專利名稱：鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的DNA引物序列及其利用DNA引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法。
背景技術(shù)：
黃瓜白粉病(powdery mildew，Sphaerotheca fuliginea L.)是一種廣泛發(fā)生的世界性植物病害。該病靠氣流進(jìn)行傳播，喜溫濕、耐干燥。在溫度和濕度適宜的條件下，其病原體孢子萌發(fā)，病害先出現(xiàn)在植物下部葉片正面或背面，表現(xiàn)為白色小粉點(diǎn)，后擴(kuò)大為粉狀圓形斑。在條件適宜時(shí)，白色粉狀斑點(diǎn)繼續(xù)擴(kuò)展，連接成片，成為邊緣不明顯的大片白粉區(qū)，直到布滿整個(gè)葉片，看上去像長了一層白毛，所以俗稱“白毛病”，患有白粉病的葉片逐漸變黃、發(fā)脆，白毛由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榛野咨?，最后使葉片失去光合作用功能。白粉病在黃瓜整個(gè)生長期均能發(fā)生，嚴(yán)重危害葉片，進(jìn)而影響植株生長、結(jié)瓜，造成黃瓜減產(chǎn)，給蔬菜生產(chǎn)企業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失。
我國十分重視黃瓜的抗病育種研究。從上個(gè)世紀(jì)50年代末，育種家就通過常規(guī)雜交、自交等育種方法進(jìn)行黃瓜抗白粉病和抗霜霉病等的選育工作，并取得了顯著成就，先后育成了一批優(yōu)良品種，在生產(chǎn)上發(fā)揮了很大的作用。
常規(guī)的抗病育種方法雖然發(fā)揮了很大作用，但也存在許多缺點(diǎn)。常規(guī)抗病品種的選育主要是通過雜交和多代自交，抗病材料的選擇和田間鑒定過程復(fù)雜，周期相對較長，而且可靠性差。并大量地消耗人力、物力、財(cái)力及地力，加之黃瓜白粉病的病原(Sphaerothecafuliginea(Schlecht)Poll.)——單絲殼白粉菌(屬子囊菌亞門真菌)——為專性寄生菌，只能在活體寄主上存活，使得黃瓜白粉病的發(fā)生受季節(jié)限制，在非發(fā)病季節(jié)對該病的田間鑒定工作則難以進(jìn)行。
RFLP、RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)的問世，為育種提供了一條新的途徑。分子標(biāo)記可以直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題。
分子標(biāo)記技術(shù)在尋找與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記方面已有諸多報(bào)道，但與黃瓜白粉病抗性相關(guān)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記目前尚未見報(bào)道。在利用分子標(biāo)記進(jìn)行抗性鑒定的過程中，特異性的引物序列是關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列；本發(fā)明的另一個(gè)目的是用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列，它由上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′組成。
一種使用上述引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA 15～30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，47～53℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6％變性聚丙烯胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
第二種鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列，它包括兩組引物，所述第一組引物由上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′組成，所述第二組引物由上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′組成。
一種使用第二種引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入所述黃瓜基因組DNA 15～30ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAAATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′20～40ng、在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′20～40ng下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、再在兩支擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μ，將所述兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在50～55℃退火40～60秒，第二支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在53～56℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸5～7分鐘，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
該技術(shù)鑒定結(jié)果與田間抗病吻合率達(dá)94％，而且具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，在黃瓜白粉病抗性篩選上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1是第一種技術(shù)方案的電泳圖；圖2和圖3是第二種技術(shù)方案的電泳圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例1一種使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規(guī)方法；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入黃瓜基因組DNA 30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′30ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′30ng、dNTP 0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性300秒，94℃變性60秒，48℃退火60秒，72℃延伸120秒，35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸420秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性，由于抗病單株、感病單株或中間類型單株經(jīng)擴(kuò)增以后產(chǎn)生不同分子量的DNA片段，在凝膠上分離時(shí)其在凝膠上的遷移速率不同，從而形成位置上存在差異的條帶，通過條帶在凝膠上的相對位置就可對黃瓜白粉病材料的抗性進(jìn)行快速鑒定。如圖1所示1為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量200bp；2為抗性帶；3為感性帶，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)，泳道1及3～9為抗病單株；泳道2及10～16為感病單株；泳道17～23為中間類型單株，純合抗性株僅有抗性帶，純合感性株僅有感性帶，雜合類型同時(shí)具有抗性帶和感性帶。
實(shí)施例2一種使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規(guī)方法；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入黃瓜基因組DNA 15ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20ng、dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180秒，94℃變性60秒，47℃退火40秒，72℃延伸60秒，25個(gè)循環(huán)，再72℃延伸300秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在KANGRIDE可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
實(shí)施例3一種使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規(guī)方法；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入黃瓜基因組DNA 20ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′40ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′40ng、dNTP 0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性240秒，94℃變性60秒，53℃退火60秒，72℃延伸100秒，30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸600秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在KANGRIDE可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
實(shí)施例4是第二種技術(shù)方案中使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規(guī)方法；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入黃瓜基因組DNA 30ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′30ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′30ng、在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′30ng下游引物5′-ATA CAT AGC CATACA AAA AT-3′30ng、再在兩支擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性300秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在50℃退火60秒，第二支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在53℃退火60秒，72℃延伸120秒，35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸7分鐘，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性，圖2所示的是第一支擴(kuò)增產(chǎn)物，1為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量200bp；2為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量100bp；3為抗性帶，圖3所示的是第二支擴(kuò)增產(chǎn)物，1為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量100bp；2為性帶，兩個(gè)圖中的M為DNA標(biāo)準(zhǔn)，泳道1及3～9為抗病單株；泳道2及10～16為感病單株；泳道17～23為中間類型單株，在圖2中，抗病單株和中間類型單株具有抗性帶，而感病單株無此條帶，據(jù)此可鑒定出純合感病個(gè)體；在圖3中，感病單株和中間類型單株均具有感性帶，而抗病單株無此條帶，據(jù)此可以鑒定出純合抗病個(gè)體。將圖2和圖3結(jié)合在一起觀察和分析，可以當(dāng)作一個(gè)共顯性的標(biāo)記。在第一組中無帶的為純合感性株，在第二組中無帶的為純合抗性株，在兩組中均有條帶的為雜合中間型，據(jù)此快速鑒定出純合抗性株、純合感性株及雜合中間型株，實(shí)現(xiàn)黃瓜白粉病抗性的快速鑒定。
實(shí)施例5是第二種技術(shù)方案中使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規(guī)方法；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入黃瓜基因組DNA 30ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′40ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′40ng、在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′40ng、下游引物5′-ATA CAT AGCCAT ACA AAA AT-3′40ng、再在兩支擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性200秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在55℃退火60秒，第二支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在56℃退火60秒，72℃延伸120秒，30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10分鐘，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
實(shí)施例6是第二種技術(shù)方案中使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規(guī)方法；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入黃瓜基因組DNA 15ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′20ng、在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′20ng下游引物5′-ATA CAT AGC CATACA AAA AT-3′20ng、再在兩支擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在48℃退火40秒，第二支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在50℃退火40秒，72℃延伸60秒，25個(gè)循環(huán)，再72℃延伸5分鐘，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
權(quán)利要求
1.鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列，其特征在于它由上游引物5′-CAG TAA ATG AAAGAA AAG AAG-3′，下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′組成。
2.一種使用權(quán)利要求1的引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，其特征是它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA 15～30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，47～53℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸300～600秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6％變性聚丙烯胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
3.鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列，其特征在于它包括兩組引物，所述第一組引物由上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTGAAA AAC-3′組成，所述第二組引物由上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′組成。
4.一種使用權(quán)利要求3的引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，其特征是它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入所述黃瓜基因組DNA 15～30ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTGAAA AAC-3′20～40ng、在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTTTTT TCT TGT TTC-3′20～40ng下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、再在兩支擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在48～55℃退火40～60秒，第二支PCR擴(kuò)增專用薄壁管在50～56℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸5～10分鐘，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列及其鑒定方法，引物序列由上游引物5′－CAG TAAATG AAA GAA AAG AAG－3′，下游引物5′－ATA CATAGC CAT ACA AAA AT－3′組成，使用該引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性，采用本方法的鑒定結(jié)果與田間抗病吻合率達(dá)94％，而且具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，在黃瓜白粉病抗性篩選上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C07H21/00GK1482132SQ03129978
公開日2004年3月17日 申請日期2003年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者杜勝利, 張桂華, 李淑菊, 魏愛民, 張歷, 韓毅科 申請人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司, 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心