殺菌劑的抗藥性， 則能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)樣本，但一個(gè)PCR反應(yīng)體系只能檢測(cè)一個(gè)菌株對(duì)多菌靈殺菌剤的敏感性，而且也只 能在整個(gè)PCR反應(yīng)體系結(jié)束之后通過(guò)電泳檢測(cè)獲得所擁定的單個(gè)菌株對(duì)多菌靈敏感性。實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time qu旭titotive PCR) ^則改變了病原菌對(duì)殺菌劑敏感性的檢測(cè)只錄單個(gè)樣本進(jìn)行檢翻， 它具有(1)檢測(cè)的高通量，即在一個(gè)腿體系中，可以對(duì)所有待檢樣品對(duì)殺菌劑的敏感性翻定(2〉檢 糖結(jié)果的實(shí)時(shí)性，在PCR反應(yīng)進(jìn)行中可以了解樣品中抗藥性菌株亞群體的大小(3)離效性，經(jīng)典的平 皿法、常規(guī)的ASOuPCR^術(shù)測(cè)定抗藥性菌株只能進(jìn)行單個(gè)對(duì)殺苗劑的敏感性的M定，而這種方法則同
時(shí)對(duì)燭樣品進(jìn)行測(cè)定，耗時(shí)僅為6小時(shí)，可以準(zhǔn)確了解當(dāng)年的抗藥性苗tiaE群體發(fā)生、發(fā)展、流行的態(tài)
勢(shì)，有效的指導(dǎo)當(dāng)年用藥，(4)使在早期4^H低頻率的抗苗性基因成為可能，
作者已研究實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time quantitative PCR)方法檢測(cè)抗多菌靈的核盤(pán)菌，包括樣品的 前處理、基閔組DNA的提取、實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容
4技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供核盤(pán)菌抗多菌靈菌株亞群體一種快速檢測(cè)方法。現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)ASO-PCR探針特異性較差，為Real-time PCR進(jìn)行探針的重新設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系優(yōu)化。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件后，實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time quantitative PCR)能在油菜發(fā)病期6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行大量、簡(jiǎn)便的抗藥性亞群體的檢測(cè)，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到95%以上，對(duì)及時(shí)采取有效措施控制當(dāng)季抗藥性病害流行，具有實(shí)用價(jià)值。
技術(shù)方案核盤(pán)菌抗多菌靈的檢測(cè)基因，其e-微管蛋白基因，長(zhǎng)度為1685 bp,相應(yīng)的編碼e-微管蛋白的477個(gè)貧基酸，包含第l訴位筑基酸的抗藥性突變位點(diǎn)Glu(GAG)—Ala(GCG).
一種核盤(pán)糖抗多苗靈的檢菊方法， 一種核盤(pán)菌抗多菌靈的糊方法，共分三步，
第一步:采用常規(guī)的苯酴■氯仿■異戊醇法，分別提取已知抗藥性菌林、敏感性菌抹和待測(cè)樣品的核基因組DNA。
第二步運(yùn)用抗藥性菌抹和核盤(pán)菌菌抹的特異性檢測(cè)引物和SY肌Green I為發(fā)光材料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，分別建立抗藥性菌抹和核盤(pán)菌菌^測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).
核盤(pán)菌群體中抗藥性基因頻率的髙通量實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵是用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物具有特異性，設(shè)計(jì)的依據(jù)是抗藥性菌株在P-微管蛋白第198為由Glu(GAG)—Ala(GCG)。
① 擴(kuò)增核盤(pán)菌P-微管蛋白基因片斷的特異性引物對(duì)
上游引物SclSF: 5， - CTCAAATCTCCGAAAGTT -3'下游引物SclAF: 5， - TGCAGAfGGGTAATATG -3，
② 擴(kuò)增核盤(pán)菌抗藥性基因片段的特異性引物對(duì)
上游引物RFP4: 5， -TGGTCGAGAACTCTGACAC-3,
下游引物RRP: 5， -TTCAAACGGTATAATGGGC-3，實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time quantitative PCR)反應(yīng)體系及其擴(kuò)增程序(1)核盤(pán)酋總量檢擁的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)腿體系，
dH20 (滅菌蒸餾水) 9jjLSYBRa/^iwicficrag (2x) 12單SclSF(10)iM) 0'25mLSclAF(10(iM) 0.25mLROX Reference Dye (50X) 0.5|iL
DNA植板_2.0nL
總體積 25jiL
rw綠
預(yù)變性95°C 10s變性951C 5s
5退火55.8" 31s40個(gè)循環(huán)
延伸72"C 5minDissociation protocol 58*C(2)抗性核盤(pán)苗量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)反應(yīng)體系，
dH20 (滅菌蒸餾水) 9jiLSYBR* i>>ie iix及21^ (2 X ) 12.5jiLRFP4(10pM) 0.25jjLRRPUOmM) 0.25jjLROX Reference Dye (50X) 0.5pL
DNA鄉(xiāng)_2.0uL
總體積 25nL擴(kuò)坩綠
預(yù)變性951 10s
變性95" 5s退火621C 33s40個(gè)循環(huán)
1
延伸72" 5min
Dissociation protocol 58"C第三步待測(cè)樣品分別運(yùn)用上述兩種特異性引物進(jìn)行相應(yīng)的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增M進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，根據(jù)已經(jīng)建立好的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出相應(yīng)的抗藥性菌林和敏感性菌林的數(shù)量和抗藥性菌^Mt核盤(pán)菌總量中的比例.
有Ji效果本發(fā)明核盤(pán)菌抗多菌靈亞群體的檢測(cè)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，
1.實(shí)時(shí)定JtPCR (Real-tl鵬quantitative POO旅彼了病原菌對(duì)殺飾敏感性的糊只雌行單個(gè)樣本檢翻，與常規(guī)的平JMtt測(cè)和AS(hrcR^^檢l8相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果.
(1) 檢測(cè)的高通量，即在一個(gè)反應(yīng)體系中，可以對(duì)所有待檢樣品對(duì)殺菌劑的敏感性測(cè)定
(2) 檢測(cè)結(jié)果的實(shí)時(shí)性，在PCR反應(yīng)進(jìn)行中可以了解樣品中抗藥性菌株亞群體的大小
(3) 髙效性，經(jīng)典的平皿法、常規(guī)的ASO-PCR等技術(shù)測(cè)定抗藥性菌株只能進(jìn)行單個(gè)對(duì)殺菌劑的敏感性的測(cè)定，而這種方法則同時(shí)對(duì)大量樣品進(jìn)行測(cè)定，耗時(shí)僅為6小時(shí)，可以準(zhǔn)確了解當(dāng)年的抗藥性菌株亞群體發(fā)生、發(fā)展、流行的態(tài)勢(shì)，有效的指導(dǎo)當(dāng)年用藥。
(4) 使在早期檢測(cè)低頻率的抗藥性基因成為可能，(5) 本發(fā)明是國(guó)際上首次對(duì)核盤(pán)菌抗多菌靈的檢測(cè)基因的擴(kuò)增引物引入人為的錯(cuò)配，提高對(duì)抗藥性基因擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增效率，并將獲得的優(yōu)化引物運(yùn)用到實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time quantitativePCR),進(jìn)行抗多菌靈殺菌劑的抗藥性亞群體檢測(cè)
2、 目前國(guó)內(nèi)其他研究單位均采用菌絲生長(zhǎng)法檢測(cè)核盤(pán)菌抗藥性，但該方法涉及采樣、分離培養(yǎng)需要3d和室內(nèi)大量的藥劑敏感性測(cè)定實(shí)驗(yàn)至少要6天，周期較長(zhǎng)。ASO-PCR技術(shù)雖然可以快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)和監(jiān)測(cè)抗藥性菌株，但是每個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)菌株對(duì)多菌靈的敏感性。實(shí)時(shí)定量PCR則可以在一個(gè)反應(yīng)體系里將全部待測(cè)樣品對(duì)多菌靈抗藥性水平檢測(cè)出來(lái)，在PCR反應(yīng)的進(jìn)行中即可知道該反應(yīng)的動(dòng)態(tài)結(jié)果。這種方法具有髙通量、快速、節(jié)本。這對(duì)及時(shí)了解抗藥性病原菌亞群體的發(fā)展動(dòng)態(tài)，及時(shí)、合理地指導(dǎo)科學(xué)用藥，有效治理抗藥性，以及降低成本和減少環(huán)境污染具有現(xiàn)實(shí)意義，
3、 在所測(cè)定的200株核盤(pán)菌中約有38%的菌株對(duì)多菌靈具有抗藥性(表3)，這個(gè)實(shí)時(shí)定量PCR瀏定結(jié)果與
傳統(tǒng)菌落直徑法測(cè)得的結(jié)果(36.9%)相吻合，
四

圖1引物(RFP4、 RRP)濃度為0.2jiM時(shí)的擴(kuò)增圖譜
圖2優(yōu)化后的擴(kuò)增圖譜(引物RFP4、 RRP)
圖3不同濃度模板的定量擴(kuò)增曲線(xiàn)
圖4不同濃度模板的定量擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜
(上圖為引物RFP4、RRP,下圖引物為SclSF、SclAF, 1 6引物濃度分別為1.4X 10-3ng/pL 、 1.4X l(T2ng^L、1.4X1(TVjjL、 1.4ng/nL、 14ng/^L、 140ng/nL)圖5引物對(duì)SclSF、 SclAF的PCR擴(kuò)增條件
圖6弓l物SclSF、 SclAF的定量擴(kuò)增曲線(xiàn)
圖7核盤(pán)菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
圖8引物對(duì)RFP4、 RRP的PCR擴(kuò)增條件
圖9引物RFP4、 RRP的定量擴(kuò)增曲線(xiàn)圖IO抗性核盤(pán)菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖ll引物SclSF、 SclAF擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)圖12引物RFP4、 RRP擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)圖13模板濃度過(guò)髙時(shí)(未稀釋)的擴(kuò)增曲線(xiàn)
五具體實(shí)施例方式
實(shí)維例1、適用于實(shí)時(shí)定量PCR (Raaltim quantitative PCR)特異性引物簾逸.
0-微管蛋白基因l訴位氨基酸由谷氨酸(Glu)突變?yōu)楸彼?Ala)是導(dǎo)致核盤(pán)菌(S. scferoft'orwm)產(chǎn)生對(duì)多菌靈田間抗藥性的主要原因，其相應(yīng)的密碼子由GAG突變?yōu)镚CG,根據(jù)這一點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)了可以擴(kuò)增出抗性核盤(pán)菌特征性條帶的上游ASO特異性引物5，-TGGTCGAGAACTCTGACGC-3，，該引物不能用于實(shí)時(shí)定量PGRttM,因?yàn)樵赹 產(chǎn)物中 二級(jí)結(jié)構(gòu)由于SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料，但它不能選擇特定的DNA模板，所以此法定量就要求弓l物不能形成二聚體，不產(chǎn)生錯(cuò)配。此外，
在本發(fā)明中抗藥性菌株與敏感菌株相比，只在e-微管蛋白基因序列上有一個(gè)堿基發(fā)生了改變(A—C),因
此就給引物的設(shè)計(jì)增添了更大的難度。在PCR反應(yīng)中，弓l物3'末端是弓l發(fā)延伸的關(guān)鍵，理論上3，末端錯(cuò)配，弓l物就不能與模板正確雜交引導(dǎo)序列延伸，PCR反應(yīng)就不能進(jìn)行。然而，在實(shí)際PCR過(guò)程中3'末端錯(cuò)配的引物還是會(huì)擴(kuò)增出條帶，造成了結(jié)果的假陽(yáng)性。為了避免假陽(yáng)性，對(duì)ASCWCR進(jìn)行了改良(K. Hayashi，2004)。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，設(shè)計(jì)了一系列在近3'末端加入人工錯(cuò)配的引物，從中進(jìn)行了特異性引物的篩選。上游引物RFP1 (5，-TGGTCGAGAACTCTGAC(K>3，)
RFP2 (5'-TGGTCGAGAACTCTGACCC-3')
RFP3 (5，-TGGTCGAGAACTCTGAC2t>3，)
鵬4 (5'-TGGTCGAGAACTCTGACSj')
RFP5 (5'-TGGTCGAGAACTCTGAA4C-3，)
RFP6 ( 5，-TGGTCGAGAACTCTGAG4C-3，)
RFP7 (5'-TGGTCGAGAACTCTGAC 7C-3，)
RFP8 (5，誦TGGTCGAGAACTCTGAy4rc-3，)
RFP9 (5'-1001\:0八6^(:7070八17103,)
RFP10 (5，-TGGTCGAGAACTCTO71E403')
RFP11 (5'-TGGTCGAGAACTCTG( G4C-3，)下游引物RRP (5'-TTCAAACGGTATAATGGGC-3，)
篩選的反應(yīng)體系
10 x buffer 5fiL
MgCl2(25mM) 5pL
dNTP U0mM) l^iL
RFP4、 RRP (10pM) 各0.8pL
DNA模板(50jig/mL) 2^L
T叫DNA聚合酶(5U/pL) 0.5pL
dH,O (滅菌蒸餾水)_補(bǔ)充至50uL
總體積篩選的擴(kuò)增條件
預(yù)變性951C
50pL
10min
35個(gè)循環(huán)
延伸72t: 5min4
s s s
5 o o
3 4 4
9 6 7
性火伸
變退延4t:保存
先用以上弓I物分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株JSJ2 (對(duì)多菌靈敏感菌株，釆自江蘇省)和JSJ6 (抗多菌靈菌株，采自江蘇)進(jìn)行梯度PCR (52~641C)擴(kuò)增，結(jié)果以引物對(duì)RFP4、 RRP在62TC擴(kuò)增結(jié)果最好，即保證了對(duì)抗性模板DNA的特異性又有較好的擴(kuò)增效率。而其它引物要么不具有對(duì)抗性模板DNA的特異性，要么就因?yàn)榧尤氲娜斯ゅe(cuò)配太多無(wú)法擴(kuò)增出目的片段。用篩選出的引物對(duì)RFP4、 RRP對(duì)其它十二個(gè)不同抗性表型的核盤(pán)菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果證明，RFP4、 RRP只能從抗性核盤(pán)菌株的基因組DNA中擴(kuò)增出條帶，十二個(gè)菌株中的抗性菌株檢出率為100%,對(duì)敏感菌株無(wú)擴(kuò)增.實(shí)旌併2. SYBR Qreen I熒光染料定釁PCR體系優(yōu)化
2.1退火濕度為了保證檢測(cè)的穩(wěn)定性和可靠性，實(shí)驗(yàn)選用了寶生物工程(大連)有限公司的SYBR iV wix fit fag (Perfect Real Time) DRR041S試劑盒。該試劑盒中的酶、M^+、 dNTP等已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，只需加入自己的模板和引物，因此，實(shí)驗(yàn)只對(duì)退火溫度和引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化。
退火mSTm值是反應(yīng)特異性的重要保證，如果退火MS過(guò)低就會(huì)產(chǎn)生4辨異性擴(kuò)增，所以選擇較商的退火^a能夠大大減少引物與模板之間的非特異性結(jié)合，提髙PCR反應(yīng)的特異性，但太髙的退火Mfi又會(huì),擴(kuò)增效率，因此需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中對(duì)引物RFP4、 RRP和SclSF、 SclAF的退火溫度分別以62"和57TC為基礎(chǔ)，以0.3 1C的幅度微調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物RFP4、 RRP在退ikmS為62TC魄抓擴(kuò)增效率高，JiT增信號(hào)納擴(kuò)增曲線(xiàn)平滑，且ARn駄，而未優(yōu)化前，擴(kuò)增信號(hào)Jg^(擴(kuò)增曲線(xiàn)呈鋸齒狀，厶Rn值小。引物SclSF、 SclAF在退火aS為55.81CBm測(cè)結(jié)果旨。
2.2引物泉dt當(dāng)PCR引物濃度太低，則產(chǎn)物量降低，會(huì)出現(xiàn)假陰性，引物濃度過(guò)髙會(huì)促進(jìn)引物的錯(cuò)誤
引導(dǎo)非特異性產(chǎn)物合成,還會(huì)增加引物二聚體的形成，造成假陽(yáng)性或定量誤差。根據(jù)SYBR*1 iSc 3^
(PerfectReal Time)DRR041S試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，發(fā)現(xiàn)由于引物濃度(0.2jiM)太髙，
即使未加模板的陰性水對(duì)照(NTC)在反應(yīng)進(jìn)入35個(gè)循環(huán)后也會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增信號(hào),因此在0.1 0.2jiM
范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度，最終確定引物最佳濃度為O.ljiM。此時(shí)擴(kuò)增效率較離，且基線(xiàn)平整，陰性對(duì)照(NTC)
無(wú)信號(hào)檢出(圖1〉。
在退火溫度和引物濃度優(yōu)化條件下，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖2。
實(shí)施例3 SYBR O關(guān)I熒艦料定JtPCR的靈敏
將菌株JSJ6基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋成10個(gè)梯度140 ng^iL 、 14ng/nL、 1.4ng/i止、1.4X10.VnL、 1.4X10-2ng/nL、 1.4X 10-3ng/nL、 1.4X10"VnL、 1.4X10-ing/nL、 1.4Xl(^ng/!jL、 1.4Xl(r7ng/|jL，分別用兩對(duì)引物定量擴(kuò)增；得到的擴(kuò)增圖譜(圖3)中，當(dāng)模板濃度小于1.4X10—Sng/iiL以后其擴(kuò)增曲線(xiàn)的熒光值低于域值;而產(chǎn)物經(jīng)1.5y魂脂糖凝膠電泳檢測(cè)，當(dāng)模板濃度小于1.4X10-Zng/jiL后無(wú)電泳條帶(圖4)。由此可知，SYBR Green I熒光染料定量PCR可檢測(cè)到的樣本濃度最低值為1.4Xl(r3ng/jiL (每25jiL體系2.8X 10-3吸3.17X 1(^copy)，靈敏度至少是普通PCR檢測(cè)方法的10 100倍。
實(shí)施併4.核盤(pán)苗總量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
將核盤(pán)菌".scferoft'onwi)與其它常見(jiàn)植物病原線(xiàn)狀真菌e-微管蛋白基因通過(guò)BLAST比較，發(fā)現(xiàn)氨基酸水平上同源性較髙，為95.78%~97.66%，但所含內(nèi)含子數(shù)目及大小不同，根據(jù)這一差異設(shè)計(jì)了可以擴(kuò) 增出抗性核盤(pán)菌特征性條帶的下游引物RRP (5'-TTCAAACGGTATAATGGG03,和可以特異性擴(kuò)增核盤(pán) 菌(S.wfeTOrion卵〉片斷的引物對(duì)SclSF(S，- CTCAAATCTCCGAAAGTT -3，)、 SclAF(5，- TGCAGACGGG TAATATG -3，)'
反應(yīng)體系:
擴(kuò)增條件:
dH20 (滅菌蒸餾水) 9jiL SYBR②/V i ir fic Tog (2 X ) 12.5pL SclSF(lO一) 0.25^L SclAF(lOpM) 0.25fiL ROX Reference Dye (50 X ) 0.5iiL DNA樓板_2攀
總體積
預(yù)變性951C
25pL
10s
變性95X: 退火55.8TC 40個(gè)循環(huán)
延伸72" Dissociation protocol
5s 31s
5min 581C
根據(jù)靈敏度實(shí)驗(yàn)中確定的檢測(cè)限，將菌株JSJ6基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋成6個(gè)梯度:140ng/pL 、 14ng/jiL、 L4ng/pL、 1.4X10"ng/jiL、 1.4X 10-2ng/ML、 1.4X 10-3ng/(iL,用引物SclSF、 SclAF擴(kuò)增，得到 的擴(kuò)增圖譜中，可見(jiàn)到的熒光值增加時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)與用于定量的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度成負(fù)相關(guān)性(圖6), 得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖7)為Y="3.41X+27. 30 R2=0.999 (Y:Ct,X:模板質(zhì)量對(duì)數(shù))
實(shí)施倒5.抗性核盤(pán)h的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
反應(yīng)體系:
dH20 (滅菌蒸餾水) 9jiL SYBR* /VBwir ￡r rag (2 X ) 12.5(iL RFP4 ( IOjjM ) 0,25jiL RRP(l(H)M) 0.25pL ROX Reference Dye (50X) 0單 DNA樓板_2攀
總體積
10擴(kuò)增條件(兩步法，圖8)
預(yù)變性95"C 10s
變性95TC 5s 退火621C 33s 40個(gè)循環(huán)
延伸72XJ 5min
Dissociation protocol 58X1 用引物RFP4、RRP擴(kuò)增菌株JSJ6基因組DNA6個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，得到的擴(kuò)增圖譜中，可見(jiàn)到的 熒光值增加時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)與用于定量的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度成負(fù)相關(guān)性(圖9)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖IO) 為Y=~3.45X+25.60 R2=0. 998 (Y: Ct, X:模板質(zhì)量對(duì)數(shù))
實(shí)施例6.定懸POH的格解曲線(xiàn)
從熔解曲線(xiàn)分析定量PCR體系反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物可知弓|物SclSF、 SclAF擴(kuò)增得到的產(chǎn)物的熔解 溫度(Tm)為83,8TC (圖11);引物RFP4、 RRP擴(kuò)增得到的產(chǎn)物的熔解溫度為85.21C (圖12):波峰髙 低與模板濃度成正相關(guān)性基線(xiàn)平穩(wěn)，只有一個(gè)熔解峰，證明無(wú)引物二聚體產(chǎn)生和非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物特 異性好，
實(shí)施例7 2004^Ql蘇省通州市油mJ:的核盤(pán)菌對(duì)多菌靈抗蓊性的快速m
將采集回來(lái)的每株油菜莖桿中的菌核精確稱(chēng)取15.00mg, —起混勻(共200個(gè)菌株)，提取(李紅霞， 陸悅健，周明國(guó)，王曉峰.油菜菌核病菌P-微管蛋白基因與多菌靈抗藥性相關(guān)突變的研究.中國(guó)油料作物學(xué) 報(bào),2003,25(2):56-60.)基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)檢查濃度，并將其稀釋致140ng/nL~1.4Xl(T3ng/nL 之間(此時(shí)結(jié)果的線(xiàn)性關(guān)系最好，當(dāng)模板濃度太大時(shí)，SYBR Green I會(huì)在反應(yīng)初始階段就與模板結(jié)合，造 成基線(xiàn)上翹，熒光背景過(guò)髙，如圖13)加樣檢測(cè)，以抗性菌株JSJ14提取的基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，敏感菌 株HM3提取的基因組作為陰性對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表l、 2。
從以上結(jié)果可以得出，在所測(cè)定的200株核盤(pán)菌中約有38%的菌株對(duì)多菌靈具有抗藥性(表3),這一
結(jié)果與傳統(tǒng)菌落直徑法測(cè)得的結(jié)果(36.9%)和普通ASOPCR檢測(cè)的結(jié)果(39%)相吻合。 實(shí)施例8 2005 ^tl蘇省句容市油菜茵核病病組^J^多菌靈抗苗性Sff體的^K)iftlN
將2005年采集回來(lái)的病組織，隨機(jī)選擇100個(gè)，在每個(gè)病組織的病健交界處用取樣器取0.2mm直徑 的樣品，混合，加石英沙研磨，提取DNA，用紫外分光光度計(jì)檢査濃度，并將其稀釋致140ng/fiL 1.4X 1(^ng/^L之間，加樣檢測(cè)，以抗性菌株JSJ14提取的基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，敏感菌株HM3提取的基因組 作為陰性對(duì)照，病原菌總量(8.40±0.59) ng,抗藥性亞群體總量為(2.69±0.34) ng,抗藥性病原菌亞群 體占(32.02±0.07)%;采用常規(guī)的方法，將病原菌從所測(cè)定的病組織上分離、培養(yǎng)、PSA平皿測(cè)定病原菌 對(duì)多菌靈的敏感性水平，經(jīng)測(cè)定抗藥性菌株占總體的比例為31%。采用Real-time quantitative PCR方法測(cè) 定的準(zhǔn)確率為96.7%.
11實(shí)旌例9 ^t檢測(cè)田間^的孢^(guò):藥性3EffiM^i!率
將2005年采集回來(lái)的孢子，隨機(jī)分離100個(gè)孢子，培養(yǎng)、PSA平皿測(cè)定病原菌對(duì)多菌靈的敏感性水 平，經(jīng)測(cè)定抗藥性菌株占總體的比例為52%。提取所采集孢子的DNA,用紫外分光光度計(jì)檢查濃度，并 將其稀釋致140ng/pL 1.4Xl(T3ng/^iL之間，加樣檢測(cè)，以抗性菌株JSJ 14提取的基因組作為陽(yáng)性對(duì)照， 敏感菌株HM3提取的基因組作為陰艦照，病原菌總量(9.80±0.67) ng/jjL，抗藥性亞群體總量為(5.21 ±0.51)ng/nL，抗藥性病原菌亞群體占53.16%,采用Real-time quantitative PCR方法測(cè)定的準(zhǔn)確率97.7%。
表l核盤(pán)菌總數(shù)(引物SclSF、 SclAF)的定量結(jié)果
SampleCtStdDevCtQ yStdDevQtyMean Qty
JSJ1425.174.23
JSJ1424.910.185.050.564.42
JSJ1423.263鄰
HM326.421.82
HM323.810,322.740.492.37
HM325.912.36
sample23.939.抑
sample24.030,109.140.669.80
sample23.8310.46
表2抗性核盤(pán)菌(引物RFP4、 RRP)的定fi結(jié)果SampleCtStdDevCtQtyStdDevQlyMean Qty
JSJ1423.384.41
JSJ1423.190.215.000.614.40
JSJ1423.613,78
HM3UndetUndeL
HM3Und汰/Und汰//
HM3UndetUndeL
Sample23.663.65
sample24.190.462.571.083.65
sample23.274.73
表3抗性核盤(pán)菌占群體總數(shù)的量 Table3 Quantification of MB&resJstant&sderotforMn ingoups
SampleAmount of ￡w/ewA'omm 土SE(ng)Amount ofMBG^csistuntFaoentafMBGicsislaitSw&roCiorumiSE (%〉 (95% CL)
JSJ144.42±0.564.40±O6199.41 士0.05 (柳> 51)
HM32.37±0.49Undetected/
smaple9.80 ±0.663.65±1訴36.83 士0訴G6j6S37.01)
權(quán)利要求
1、核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)群體中抗藥性基因頻率的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR)技術(shù)檢測(cè)核盤(pán)菌群體中存在的對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑的抗藥性基因頻率。一種核盤(pán)菌抗多菌靈的檢測(cè)方法，共分三步第一步采用常規(guī)的苯酚·氯仿·異戊醇法，分別提取已知抗藥性菌株、敏感性菌株和待測(cè)樣品的核基因組DNA。第二步運(yùn)用抗藥性菌株和核盤(pán)菌菌株的特異性檢測(cè)引物和SYBR Green I為發(fā)光材料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，分別建立抗藥性菌株和核盤(pán)菌菌株檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR)反應(yīng)體系及其擴(kuò)增程序(1)核盤(pán)菌總量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)反應(yīng)體系dH2O(滅菌蒸餾水) 9μLPremix Ex TaqTM(2×) 12.5μLSclSF(10μM) 0.25μLSclAF(10μM) 0.25μLROX Reference Dye(50×) 0.5μL<u>DNA模板 2.0μI</u>總體積 25μL擴(kuò)增條件預(yù)變性95℃ 10s ↓變性95℃ 5s退火55. 8℃ 31s40個(gè)循環(huán) ↓延伸72℃ 5minDissociation protocol58℃(2)抗性核盤(pán)菌量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)反應(yīng)體系dH2O(滅菌蒸餾水) 9μLPremix Ex TaqTM(2×) 12.5μLRFP4(10μM) 0.25μLRRP(10μM)0.25μLROX Reference Dye(50×) 0.5μL<u>DNA模板2.0μL</u>總體積 25μL擴(kuò)增條件預(yù)變性95℃ 10s ↓變性95℃ 5s退火62℃ 33s40個(gè)循環(huán) ↓延伸72℃ 5minDissociation protocol58℃第三步待測(cè)樣品分別運(yùn)用上述兩種特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，對(duì)照已經(jīng)建立好的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出相應(yīng)的抗藥性菌株和敏感性菌株的數(shù)量和抗藥性菌株在核盤(pán)菌總量中的比例。
2、根據(jù)權(quán)利要求l，核盤(pán)菌群體中抗藥性基因頻率的高通量實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)其特征在于用 于實(shí)時(shí)定量PCR的引物具有特異性。設(shè)計(jì)的依據(jù)是抗藥性菌株在(3-微管蛋白第198為由 Glu(GAG)—Ala(GCG)。① 擴(kuò)增核盤(pán)菌p-微管蛋白基因片斷的特異性引物對(duì)上游引物SclSF: 5， - CTCAAATCTCCGAAAGTT -3， 下游引物SclAF: 5， - TGCAGACGGGTAATATG -3，② 擴(kuò)增核盤(pán)菌抗藥性基因片段的特異性引物對(duì)上游引物RFP4: 5， -TGGTCGAGAACTCTGAC,3， 下游引物RRP: 5， -TTCAAACGGTATAATGGGC-3'
全文摘要
本發(fā)明屬于核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)群體中抗藥性基因頻率的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，可用于引起油菜等作物菌核病的核盤(pán)菌對(duì)多菌靈等苯并咪唑類(lèi)殺菌劑抗藥性監(jiān)測(cè)和流行預(yù)警。該檢測(cè)方法共分3個(gè)主要步驟，第一步分別提取已知抗藥性菌株、敏感性菌株和待測(cè)樣品的核基因組DNA；第二步運(yùn)用抗藥性菌株和核盤(pán)菌菌株的特異性檢測(cè)引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，分別建立抗藥性菌株和核盤(pán)菌菌株檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；第三步待測(cè)樣品分別運(yùn)用上述兩種特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，對(duì)照已經(jīng)建立好的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出相應(yīng)的抗藥性菌株和敏感性菌株的數(shù)量和抗藥性菌株在核盤(pán)菌總量中的比例。采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR)技術(shù)可以高通量、快速、準(zhǔn)確定量測(cè)出田間抗藥性核盤(pán)菌的數(shù)量及其在病原群體中的比例，具有高通量的特點(diǎn)。比常規(guī)的生物測(cè)定和普通的PCR檢測(cè)抗藥性菌株省時(shí)、節(jié)本、快速。直接從田間采集回來(lái)的菌核、病斑和孢子中提取基因組DNA到實(shí)時(shí)定量-PCR整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需6h，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)96％以上。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101475982SQ20081023508
公開(kāi)日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2008年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日
發(fā)明者周明國(guó), 王建新, 陳長(zhǎng)軍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)