專利名稱：多重實(shí)時(shí)熒光pcr同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法。
背景技術(shù)：
馬鈴薯是一種重要的世界性糧食作物，馬鈴薯病毒病是馬鈴薯上非常重要的一類病害，分布于世界各馬鈴薯種植區(qū)，其中一些馬鈴薯病毒會(huì)嚴(yán)重的影響馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量。在我國(guó)，主要的馬鈴薯病毒種類有馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)，馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY),馬鈴薯卷葉病毒(Potato virus, PLRV),馬鈴薯 A 病毒(Potatovirus, PVA)及馬鈴薯S病毒(Potato virus, PVS) 對(duì)生產(chǎn)影響最大的病毒是PVY和PLRV，其次是PVX和PVA，PVS影響較小。這些病毒嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量及品質(zhì)，一般減產(chǎn)10% 30%，重者達(dá)80%以上。除馬鈴薯外，茄科的其他作物如番茄、青椒等也會(huì)被馬鈴薯病毒所侵染，馬鈴薯病毒檢測(cè)及防治已引起極大重視，開發(fā)快速、靈敏、規(guī)范化的檢測(cè)體系是病毒檢測(cè)發(fā)展的必然方向。目前國(guó)內(nèi)外馬鈴薯分子檢測(cè)技術(shù)的研究，多涉及以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測(cè)(或血清學(xué)試驗(yàn))方法和以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，較傳統(tǒng)檢測(cè)方法更為快速、靈敏、準(zhǔn)確。因?yàn)轳R鈴薯往往會(huì)被幾種病毒同時(shí)侵染，所以多重檢測(cè)在馬鈴薯病毒病防控中尤其重要。Singh等利用二重PCR方法同時(shí)檢測(cè)了馬鈴薯中的PLRV和PVY。袁青等利用三重RT-PCR對(duì)感染PVX、PVS、PVA以及復(fù)合侵染的馬鈴薯葉片、葉梗、莖干和薯塊進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果表明，該方法可檢測(cè)出復(fù)合感染以上病毒的樣品。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種實(shí)時(shí)定量檢測(cè)特定核酸技術(shù)，與普通PCR相比，具有定量準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，它已被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。從原理上講有兩大類熒光模式一類為熒光雜交探針，如Taqman、分子信標(biāo)等，基于能量共振轉(zhuǎn)移的原理(FRET);另一類為DNA結(jié)合染料，主要為Sybr Green I。前面一種方法特異性好，除需要合成序列特異引物外，還需要合成高成本的熒光探針，成本較高；后一種方法經(jīng)濟(jì)，只需合成特異性引物，但易受引物二聚體的影響，特異性相對(duì)沒(méi)有探針?lè)ǜ摺６嘀貙?shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)因具有高效快捷、能降低實(shí)驗(yàn)成本、加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的認(rèn)可。由于儀器的限制，利用探針?lè)ㄔ谝粋€(gè)反應(yīng)體系里目前最多只能檢測(cè)出四種擴(kuò)增產(chǎn)物。Agindotan等利用Taqman探針同時(shí)檢測(cè)出PLRV、PVA、PVX和PVY 4種病毒，但由于探針成本較高，探針?lè)ú⒉贿m合廣泛應(yīng)用。目前發(fā)展起來(lái)的多重實(shí)時(shí)熒光染料PCR技術(shù)可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中，通過(guò)Tm值分析來(lái)區(qū)分不同的核酸片段。王小武等利用SYBR Premix ExTaq同時(shí)檢測(cè)出了豬生殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)、豬圓環(huán)病毒 2 型(porcine circovirus type 2,PCV-2)以及豬偽狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus, PRV) 3 種病毒，Chassagne 等利用Sybr Green在一個(gè)反應(yīng)體系里可同時(shí)檢測(cè)出大腸桿菌的stxl, stx2和eae這三種基因。在多重實(shí)時(shí)熒光染料PCR病毒檢測(cè)中，同時(shí)檢測(cè)多種病毒，需要所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增條件一致，而擴(kuò)增片段Tm值要能區(qū)分大小使其在一個(gè)熔解曲線中呈現(xiàn)出不同的峰。由于染料除了和目的片段也可以和引物二聚體結(jié)合而影響實(shí)驗(yàn)特異性，給引物設(shè)計(jì)增加了難度，而常用的Sybr Green I有“染料重分布”的缺陷對(duì)PCR擴(kuò)增有抑制作用且對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物存在偏愛(ài)性，在PCR擴(kuò)增后熔解曲線分析中，要實(shí)現(xiàn)多擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解峰的區(qū)分往往是十分困難的。正因?yàn)樯鲜龇N種限制，在一次檢測(cè)中每增加一種病毒，在引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增條件上就增加了一個(gè)級(jí)別的難度，這也是目前所報(bào)道的熒光染料多重PCR檢測(cè)病毒最多還只能檢測(cè)三種病毒的原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法，該方法能能快速、可靠、靈敏度高、特異性強(qiáng)和價(jià)格便宜的同時(shí)檢測(cè)馬鈴薯X病 毒PVX、馬鈴薯Y病毒PVY、馬鈴薯卷葉病毒PLRV、馬鈴薯A病毒PVA以及馬鈴薯S病毒PVS這五種馬鈴薯病毒。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法，包括以下步驟I)、分別合成馬鈴薯X病毒一PVX、馬鈴薯Y病毒一PVY、馬鈴薯卷葉病毒一PLRV、馬鈴薯A病毒一PVA和馬鈴薯S病毒一PVS的所對(duì)應(yīng)的特異性引物；2)、抽提馬鈴薯樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；3)、將步驟I)所述的所有特異性引物置于多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系中，以步驟2)所述的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)熔解曲線來(lái)分析馬鈴薯樣品是否攜帶PVX、PVY、PLRV、PVA和PVS中的至少一種。作為本發(fā)明的多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法的改進(jìn)所述PVX擴(kuò)增弓丨物對(duì)為正向CACAGGCTGCTTGGGACTT，反向TGCCGTTGGAATAGGGAC；擴(kuò)增片段Tm值為83. 9 ；所述PVY擴(kuò)增弓丨物對(duì)為正向CTGAGATGCCAACTGTGATGA，反向GTTGACATTTGGCGAGGTT；擴(kuò)增片段Tm值為80. 6 ； 所述PLRV擴(kuò)增弓丨物對(duì)為正向CGCCGAAGACGCAGAAGAGGA，反向AGACTCGGCCCGAAGGTGAA；擴(kuò)增片段Tm值為89. I ；所述PVA擴(kuò)增弓丨物對(duì)為正向CCAATGCTCAAAGGTAAG，反向TCTACTTGCTTTGGTTTGT；
擴(kuò)增片段Tm值為78. 2 ；所述PVS擴(kuò)增弓丨物對(duì)為正向GAGATAGGTAGGCCCTCACTT，反向CTGTGCCATTTGCTCGGT ；擴(kuò)增片段Tm值為86. 8。上述片段Tm是擴(kuò)增后所得的結(jié)論性數(shù)據(jù)，事先是可以通過(guò)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物來(lái)設(shè)定。作為本發(fā)明的多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟3)多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系由以下成分組成10XPCR buffer 5uL,25mM MgCl25 u L, dNTP (IOmM) I. 5 U L, 20 XEvaGreen 2. 5 U L, Taq DNA Polymerase 2. 5ul，2. 5 U L 步驟
2)所述的cDNA、PVX擴(kuò)增引物對(duì)0. L、PVY擴(kuò)增引物對(duì)0. L、PLRV擴(kuò)增引物對(duì)0. 28 u L,PVA擴(kuò)增引物對(duì)0. 25u L和PVS擴(kuò)增引物對(duì)0. 23 y L，用dd H2O定容至50 u L ；多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min ；40 個(gè)循環(huán)95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 31s ;熔解曲線程序?yàn)?5°C 15s,60°C 20s, 95°C 15s ;從60°C開始收集熒光信號(hào)。在本發(fā)明中，根據(jù)熔解曲線來(lái)分析馬鈴薯樣品是否攜帶PVX、PVY、PLRV、PVA和PVS中的至少一種，具體如下根據(jù)熔解曲線所顯示的峰，出現(xiàn)Tm值為83. 9的峰，說(shuō)明有PVX病毒；出現(xiàn)Tm值為80. 6的峰，說(shuō)明有PVY病毒；出現(xiàn)Tm值為89. I的峰，說(shuō)明有PLRV病毒；出現(xiàn)Tm值為78. 2的峰，說(shuō)明有PVA病毒；出現(xiàn)Tm值為86. 8的峰，說(shuō)明有PVS病毒。本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下第一步、PCR引物設(shè)計(jì)從NCBI中搜索目前已登記的馬鈴薯病毒PVX、PVY、PLRV, PVA及PVS所有的序列分析結(jié)果，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)引物通過(guò)不斷調(diào)整，選擇可以有效區(qū)分五種病毒TM值的引物，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候注意擴(kuò)增片段長(zhǎng)短以及引物自身和引物間二聚體的問(wèn)題。 表I、本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的PCR弓丨物
權(quán)利要求
1.多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法，其特征是包括以下步驟 1)、分別合成馬鈴薯X病毒一PVX、馬鈴薯Y病毒--PVY、馬鈴薯卷葉病毒一PLRV、馬鈴薯A病毒—PVA和馬鈴薯S病毒一PVS的所對(duì)應(yīng)的特異性引物； 2)、抽提馬鈴薯樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA； 3)、將步驟I)所述的所有特異性引物置于多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系中，以步驟2)所述的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)熔解曲線來(lái)分析馬鈴薯樣品是否攜帶PVX、PVY、PLRV, PVA和PVS中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法，其特征是 所述PVX擴(kuò)增引物對(duì)為 正向CACAGGCTGCTTGGGACTT，反向TGCCGTTGGAATAGGGAC ； 所述PVY擴(kuò)增引物對(duì)為 正向CTGAGATGCCAACTGTGATGA，反向GTTGACATTTGGCGAGGTT ； 所述PLRV擴(kuò)增引物對(duì)為 正向CGCCGAAGACGCAGAAGAGGA，反向AGACTCGGCCCGAAGGTGAA ； 所述PVA擴(kuò)增引物對(duì)為 正向CCAATGCTCAAAGGTAAG，反向TCTACTTGCTTTGGTTTGT ； 所述PVS擴(kuò)增引物對(duì)為 正向GAGATAGGTAGGCCCTCACTT， 反向CTGTGCCATTTGCTCGGT。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法，其特征是所述步驟3)為根據(jù)熔解曲線所顯示的峰，出現(xiàn)Tm值為83. 9的峰，說(shuō)明有PVX病毒；出現(xiàn)Tm值為80. 6的峰，說(shuō)明有PVY病毒；出現(xiàn)Tm值為89. I的峰，說(shuō)明有PLRV病毒；出現(xiàn)Tm值為78. 2的峰，說(shuō)明有PVA病毒；出現(xiàn)Tm值為86. 8的峰，說(shuō)明有PVS病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法，其特征是所述步驟3)多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系由以下成分組成10XPCR buffer5 u L, 25mM MgCl2 5 u L, dNTP (IOmM) I. 5 u L, 20 XEvaGreen 2. 5 u L, Taq DNA Polymerase2.5ul，2. L步驟2)所述的cDNA、PVX擴(kuò)增引物對(duì)0. L、PVY擴(kuò)增引物對(duì)0. L、PLRV擴(kuò)增引物對(duì)0. 28 u L、PVA擴(kuò)增引物對(duì)0. 25 ii L和PVS擴(kuò)增引物對(duì)0. 23 y L，用dd H2O定容M 50 u L ； 所述多重?zé)晒釶CR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min ;40個(gè)循環(huán)95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 31s ;熔解曲線程序?yàn)?5°C 15s,60°C 20s, 95°C 15s ;從60°C開始收集熒光信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)五種馬鈴薯病毒的方法，包括以下步驟1)、分別合成馬鈴薯X病毒--PVX、馬鈴薯Y病毒--PVY、馬鈴薯卷葉病毒--PLRV、馬鈴薯A病毒--PVA和馬鈴薯S病毒--PVS的所對(duì)應(yīng)的特異性引物；2)、抽提馬鈴薯樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；3)、將步驟1)所述的所有特異性引物置于多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系中，以步驟2)所述的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)熔解曲線來(lái)分析馬鈴薯樣品是否攜帶PVX、PVY、PLRV、PVA和PVS中的至少一種。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102618667SQ20121008083
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者丁先鋒, 姜永厚, 程菊會(huì), 董沁芳, 郭江峰 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)