利用人工合成mv6序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種培育甘蔗抗病品種的方法，具體涉及一種利用人工合成MV6序列 培育抗花葉病甘蔗品種的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘蔗花葉病是由馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus)甘蔗花葉病毒亞組的成員甘蔗花葉 病毒（Sugarcane Mosaic Virus, ScMV)和高梁花葉病毒（Sorghum Mosaic Virus, SrMV)引 起的。Potyvirus病毒基因組長約10kb，編碼一個多聚蛋白，經(jīng)自身編碼的蛋白酶降解形成 10個多肽，分別為PI、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。該病為一種傳播性的 病毒病，至今全世界各大蔗區(qū)普遍發(fā)生，并成為蔗區(qū)的重要病害之一。大田研宄表明，當(dāng)病 毒的侵染率達(dá)75%時，甘蔗的產(chǎn)量降低5%~19%，而且蔗汁中還原糖增加，降低蔗糖的結(jié) 晶率。
[0003] 甘蔗是一個高度多倍性，高度雜合性的作物，主要栽培種在正常栽培條件下又難 于開花，用常規(guī)方法難以培育抗花葉病毒新品種，利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因抗病毒植 株，國內(nèi)外都有報道，獲得的轉(zhuǎn)基因植株對甘蔗花葉病的抗性明顯提高。但大多研宄者是將 單一的CP及HC全序列基因?qū)氲礁收嶂?，獲得的轉(zhuǎn)基因植株只能是針對單一株系的花葉 病毒有抗性。目前，世界蔗區(qū)至少存在有7個ScMV和SrMV病毒株系，包括屬于ScMV的株 系ScMV-A，B，D，E和屬于SrMV的株系SrMV-H，I，M，并且蔗區(qū)中花葉病毒的優(yōu)勢株系在自然 條件下也會發(fā)生變化，并產(chǎn)生新的株系。因此，僅以單一株系的花葉病毒的單一基因為靶標(biāo) 的轉(zhuǎn)基因改良顯然無法應(yīng)對蔗區(qū)病原株系多樣化、復(fù)雜化以及優(yōu)勢株系的變化。
[0004] RNAi (RNA interference)技術(shù)提供了一種能直接有效地人為控制基因表達(dá)的方 法，它能夠引起基因在轉(zhuǎn)錄水平的高效沉默，將任何目的基因序列插入RNA干擾載體，均可 獲得沉默靶標(biāo)基因的效應(yīng)。而且，引發(fā)RNAi的片段并不需要完整的基因序列，還可以是多 個病毒的不同基因片段的嵌合體，因此，RNAi針對的靶標(biāo)基因也可以是多個不同病毒的基 因片段。為此，我們將收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序 列分別進(jìn)行多序列比對，從中分別選取3條和4條長度大于30bp且100%同源的序列區(qū)段， 采用人工合成的方式串聯(lián)在一起，作為RNAi干擾片段，構(gòu)建反向重復(fù)序列，得到一個RNAi 載體。通過基因槍轟擊法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗，獲得具有沉默病毒基因表達(dá)效果的轉(zhuǎn)基因甘蔗。
[0005] 專利號為ZL20071009226. 8的發(fā)明專利"利用SrMV-Pl基因培育抗花葉病甘蔗品 種的方法"，介紹了一種利用SrMV-Pi基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花葉病甘蔗轉(zhuǎn)Pi基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)P :基因材料的培育 以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種利用人工合成序列MV6培育抗花葉病甘蔗品種的方法。 針對現(xiàn)有蔗區(qū)甘蔗花葉病嚴(yán)重的問題，人工合成可同時沉默甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒 的新型核酸序列，構(gòu)建RNAi載體，通過基因槍轟擊法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得對花葉病高抗的 轉(zhuǎn)基因甘蔗。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的。
[0008] 本發(fā)明的利用人工合成MV6序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV6序列的 人工合成、RNAi干擾載體構(gòu)建、抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定；其特征在 于：
[0009] (1)MV6序列的人工合成：
[0010] 從ScMV和SrMV核酸序列中選取若干區(qū)段串聯(lián)在一起，獲得MV6序列，同時在正義 鏈5'端加入Xba I和XhoI酶切位點(diǎn)，反義鏈5'端加入Cla I和KpnI酶切位點(diǎn)，采用 人工合成的方式，獲得目的片段A，其序列如下：
[0011] GATCTAGACT CGAGTGCCAA GATACGGACT TCAGCGAAAC TTAACCGACT ATAAAGAGCT
[0012] AGAGAGGCCC ACATGCAGAT GAAAGCAGCA GCAGTATGGA AAAAAGTTAC GTCGATCTCT
[0013] TAAACCAAGC ATGGGCAGCT CTATTTCAAC CAAACTCCAC CACAGTTTAT GTAAATGCAC
[0014] TCTCTGTTGG GAGTGCAGCA GCACCACTAG TCTCCTGGAA ACCCTGTTTG CAGTACCTAT
[0015] GGAAAATTTT CAGCAATATG GCGTGTGTTC AAGTCAGCTC TACTTTAACC AAACTCCGCA
[0016] ACGGTTTGGT ACCATCGATA G
[0017] 所述從ScMV和SrMV核酸序列中選取若干區(qū)段串聯(lián)在一起，指將收集到的ScMV各 病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進(jìn)行多序列比對，從中分別選取3 條和4條長度大于30bp，且100%同源的序列區(qū)段串聯(lián)在一起，共293bp，為目標(biāo)RNAi干擾 序列。
[0018] (2) RNAi干擾載體構(gòu)建：
[0019] (a)目的片段I的獲得：利用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I將目的片段A進(jìn)行酶 切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段I;目的片段I的序列為序列 表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0020] (b)目的片段II的獲得：將pHANNIBAL載體質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段II，目的片段II的序 列為序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；
[0021] (c)中間載體B的獲得：將回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA連接酶進(jìn)行 連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆驗證，獲得中間載體B;所述中 間載體B是指將目的片段I插入到pHANNIBAL載體后獲得的載體；
[0022] ⑷目的片段III的獲得：提取中間載體B的質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶ClaI和 XbaI進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段III;目的片段III 的序列為序列表中SEQIDN0:4所示的核苷酸序列；
[0023] (e)目的片段IV的獲得：將目的片段A用限制性內(nèi)切酶ClaI和XbaI進(jìn)行酶切， 將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段IV;目的片段IV的序列為序列表 中SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；
[0024](f)中間載體C的獲得：將回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA連接酶進(jìn)行 連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆驗證，獲得中間載體C ;所述中 間載體C是指將目的片段IV插入到中間載體B后獲得的載體；
[0025] (g)目的片段V的獲得：提取中間載體C的質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Not I進(jìn) 行酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段V;目的片段V的序列為 序列表中SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；
[0026] (h)目的片段VI的獲得：將植物表達(dá)載體pGreenII0229質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶 Not I進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段VI ;目的片段VI 的序列為序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；
[0027] ⑴抗甘蔗花葉RNAi干擾載體pG0229i_MV6的獲得：將回收的目的片段V和目的 片段VI用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆 驗證，獲得可用于遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗受體材料的RNAi干擾載體pG0229i-MV6 ;
[0028] (3)抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定：提取構(gòu)建完成的RNAi干擾載 體pG0229i-MV6質(zhì)粒DNA，用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，并將其定量至1 y g/ y 1， 基因槍轟擊法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗，分子檢測獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行抗病轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗 病性鑒定。
[0029] 所述pHANNIBAL載體、pGreenII0229載體、大腸桿菌DH5a，均由商業(yè)購買獲得。
[0030] 利用本發(fā)明的人工合成MV6序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，在人工接種條件 下，分別接種了屬于ScMV株系的ScMV-A，D，E和屬于SrMV株系的SrMV-H，M共5個株系的 花葉病病毒，對照發(fā)病率分別達(dá)到了82. 9%、87. 7%、86. 8%、90.5%和88.3%，而轉(zhuǎn)基因 甘蔗均無發(fā)病，說明轉(zhuǎn)入人工合成的MV6基因后提高了甘蔗抗多種花葉病毒的能力。采用 本發(fā)明的方法篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株，都具有抗性廣譜、抗病性好、抗性持久及生物安全性 高的特點(diǎn)。
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0032] 1.本發(fā)明獲得的植物表達(dá)載體采用了 RNAi技術(shù)，使得甘蔗抗病毒育種擺脫了對 抗源基因的依賴。
[0033] 2.本發(fā)明人工合成的核酸序列包含3段與ScMV各病毒株系核酸序列100%同源 和4段與SrMV各病毒株系核酸序列100%同源的序列區(qū)段，作為RNAi序列，獲得的轉(zhuǎn)基因 植株，具有抗性廣譜、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特點(diǎn)。
[0034] 3.本發(fā)明獲得的RNAi干擾載體用于轉(zhuǎn)基因甘蔗，可以有效地縮短甘蔗抗花葉病 育種周期。
【附圖說明】 [0035] 圖1為構(gòu)建完成的pG0229i-MV6質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】 [0036] 為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例加以 說明。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所述試劑和生物材料如 無特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。
[0037] 實(shí)施例一：構(gòu)建抗甘蔗花葉病的RNAi干擾載體
[0038] 構(gòu)建抗甘蔗花葉病的RNAi干擾載體的方法，包括以下步驟：
[0039] 1、MV6序列的人工合成：
[0040] 將收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進(jìn)行 多序列比對，從中分別選取3條和4條長度大于30bp且100%同源的序列區(qū)段，然后將選 取出來的7條序列區(qū)段采用人工合成的方式串聯(lián)在一起，共293bp，即為目標(biāo)RNAi干擾序 列；同時在