專利名稱：馬鈴薯病毒rna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種馬鈴薯病毒RNA的提取方法。
植物RNA的提取技術(shù)主要有兩條路線。(1)異硫氰酸胍法。此方法適用于富含RNA酶的組織或核質(zhì)不易分開的組織，但較為昂貴，不適合生產(chǎn)應(yīng)用。(2)苯酚法。此方法的提取工藝雖較異硫氰酸胍法簡單、經(jīng)濟(jì)，但操作流程仍然十分的繁瑣，即玻璃器皿需在180℃下至少烘烤8小時，不耐高溫的離心管、微量移液器吸頭、實(shí)驗(yàn)用水均用DEPC處理。因此，RNA提取成本仍然較高，很難在生產(chǎn)上廣泛使用。以上原因使目前用RT-PCR方法檢測馬鈴薯病毒受到了限制。
本發(fā)明包括以下步驟1)將馬鈴薯莖或葉片組織放入冰預(yù)冷的滅菌勻漿器或研缽中，研磨成勻漿；2)向勻漿中加入提取緩沖液(Tris-HCl pH8.0 100mmol/L，NaCl 100mmol/L，EDTA10mmol/L)和β-巰基乙醇，在離心管中振蕩混勻；3)加入水飽和酚，氯仿/異戊醇(49∶1，體積比)，充分混勻，冰浴中放置10分鐘，其間混勻2～3次；4)以10000轉(zhuǎn)/分室溫離心15分鐘，吸取水相，加入0.1倍體積的NaAc(3mol/L，pH5.2)和等體積的異丙醇，混勻，在-20℃中沉淀3小時；5)以11000轉(zhuǎn)/分室溫離心20分鐘后，棄去上清，加冰預(yù)冷70％的乙醇洗滌沉淀2次，室溫風(fēng)干，至乙醇揮發(fā)完全為止；
6)用無菌雙蒸水充分溶解提取的RNA，測OD值，計(jì)算RNA濃度。
本發(fā)明中使用的玻璃器皿不需要180℃高溫烘烤8小時，不耐高溫的器皿不需要用DEPC處理和實(shí)驗(yàn)用水不需要DEPC處理，只需高壓滅菌。與傳統(tǒng)的RNA提取方法相比，本發(fā)明在準(zhǔn)備工作中，省去了對器皿的高溫烘烤或DEPC處理，省去了對實(shí)驗(yàn)用水的DEPC處理。并且以冰予冷的勻漿器或研缽代替在液氮中研磨，以普通高速離心機(jī)代替冰凍高速離心機(jī)。以上的改進(jìn)，簡化了提取步驟，降低了成本，為生產(chǎn)上使用RT-PCR方法檢測馬鈴薯病毒奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明提取的馬鈴薯病毒RNA純度較高，含糖和酚類等小分子雜質(zhì)較少，可以為RT-PCR檢測提供有效的模板。
圖2馬鈴薯S病毒擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。
2、向勻漿中加入1ml RNA提取緩沖液(Tris-HCl pH8.0 100mmol/L，NaCl100mmol/L，EDTA 10mmol/L)和8μlβ-巰基乙醇，在離心管中振蕩混勻。
3、加入1ml水飽和酚，1ml氯仿/異戊醇(49∶1，v/v)，充分混勻，冰浴中放置10分鐘，其間混勻2～3次。
4、臺式高速離心機(jī)10000轉(zhuǎn)/分，室溫離心15分鐘。吸取水相，水相中加入0.1倍體積的NaAc(3mol/L，pH5.2)和等體積的異丙醇，混勻。在-20℃中沉淀3小時。
5、臺式高速離心機(jī)11000轉(zhuǎn)/分，室溫離心20分鐘后，棄去上清。加600μl冰預(yù)冷70％的乙醇洗滌沉淀2次，室溫風(fēng)干，至乙醇揮發(fā)完全為止。
6、用50μl無菌雙蒸水充分溶解提取的RNA，測OD值，計(jì)算RNA濃度。
采用本發(fā)明(簡稱簡約法)提取馬鈴薯病毒RNA，用經(jīng)典苯酚提取法提取馬鈴薯病毒RNA作為對照，用以上兩種方法提取的馬鈴薯病毒RNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。同時用簡約法提取未染病組織的病毒RNA作為陰性對照，RT-PCR結(jié)果如

圖1圖1馬鈴薯Y病毒擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖中的四個泳道分別為1分子量標(biāo)準(zhǔn)；2經(jīng)典苯酚提取法提取馬鈴薯Y病毒RNA，以它為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到病毒特異擴(kuò)增的目的片段；3簡約法提取馬鈴薯Y病毒RNA，以它為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到病毒特異擴(kuò)增的目的片段；
4健康馬鈴薯葉片組織RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。未見擴(kuò)增的目的片段。
將本發(fā)明得到的病毒特異擴(kuò)增目的片段進(jìn)行測序鑒定。測序結(jié)果證明，擴(kuò)增出的目的片段確實(shí)來自馬鈴薯Y病毒RNA，從而證明了本發(fā)明提取馬鈴薯病毒RNA的可靠性。從電泳結(jié)果可以看出，用上述兩種方法提取的馬鈴薯病毒RNA制備的模板，均可用于RT-PCR檢測。由于簡約法具有快速、簡便、可靠、成本低等優(yōu)勢，因此，可廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中馬鈴薯病毒的檢測。
實(shí)施例2以天津市蔬菜所提供的帶有馬鈴薯S病毒的馬鈴薯葉片為材料，采用實(shí)施例1的操作步驟簡約法提取馬鈴薯病毒RNA，用經(jīng)典苯酚提取法提取馬鈴薯病毒RNA作為對照，用以上兩種方法提取的馬鈴薯病毒RNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。同時用簡約法提取未染病組織的病毒RNA作為陰性對照，RT-PCR結(jié)果如下(圖2)圖2馬鈴薯S病毒擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖中的四個泳道分別為1分子量標(biāo)準(zhǔn)；2經(jīng)典苯酚提取法提取馬鈴薯S病毒RNA，以它為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到病毒特異擴(kuò)增的目的片段；3新方法提取馬鈴薯S病毒RNA，以它為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到病毒特異擴(kuò)增的目的片段；4健康馬鈴薯葉片組織RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。未見特異擴(kuò)增的目的片段；將本發(fā)明得到的病毒特異擴(kuò)增目的片段進(jìn)行測序鑒定。測序結(jié)果證明，擴(kuò)增出的目的片段確實(shí)來自馬鈴薯S病毒RNA，從而證明了本發(fā)明提取馬鈴薯病毒RNA的可靠性。從電泳結(jié)果可以看出，用上述兩種方法提取的馬鈴薯病毒RNA制備的模板，均可用于RT-PCR檢測。
權(quán)利要求
1.一種馬鈴薯病毒RNA的提取方法，其特征在于它包括以下步驟1)將馬鈴薯莖或葉片組織放入冰預(yù)冷的滅菌勻漿器或研缽中，研磨成勻漿；2)向勻漿中加入提取緩沖液Tris-HCl pH8.0 100mmol/L、NaCl 100mmol/L、EDTA10mmol/L和β-巰基乙醇，在離心管中振蕩混勻；3)加入水飽和酚，氯仿/異戊醇(體積比，49∶1)，充分混勻，冰浴中放置10分鐘，其間混勻2～3次；4)以10000轉(zhuǎn)/分，室溫離心15分鐘，吸取水相，水相中加入0.1倍體積的NaAc，3mol/L，pH5.2，和等體積的異丙醇，混勻，在-20℃中沉淀3小時；5)以11000轉(zhuǎn)/分，室溫離心20分鐘后，棄去上清，加冰預(yù)冷70％的乙醇洗滌沉淀2次，室溫風(fēng)干，至乙醇揮發(fā)完全為止；6)用無菌雙蒸水充分溶解提取的RNA，測OD值，計(jì)算RNA濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種馬鈴薯病毒RNA的提取方法。它包括將馬鈴薯莖或葉片組織放入冰預(yù)冷的滅菌勻漿器或研缽中研磨成勻漿，加入提取緩沖液(Tris－HCl pH8.0100mmol/L，NaCl 100mmol/L，EDTA 10mmol/L)和β－巰基乙醇，混勻，加入水飽和酚，氯仿/異戊醇，室溫離心，水相中加入NaAc(3mol/L，pH5.2)和等體積的異丙醇，－20℃中沉淀3小時；70％的乙醇洗滌沉淀，用無菌雙蒸水充分溶解等步驟。本發(fā)明省去了對器皿的高溫烘烤或DEPC處理，實(shí)驗(yàn)用蒸餾水亦不需DEPC處理。材料的粉碎只需在冰預(yù)冷的器皿中進(jìn)行。全部提取過程均可在常溫下進(jìn)行。所得到的RNA經(jīng)RT－PCR檢測及序列分析，序列完整，沒有降解。該技術(shù)可用于生產(chǎn)上大規(guī)模的馬鈴薯病毒RT－PCR檢測。
文檔編號C07H21/00GK1473839SQ03130540
公開日2004年2月11日 申請日期2003年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者杜榮騫, 李德森, 羅智敏, 俞鍵, 祁驥 申請人:南開大學(xué), 天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所, 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心