分泌抗馬鈴薯y病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其設(shè)及一種分泌抗馬鈴馨Υ病毒單克隆抗體的雜交 瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴馨Υ病毒(Potato virus Y,PVY)是危害馬鈴馨、煙草等農(nóng)作物的重要病毒之 一,在全球廣泛傳播并造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。PVY是馬鈴馨Y病毒科(Potyviridae)馬鈴馨Y病 毒屬(Potyvirus)的代表成員,1931年由Smith在馬鈴馨中首次發(fā)現(xiàn)。馬鈴馨Y病毒屬是植物 病毒中最大的屬,確定和可能的種約有200個,該屬的病毒能侵染茄科、襲科、豆科、葫蘆科 等多種植物并造成重大的經(jīng)濟損失。自1953年起PVY在歐洲馬鈴馨種植區(qū)廣泛流行,20世紀(jì) 70年代該病毒擴展到美洲,到上世紀(jì)90年代初該病毒在亞洲開始發(fā)生流行,目前該病毒在 世界各地均有發(fā)生危害。PVY引起的癥狀因寄主品種和病毒株系的不同而有所差異,典型的 癥狀包括重型花葉、葉脈壞死、垂葉條斑壞死等,可引起馬鈴馨產(chǎn)量損失高達80%。研究發(fā) 現(xiàn)PVY的初侵染源主要是帶毒種馨,病原通過種馨調(diào)運可作遠距離擴散,在馬鈴馨田塊PVY 也可W通過病汁液和攜毒曬蟲傳播。PVY粒子為彎曲線狀,無包膜,大小為730Xllnm,基因 組全長約10化,5'-末端共價結(jié)合基因組連接病毒蛋白(genome-linked viral protein, VPg),3'-末端有Ploy(A)。基因組只包含1個大的ORF,編碼1個約360W)a的多聚蛋白,該多聚 蛋白可裂解成11個成熟的功能蛋白,其中包括一個29.8kDa的外殼蛋白。
[0003] 防治PVY主要采用抗病毒育種和生產(chǎn)無毒種馨的方法,而快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的 病毒檢測技術(shù)是抗病毒育種和生產(chǎn)無毒種馨的關(guān)鍵。與常規(guī)的指示植物檢測、電鏡檢測、分 子生物學(xué)檢測等方法相比,血清學(xué)方法具有簡單、經(jīng)濟、易操作、可大規(guī)模檢測等優(yōu)點。目前 已有關(guān)于PVY抗體制備和血清學(xué)方法的報道,但已報道的PVY抗體和血清學(xué)方法的檢測靈敏 度欠佳,為此,本發(fā)明W純化的PVY病毒粒子作為抗原通過雜交瘤技術(shù)制備了 1株分泌抗PVY 的特異、靈敏單抗的雜交瘤細(xì)胞株,W分泌的單抗為核屯、建立檢測PVY的高通量的血清學(xué)方 法及試劑盒,從而為我國PVY的檢測和診斷、流行病學(xué)的調(diào)查、無毒種馨的生產(chǎn)、病毒基因組 功能的分析及其科學(xué)防控體系的建立提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種分泌抗馬鈴馨Y病毒單抗的雜交 瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。
[000引分泌抗馬鈴馨Y病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株3B2,它能分泌抗馬鈴馨Y病毒單抗,雜交瘤 細(xì)胞株3B2于2016年1月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、,保藏 號為CGMCC No.12001。
[0006] -種所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗馬鈴馨Y病毒單抗,抗馬鈴馨Y病毒單抗腹水間 接ELISA效價達1〇-7,抗體類型及亞類為IgGl、ka卵a輕鏈,與馬鈴馨Y病毒30邸a的外殼蛋白 有特異性免疫反應(yīng),利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)單抗檢測感染馬鈴馨Y病毒 病葉的靈敏度分別達到1:81 920和1:10 240倍稀釋(w/v,g/mL)。
[0007] 抗馬鈴馨Y病毒單抗與感染馬鈴馨Y病毒的植物組織有特異性免疫反應(yīng),而與感染 馬鈴馨A病毒、馬鈴馨X病毒、馬鈴馨S病毒、馬鈴馨卷葉病毒及健康的煙草和馬鈴馨葉片組 織均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0008] 抗馬鈴馨Y病毒單抗在該病毒檢測上的應(yīng)用是W單抗為核屯、建立的各種免疫學(xué)檢 測方法及免疫學(xué)試劑盒。
[0009] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果:1)提供的雜交瘤細(xì)胞株能大量穩(wěn)定分泌 抗PVY特異、靈敏的單抗,W分泌的單抗為核屯、建立的ACP-化ISA、dot-化ISA和Ti SSUe blot-ELISA等血清學(xué)方法及用運些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏地檢測植物 中的馬鈴馨Y病毒;2)利用本發(fā)明所制備的單抗檢測PVY,不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀 等設(shè)備;3)利用本發(fā)明所制備的單抗,可有效地用于田間植物中PVY的檢測和診斷,也可用 于該病毒病的流行病學(xué)調(diào)查、病毒基因組功能分析、脫毒種馨生產(chǎn)、抗性育種、科學(xué)防控等 方面。
【附圖說明】
[0010] 圖1 dot-ELISA方法檢測馬鈴馨Y病毒的特異性分析。
[00川圖2 dot-ELISA方法檢測PVY的靈敏度分析。
[0012]圖3 dot-ELISA方法檢測田間植物樣品中PVY的結(jié)果。
[001引圖4 RT-PCR方法對檢測田間植物樣品中PVY的結(jié)果。
[00M] 圖5 Tissue blot-ELISA方法田間檢ii植物樣品中PVY的結(jié)果。
[001引生物保藏
[0016]雜交瘤細(xì)胞株3B2于2016年1月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中屯、,地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號,郵編:100 101,保藏號為CGMCC No.12001。
【具體實施方式】
[0017] 分泌抗馬鈴馨Y病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株3B2,它能分泌抗馬鈴馨Y病毒單抗,雜交瘤 細(xì)胞株3B2于2016年1月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、,保藏 號為CGMCC No.12001。
[0018] -種所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗馬鈴馨Y病毒單抗,抗馬鈴馨Y病毒單抗腹水間 接ELISA效價達ΙΟΛ抗體類型及亞類為IgGUka卵a輕鏈,與馬鈴馨Y病毒30邸a的外殼蛋白 有特異性免疫反應(yīng),利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)單抗檢測感染馬鈴馨Y病毒 病葉的靈敏度分別達到1:81 920和1:10 240倍稀釋(w/v,g/mL)。
[0019] 抗馬鈴馨Y病毒單抗與感染馬鈴馨Y病毒的植物組織有特異性免疫反應(yīng),而與感染 馬鈴馨A病毒、馬鈴馨X病毒、馬鈴馨S病毒、馬鈴馨卷葉病毒及健康的煙草和馬鈴馨葉片組 織均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0020] 抗馬鈴馨Y病毒單抗在該病毒檢測上的應(yīng)用是W單抗為核屯、建立的各種免疫學(xué)檢 測方法及免疫學(xué)試劑盒。
[0021] 本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株能大量分泌抗PVY單抗,且該細(xì)胞株分泌的單抗特異 性強、效價高、穩(wěn)定性好、靈敏度高。W該單抗為核屯、建立檢測PVY的高通量的血清學(xué)方法可 成功應(yīng)用于田間植物中PVY的檢測,從而為我國馬鈴馨Y病毒病檢測和診斷、脫毒種馨的生 產(chǎn)、科學(xué)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
[0022] 下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。
[0023] -、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備
[0024] 1.免疫原及檢測抗原的制備
[0025] 用下面的操作步驟提純病毒粒子:
[0026] 1)將組織勻漿器在冰上預(yù)冷;
[0027] 2)稱取感染PVY的煙草組織200g,每lOOg組織加入200mL 0.5M憐酸鹽緩沖液即PB 緩沖液(含0.01M化-EDTA和0.1 %琉基乙醇,pH 7.5),在組織勻漿器中勻漿5-lOmin,使煙 草組織充分勻漿,用雙層棉紗布過濾勻漿液,濾液6 00化pm離屯、20min去除植物殘渣;
[002引 3)所得的離屯、上清液在攬拌中加至終濃度為2.5 % Triton X-100、4 %陽G(分子量 為6 000)和0.1M NaCl,然后4°C攬拌4hW上;
[0029] 4)11 000巧m 離屯、15min 去上清;
[0030] 5)用 lOmL pH 7.5 的 0.5M PB(含 0.01M MgC12 和 0.5M 脈)將沉淀充分懸浮,6 00化pm離屯、15min后將上清收集于燒杯中,放置于4°C,沉淀再懸浮、離屯、,重復(fù)3次;
[0031 ] 6)將上述離屯、上清液合并,33 000巧m超速離屯、lOOmin;
[0032] 7)所得沉淀用0.5M PB懸浮后8 00化pm離屯、15min,收集上清液,沉淀再懸浮、離 屯、,重復(fù)3次;
[0033] 8)將合并上清液加到超離管中,用注射器針頭吸取20mL 30%薦糖加到超離管的 底部形成薦糖墊,33 000巧m超速離屯、lOOmin;
[0034] 9)所得沉淀用適量pH 7.5的0.01M PB(含0.01M MgC12)懸浮,33 OOOrpm超速離屯、 lOOmi