本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種抗體線性表達框，具體涉及一種可以高通量表達單克隆抗體的線性表達框。
背景技術(shù)：
：自20世紀80年代以來，單克隆抗體與基因工程抗體技術(shù)取得了快速的發(fā)展?？贵w技術(shù)經(jīng)歷了鼠源雜交瘤、噬菌體展示抗體文庫技術(shù)、核糖體展示抗體文庫技術(shù)、eb病毒轉(zhuǎn)化b細胞永生化技術(shù)、流式分選單個b細胞技術(shù)(singlecellsorting)等，使得制備抗體的方式呈現(xiàn)多元化，每個方法都在不斷完善相關(guān)技術(shù)細節(jié)，從而使得抗體制備顯得相對容易。目前抗體研究方向已從最初的鼠源抗體轉(zhuǎn)向了人源單克隆抗體和基因工程抗體，從專注于單個抗體的功能到研究整個抗體組學(xué)的相關(guān)信息。同時，隨著晶體衍射和冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，抗體的抗原識別位點和抗體-抗原復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)也成為目前研究的一個熱點。此外，現(xiàn)階段大量抗體藥物的上市，治療型抗體也成為一個快速發(fā)展的行業(yè)?；蚬こ炭贵w技術(shù)都需要對抗體基因進行克隆和表達，并從海量的待選抗體中篩選出功能特異的目標抗體。高通量構(gòu)建抗體表達系統(tǒng)和抗體的高通量表達是實現(xiàn)高通量篩選的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的抗體表達需要將抗體基因克隆到真核表達載體中，然后將真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到宿主細胞中進行抗體的表達。每個抗體需根據(jù)抗體可變區(qū)的序列設(shè)計兩對獨特引物，pcr擴增輕鏈和重鏈基因，切膠回收基因片段后經(jīng)特異性酶切位點與表達載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌。然后挑取單個菌落測序，篩選陽性重組克隆，再制備質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染細胞表達抗體。此過程是一個完整的分子克隆，步驟繁瑣，耗時較長，無法實現(xiàn)高通量操作。由于前期篩選的抗體或者單個b細胞的特異性不高，有活性的目的抗體的數(shù)量只占全部表達抗體很少的一部分。這使得目的抗體的獲得不但費時費力，而且試劑耗材消耗量巨大，前期成本比較大，且實驗成功率較低。綜上所述，目前制備抗體的方法較多，且比較成熟。而抗體的高通量表達和篩選技術(shù)非常單一，從出現(xiàn)基因工程抗體以來，似乎從來沒有出現(xiàn)過革命性的變革。不但步驟繁瑣、耗時耗力，而且成本很高，最主要是無法實現(xiàn)抗體高通量的表達和篩選，成為制約抗體技術(shù)發(fā)展的瓶頸。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)抗體快速少量表達的線性表達框，以滿足對抗體快速高通量表達以及前期初篩的需求。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體線性表達框，所述抗體線性表達框包括順次連接的以下幾個表達元件：翻譯啟動子、抗體信號肽編碼序列、抗體重鏈可變區(qū)編碼序列、連接區(qū)編碼序列、抗體輕鏈可變區(qū)編碼序列、終止子。進一步，所述翻譯啟動子可以是選自組成型啟動子、組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子、響應(yīng)于生理信號的啟動子或可調(diào)節(jié)啟動子中的任意一種，只要可以啟動抗體表達的啟動子即可。適用于控制抗體編碼序列表達的組成型啟動子的實例包括但不限于雞r一肌動蛋白(cb)或來自其他種類的r肌動蛋白啟動子、人巨細胞病毒(cmv)啟動子、猿猴病毒40(sv40)的早期和晚期啟動子、u6啟動子、金屬硫蛋白啟動子、efla啟動子、泛素啟動子、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hprt)啟動子、二氫葉酸還原酶(dhfr)啟動子，腺苷脫氨酶啟動子、磷酸甘油激酶(pgk)啟動子、丙酮酸激酶啟動子、磷酸甘油變位酶啟動子、p-肌動蛋白啟動子、單純疽疹病毒的胸普激酶啟動子以及本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的其他組成型啟動子。其他啟動子可以包括例如人巨細胞病毒(cmv)立即-早期增強子/啟動子、sv40早期增強子/啟動子、jc多瘤病毒啟動子、髓磷脂堿性蛋白((mbp)或神經(jīng)膠質(zhì)元纖維酸性蛋白(gfap)啟動子、單純疤疹病毒(hsv-1)潛伏相關(guān)啟動子((lap)、勞氏肉瘤病毒(rsv)長末端重復(fù)序列(ltr)啟動子、神經(jīng)元特異性啟動子((nse)、血小板衍生生長因子(pdgf)啟動子、hsyn、黑素濃集激素((mch)啟動子、cba、神經(jīng)膠質(zhì)元纖維酸性蛋白(gfap)啟動子、基質(zhì)金屬蛋白啟動子((mpp)、以及雞p-肌動蛋白啟動子。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述翻譯啟動子是cmv立即-早期增強子/啟動子，序列如seqidno.1所示。進一步，所述抗體信號肽的序列是抗體翻譯過程中的前導(dǎo)序列，mrna轉(zhuǎn)錄完成以后，信號肽在核糖體上首先被翻譯出來，然后結(jié)合信號肽識別顆粒，信號肽識別顆粒將核糖體攜帶至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中繼續(xù)翻譯下游的抗體成分。在信號肽的引導(dǎo)下，新合成的抗體蛋白進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔進行翻譯后修飾，而信號肽序列則在信號肽酶作用下被切除?？贵w的信號肽作用如下：1)信號肽能夠引導(dǎo)分泌蛋白或膜蛋白出胞；2)信號肽的疏水核心決定蛋白質(zhì)的分泌效率；3)信號肽能夠引導(dǎo)蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)不同區(qū)域或不同細胞器進行正確的定位；4)信號肽能夠分泌增強子增強外源蛋白的分泌；5)短的信號欣有利于減少表達載體的分子置，提高整合到宿主染色體上外源基因表達盒的。信號肽在抗體分泌表達過程中起著至關(guān)重要的作用，直接影響抗體表達量和翻譯后修飾作用。信號肽對抗體分泌的影響非常巨大，不同的抗體家族(如重鏈的igg1,2,3和輕鏈的kappa和lambda)對各自的信號肽又有不同的偏好。已有大量的關(guān)于某一抗體信號肽對抗體表達量的影響的報道。本發(fā)明選擇的信號肽是一種抗體通用型信號肽，其特點在于對抗體輕重鏈家族沒有選擇性，能夠最大限度的將所有目標抗體攜帶進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行翻譯后修飾。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述抗體信號肽編碼序列如seqidno.2所示。進一步，所述連接區(qū)的長度和氨基酸的組成沒有特別限制，只要其能使抗體重、輕鏈可變區(qū)自由折疊，使抗原結(jié)合位點處于適當(dāng)?shù)臉?gòu)型，并不引起分子動力學(xué)改變即可。通常，連接區(qū)不影響或不顯著影響重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)氨基酸序列形成正確的折疊和空間構(gòu)象；或者，連接區(qū)構(gòu)成了重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)之間的柔性連接而有利于它們的正常折疊。本發(fā)明的連接區(qū)的序列可以選自：經(jīng)典的(g4s)3的15個氨基酸的linker、18個氨基酸的linker、7個氨基酸的短linker。有研究表明，單鏈t細胞受體(stcr)的scfv構(gòu)建時采用較長的linker可以克服mhc的限制，帶有融合蛋白的scfv也適合使用23，25或29個氨基酸長linker。目前，在免疫球蛋白超家族scfv設(shè)計時，是否有標準的linker尚無定論。本發(fā)明的具體實施方案中選用的linker為噬菌體展示載體中的linker序列，該連接序列較短，其有效性和活性在噬菌體展示技術(shù)中得到了充分的驗證，也為現(xiàn)階段表達scfv抗體常用的連接區(qū)。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述連接區(qū)的編碼序列如seqidno.3所示。所述連接區(qū)序列如seqidno.17所示。進一步，所述終止子可以選自：常用的bgh-poly(a)，該終止序列在大多數(shù)真核表達載體中適用。本發(fā)明的bgh-poly(a)選自invitrogen公司的pcdnatm5/frt載體，該載體是目前最常用的真核表達載體。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述終止子序列是bgh-poly(a)，序列如seqidno.4所示。進一步，本發(fā)明的抗體線性表達框還可以包括有利于抗體檢測的標簽序列，標簽序列包括但不限于c-myc標簽、6xhis標簽，ha標簽，flag標簽。在本發(fā)明的具體實施方案中，使用了c-myc標簽和6xhis標簽，所述標簽序列連接于抗體輕鏈可變區(qū)編碼序列與bgh-poly(a)序列之間。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，所述表達載體包括前面所述的抗體線性表達框。所述表達載體的構(gòu)建方法：將本發(fā)明的抗體線性表達框可操作地連于載體上。所述載體包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的在哺乳細胞中用的載體，在原核細胞中的載體，在昆蟲細胞中的桿狀病毒載體和在酵母細胞中的載體。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞被轉(zhuǎn)染了前面所述的抗體線性表達框或前面所述的表達載體。所述宿主細胞可以分泌表達抗體。適用于本發(fā)明的宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞，或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；果蠅s2或sf9的昆蟲細胞；cho,cos,293細胞、或bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述宿主細胞是293細胞。將dna序列高效地轉(zhuǎn)染入宿主細胞中所用方法包括但不限于：脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法等。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含前面所述的抗體線性表達框，或包含前面所述的表達載體?？梢詫⒈景l(fā)明的藥物組合物導(dǎo)入體外培養(yǎng)的細胞或者活體動物體內(nèi)特定細胞中使之表達相應(yīng)抗體，發(fā)揮基因治療的目的?；铙w動物可以是哺乳動物、胎盤哺乳動物、嚙齒動物(例如豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠)、鼠科動物(例如小鼠)、兔類動物(例如兔)、犬科動物(例如狗)、貓科動物(例如貓)、馬科動物(例如馬)、豬類(例如豬)、羊類(例如羊)、牛類(例如奶牛)、靈長類動物、猿猴(例如猴子或者猿)、猴類(例如絨猴、狒狒)、猿類(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、長臂猿)或者人類。進一步，所述藥物組合物還包含一種或多種對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言為公知的其它藥學(xué)上可接受的成分，該成分包括但不限于藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑、佐劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑。適當(dāng)?shù)妮d體、稀釋劑、賦形劑等可以在標準藥學(xué)書籍中找到。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供了一種制備前面所述的抗體線性表達框的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：(1)構(gòu)建翻譯啟動子與抗體信號肽編碼序列的連接序列；(2)構(gòu)建抗體重鏈可變區(qū)編碼序列、連接區(qū)編碼序列、抗體輕鏈可變區(qū)編碼序列依次連接形成的scfv編碼序列；(3)將步驟(1)獲得的序列與步驟(2)獲得的序列連接；(4)將步驟(3)獲得的序列與終止子連接。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體的制備方法，所述方法包括前面所述的抗體線性表達框的表達。進一步，所述方法包括如下步驟：(1)培養(yǎng)宿主細胞；(2)按照以上步驟構(gòu)建前面所述的抗體線性表達框；(3)將抗體線性表達框?qū)胨拗骷毎员磉_抗體。該方法中使用的宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞，或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；果蠅s2或sf9的昆蟲細胞；cho，cos，293細胞、或bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。本發(fā)明所構(gòu)建的抗體基因線性表達框包含了表達功能性抗體所必需的所有重要原件，包括啟動子、抗體信號肽編碼序列、抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的編碼序列、終止子序列，因此本發(fā)明所建立的抗體表達方法不僅適用于表達人源單克隆抗體，還可用來表達鼠源、馬源、猴源等非人源單克隆抗體。如本文所用，術(shù)語“抗體”指的是單鏈抗體(singlechainfv，scfv)是由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)通過一段連接肽連接而成的重組蛋白，它是具有完全抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。scfv是目前報導(dǎo)最多的一種小分子抗體，是由抗體識別抗原的可變區(qū)fv段組成。scfv由重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)通過連接區(qū)(linker)連接而成。所加的linker很重要，必須不影響scfv的構(gòu)象。如本文所用，術(shù)語“連接區(qū)”(linker)，又可稱為連接肽，指的是位于抗體的重鏈可變區(qū)(或其變異體)與抗體的輕可變區(qū)(或其變異體)之間的、起連接作用的短肽，其能使重、輕鏈可變區(qū)自由折疊，使抗原結(jié)合位點處于適當(dāng)?shù)臉?gòu)型，并不引起分子動力學(xué)改變。通常，連接肽不影響或不顯著影響重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)氨基酸序列形成正確的折疊和空間構(gòu)象；或者，連接肽構(gòu)成了重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)之間的柔性連接而有利于它們的正常折疊。如本文所用，術(shù)語“包括(comprise)”是包括其他組件、元件、整體、步驟等。本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點包括：(1)本發(fā)明抗體表達方法使抗體的表達跳過了傳統(tǒng)的構(gòu)建表達載體的步驟，從pcr產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)染表達宿主，省去了構(gòu)建抗體表達質(zhì)粒的酶切、鏈接、轉(zhuǎn)化、挑單菌落、細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒提取的過程。一方面將抗體表達周期縮短到3天以內(nèi)，另一方面可以進行高通量篩選。(2)本發(fā)明通過選擇抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)建到抗體線性表達框中，將抗體分子中與抗體結(jié)合活性無關(guān)的恒定區(qū)去除，有利于overlappingpcr過程中與其他元件連接。另外，表達出的scfv中抗體的輕、重鏈比例為1：1，避免了在轉(zhuǎn)染過程中輕重鏈比例不恰當(dāng)對表達效果的影響。(3)簡化了表達框的構(gòu)建。只需構(gòu)建一個表達框就可以實現(xiàn)抗體的表達。(4)本發(fā)明是快速少量的表達抗體，適用于對大量目的抗體的初步功能鑒定。例如噬菌體抗體文庫篩選后的大量抗體克隆，流式分選單個b細胞后對大量b細胞內(nèi)抗體基因的表達和篩選。(5)本系統(tǒng)的構(gòu)建需要的條件簡單，消耗的試劑耗材量少，易于大規(guī)模操作和工業(yè)化生產(chǎn)。附圖說明圖1顯示本發(fā)明的抗體線性表達框的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2顯示pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3顯示利用westernbolt檢測scfv表達的電泳圖；圖4顯示利用elisa檢測scfv的抗原結(jié)合活性的統(tǒng)計圖；圖5顯示利用ifa檢測scfv與抗原結(jié)合情況的免疫熒光圖，其中a：scfv與vp1蛋白結(jié)合；b：陽性對照與vp1蛋白結(jié)合；c：scfv與不表達vp1蛋白的正常細胞結(jié)合；圖6顯示pcmx2.51載體結(jié)構(gòu)圖譜。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1抗體線性表達框的構(gòu)建一、表達元件的選擇首先選擇已經(jīng)驗證過的一株人源抗ev71病毒抗體作為目標抗體，通過選擇不同的表達元件(見表1)進行巢式pcr，將各個表達元件依次連接，最終形成一個完整的線性表達框(圖1)。表1線性表達框中的表達元件組成元件名稱簡寫來源核苷酸序列翻譯啟動子pcmvpcmx2.51seqidno.1抗體信號肽編碼序列ig-leadimgtseqidno.2重鏈可變區(qū)編碼序列ervh抗ev71人源抗體seqidno.5輕鏈可變區(qū)編碼序列vk抗ev71人源抗體seqidno.6連接區(qū)編碼序列l(wèi)inker(g4s)3seqidno.3終止子bgh-ppcdna5-frtseqidno.4二、擴增表達元件的引物設(shè)計表2引物設(shè)計三、構(gòu)建步驟1、擴增pcmv-igleader元件依據(jù)pcmx2.51載體(圖6所示)中元件序列設(shè)計cmvigl-f(seqidno.7)和cmvigl-r(seqidno.8)引物，以pcmx2.51載體質(zhì)粒為模板，pcr擴增pcmv和igleader連接在一起的pcmv-igleader元件，序列如seqidno.13所示。extaq試劑盒購自takara公司，貨號為rr001a。pcr反應(yīng)體系如表3所示。表3pcr反應(yīng)體系成分體積(μl)質(zhì)粒模板0.210×exbuffer5dntp4cmvigl-f(10pmol)2cmvigl-r(10pmol)2extaq0.5h2o36.3pcr反應(yīng)條件如表4所示。表4反應(yīng)條件反應(yīng)結(jié)束后，pcr產(chǎn)物過2％瓊脂糖凝膠，回收800bp左右的條帶，即為pcmv-igleader元件，保存?zhèn)溆谩?、擴增scfv表達元件申請人之前已將命名為70d1的抗ev71的人源抗體克隆到pcmx2.51載體中，具體步驟如下：抗ev71抗體的vh基因(seqidno.5)通過ncoⅰ和bsmbⅰ雙酶切位點克隆入pcmx2.51載體，輕鏈的vl基因(seqidno.6)則通過miuⅰ和notⅰ克隆入pcmx2.51載體。重組質(zhì)粒經(jīng)測序篩選出正確的克隆株，制備質(zhì)粒供后續(xù)使用。pcmx2.51載體帶有vh與vl的linker的編碼序列，lineker序列為gsasapkleegefsearv(seqidno.17)。設(shè)計iglvh-f(seqidno.9)和vl-bgh-r(seqidno.10)引物，擴增scfv片段，序列為seqidno.14，長度為879bp。pcr反應(yīng)體系如表5所示。表5反應(yīng)體系成分體積模板(μl)0.210×exbuffer5dntp4iglvh-f(10pmol)2vl-bgh-r(10pmol)2(10pemxotl)aq0.5h2o36.3pcr反應(yīng)條件如表6所示。表6反應(yīng)條件反應(yīng)結(jié)束后，pcr產(chǎn)物過2％瓊脂糖凝膠，回收900bp左右的條帶，即為scfv表達元件(vh-linker-vl)，保存?zhèn)溆谩?、擴增bgh-polya元件bgh-polya來源于pcdnatm5/frtvector，該載體購自invitrogen公司，貨號為：v6010-20。以pcdn5-frt為模板，設(shè)計bgh-f(seqidno.11)和bgh-r引物(seqidno.12)，擴增225bp的bgh-polya元件，序列如seqidno.4所示。pcr反應(yīng)體系如表7所示。表7反應(yīng)體系成分體積(μl)模板0.210×exbuffer5dntp4iglvh-f(10pmol)2vl-bgh-r(10pmol)2extaq0.5h2o36.3pcr反應(yīng)條件如表8所示。表8反應(yīng)條件反應(yīng)結(jié)束后，pcr產(chǎn)物過2％瓊脂糖凝膠，回收200bp左右的條帶，即為bgh-polya元件，保存?zhèn)溆?。三、overlapingpcr分步連接1、pcmv-igleader與scfv連接形成pcmv-l-scfv以上述回收的pcmv-igleader元件和scfv元件為模板，用cmvigl-f為上游引物，vl-bgh-r為下游引物，用overlapingpcr將上述兩個元件連接成一個1662bp的元件，命名為pcmv-l-scfv，序列如seqidno.15所示。pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表9和表10所示。表9反應(yīng)體系成分體積(μl)模板0.210×exbuffer5dntp4cmvigl-f(10pmol)2vl-bgh-r(10pmol)2extaq0.5h2o36.3表10反應(yīng)條件反應(yīng)結(jié)束后，pcr產(chǎn)物過1％瓊脂糖凝膠，回收1600bp左右的條帶，即為pcmv-l-scfv元件，保存?zhèn)溆谩?、pcmv-l-scfv與bgh-polya融合成完整的表達元件，命名為pcmv-l-scfv-bgh-polya以回收純化的pcmv-l-scfv元件和bgh-polya元件為模板，以cmvigl-f和bgh-r為引物，擴增整個表達元件，總長度為1887bp，序列如seqidno.16所示。pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表11和表12所示。表11反應(yīng)條件成分體積(μl)模板0.2+0.210×exbuffer5dntp4primer-f(10pmol2primer)-r(10pmol2e)xtaq0.5h2o36.1表12反應(yīng)條件反應(yīng)結(jié)束后，一部分pcr產(chǎn)物過1％瓊脂糖凝膠，回收1800bp左右的條帶，即為pcm-l-scfv-bgh-polya。一部分pcr產(chǎn)物用乙醇沉淀后溶于depc水中，用nanodrop測定濃度用于轉(zhuǎn)染293t細胞。四、結(jié)果反應(yīng)結(jié)束后，上述pcr產(chǎn)物過1％瓊脂糖凝膠的結(jié)果如圖2所示，圖2中m代表marker、1代表pcmv-igleader，2代表scfv，3代表bgh-polya，4代表pcmv-l-scfv，5代表pcmv-l-scfv-bgh-polya。實施例2抗體線性表達框表達抗體1、瞬時轉(zhuǎn)染293t細胞復(fù)蘇293t細胞，用dmem+10％fbs培養(yǎng)基將293t細胞傳2-3代后，將細胞轉(zhuǎn)移到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞密度達70％-90％的時候，用pei將實施例1構(gòu)建的線性表達框瞬時轉(zhuǎn)染至293t細胞中。將線性表達框中的scfv元件克隆到真核表達載體pcdna3.0(pcdna3.0-scfv)上作為陽性對照轉(zhuǎn)染293t細胞。將轉(zhuǎn)染真核表達載體pcdna3.0作為陰性對照轉(zhuǎn)染293t細胞。具體操作步驟如下：將50ng純化的線性表達框或100ng的真核表達質(zhì)粒加入20μl的opti-mem中，輕輕混勻后再加入1μl0.5g/l的pei，再次混勻后室溫靜置5min。之前將96孔板中細胞培養(yǎng)液棄去，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細胞中，37℃孵育4h后，每孔再加入200μl細胞培養(yǎng)基，37℃5％co2培養(yǎng)72h后取細胞上清進行抗體活性檢測。2、檢測scfv抗體表達收集表達上清，加入5×loadingbuffer，100℃煮5min，然后進行sds-page，電泳結(jié)束后凝膠中的蛋白樣品經(jīng)iblot干轉(zhuǎn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)印至pvdf膜中，5％脫脂牛奶封閉2h，加入1:1000稀釋的hrp標記的抗6×his抗體，37℃孵育2h，pbst洗3次后用dab顯色。結(jié)果如圖3所示，觀察到有一約40kd的明顯條帶(箭頭所指的條件)，即為表達后的scfv片段，圖3中m代表蛋白marker，1代表scfv表達上清，2代表陰性對照。3、scfv抗體活性檢測本發(fā)明分別用elisa法和間接免疫熒光(ifa)分別檢測scfv的活性，該scfv是針對ev71病毒vp1蛋白的。在此之前發(fā)明人已經(jīng)分別表達純化了ev71病毒原核表達的vp1蛋白(參見文獻：張黎，包林，金秋，etal.腸道病毒71型重組vp1蛋白的原核表達及初步鑒定[j].prokaryoticexpressionandpreliminarycharacterizationofrecombinantenterovirus71vp1protein,2):15-8)，并同時構(gòu)建了在sf9昆蟲細胞中表達的桿狀病毒表達系統(tǒng)(參見文獻：孫麗娜，張黎，張福順，etal.人源抗ev71病毒基因工程抗體的研究[j].generationofrecombinanthumanantibodiesforev71virus,3):161-3)。(1)elisa將純化的vp1蛋白按200ng/孔的量4℃過夜包被elisa板，次日取出后用5％脫脂牛奶封閉2h。然后加入細胞表達上清，細胞表達上清從1:100倍開始倍比稀釋。稀釋完成以后放于37℃1h，然后洗板機洗滌，加入1:3000的hrp標記的抗人his抗體，37℃孵育1h，再次取出洗滌后用tmb顯色液顯色，讀取od450nm的吸光度值。結(jié)果：如圖4所示，本發(fā)明線性表達框表達出的scfv抗體比含有scfv的真核表達載體表達出的scfv抗體對vp1蛋白的抗原結(jié)合活性更強。圖4中pc代表陽性對照，nc代表陰性對照。(2)間接免疫熒光(ifa)ifa檢測scfv抗體與真核表達的ev71vp1蛋白的結(jié)合。構(gòu)建含有vp1基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒，該質(zhì)粒與線性化的桿狀病毒同源重組成有感染性的環(huán)形桿狀病毒，重組桿狀病毒即可感染正常的sf9細胞，具體操作見baculovirusexpressionvectorsystem手冊(bdbioseiencespharmingen，usa)。重組桿狀病毒在sf9細胞中連續(xù)傳代增加毒力，選取毒力強的代數(shù)感染正常的sf9細胞，72h后收集細胞懸液，洗滌以后用丙酮固定于載玻片上。將scfv的表達上清原液滴加于載玻片上，37℃孵育30min，洗滌5min后，加入用伊文斯藍稀釋的fitc標記的抗his抗體，37℃孵育30min，再洗滌5min后，置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。用pcdna3.0載體表達的scfv抗體作為陽性對照，用線性框表達的scfv與不表達vp1蛋白的正常細胞反應(yīng)作為陰性對照。結(jié)果：如圖5所示，線性表達框表達的scfv抗體能夠與sf9表達的vp1蛋白結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性的綠色熒光。上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。sequencelisting<110>江蘇省疾病預(yù)防控制中心<120>一種高通量表達單克隆抗體的線性表達框<160>17<170>patentinversion3.5<210>1<211>616<212>dna<213>巨細胞病毒<400>1acattgattattgagtagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc60atatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaa120cgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggac180tttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatca240agtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctg300gcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacggtta360gtcatcgctattaccatagtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcgg420tttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgg480caccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatg540ggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctttctggctaactagagaa600cccactgcttactggc616<210>2<211>167<212>dna<213>人源<400>2acgtggaaattaattaaacgccgccaacatgggatggagctgtatcatcctcttcttggt60agcaacagctacaggtaaggggttaacagtagcaggcttgaggtctggacatatatatgg120gtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggcgcgcactcc167<210>3<211>54<212>dna<213>人源<400>3gggagtgcatccgccccaaagcttgaagaaggtgaattttcagaagcacgcgta54<210>4<211>225<212>dna<213>牛<400>4ctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccc60tggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtc120tgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggatt180gggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg225<210>5<211>363<212>dna<213>人源<400>5caggtgcagctgcaggagtcggggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctgggttcaccttcagtagctatgctatgcactgggtccgccaggct120ccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactac180gcagactccgtgaagggccgatttaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtattactgtgcgagatccgga300ttacgatttttggagtggtcacctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcc360tca363<210>6<211>333<212>dna<213>人源<400>6cagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatc60tcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtaccagcag120cttccaggaacagcccccaaactcctcatctatggtaacagcaatcggccctcaggggtc180cctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctc240cggtccgaggatgaggctaaatattactgtgcagcatgggatgacaggatggctggtatt300gtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctc333<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7acattgattattgagtagttatt23<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<400>8ggagtgcgcgcctgtggagagaaag25<210>9<211>51<212>dna<213>人工序列<400>9gcctttctctccacaggcgcgcactcccaggtgcagctgcaggagtcgggg51<210>10<211>43<212>dna<213>人工序列<400>10ggctggcaactagaaggcacagctatgcggccccattcagatc43<210>11<211>49<212>dna<213>人工序列<400>11atggggccgcatagctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgc49<210>12<211>33<212>dna<213>人工序列<400>12ccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgc33<210>13<211>783<212>dna<213>人工序列<400>13acattgattattgagtagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc60atatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaa120cgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggac180tttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatca240agtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctg300gcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacggtta360gtcatcgctattaccatagtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcgg420tttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgg480caccaaaatcaacggg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