專利名稱：一種輔助鑒定馬鈴薯v病毒的試劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的試劑及其應用。
背景技術：
馬鈴薯V病毒(Potato virus V，PVV)，是一種重要的馬鈴薯病毒，主要在法國、愛 爾蘭、秘魯、英國等發(fā)生。PVV在我國無報道，是我國進境重要的檢疫對象(《中華人民共和 國進境植物檢疫有害生物名錄》(2007年版))。馬鈴薯V病毒的自然寄主是馬鈴薯，是馬 鈴薯上一個非常重要的病毒，能被多種蚜蟲非持久傳播，對馬鈴薯的危害較大。該病毒還可 與其他病毒混合侵染，危害更大，能造成產(chǎn)量下降，影響馬鈴薯生產(chǎn)。PVV在馬鈴薯上系統(tǒng) 侵染，病毒能夠傳到薯塊上，薯塊帶毒率較高，在引進的馬鈴薯種薯中攜帶該病毒的機率極 大，具有潛在的巨大風險。引進種薯如作為種質(zhì)資源，該病毒可能隨種薯繁殖而定殖。如作 為生產(chǎn)薯，病毒在生長期內(nèi)由蚜蟲在田間傳播。雖然多數(shù)病毒經(jīng)一個生長季節(jié)后，將隨帶病 薯塊用做消費而自然消亡，但少量將隨次生薯塊留在田間，第二年春季萌發(fā)后作為初侵染 源，如果再有部分病薯被作為種薯，該病毒將完全能夠存活下來。因此，發(fā)病的種薯無論是 種質(zhì)資源，還是作為生產(chǎn)用種，該病毒都能完成周年循環(huán)，在引進地區(qū)定殖。馬鈴薯具有很高的食用和經(jīng)濟價值，近年來，已上升為我國第四大糧食作物，對于 維護我糧食安全具有重要意義。許多國家看好中國馬鈴薯市場，大量的馬鈴薯種薯輸入或 將要輸入我國。近年來，國外的馬鈴薯種薯不斷進入中國，該病毒極有可能隨進境種薯的引 進而進入中國。該病毒一旦傳入，我國將面臨種薯降級甚至無法再用做種薯，市場潛力大大 降低，嚴重影響中國馬鈴薯種薯在國際市場上的競爭力，經(jīng)濟影響大。為了維護我國馬鈴薯 這一巨大產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、防止馬鈴薯V病毒隨馬鈴薯種薯等進境物傳入中國并盡量減少國 際貿(mào)易摩擦，開發(fā)出快速、靈敏檢測馬鈴薯V病毒的先進的技術，意義重大。關于馬鈴薯V病毒的檢測技術的研究報道極少，目前，檢測馬鈴薯V病毒的方法 主要有鑒別寄主、電鏡觀察(Hooker WJ. Compendium of Potatodisease [Μ]. St. Paul. MN The American Phytopathological Society，1981.)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等(王秀 芬，劉偉等，引進加拿大馬鈴薯種薯中病毒的檢測[J].植物檢疫，2002，16(1) 16-18.；劉 洪義，李明福等，黑龍江馬鈴薯病毒病的普查及鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2006，37 (3) 307-310.)。電鏡技術設備昂貴，檢測靈敏度低；ELISA技術操作步驟繁瑣、檢測周期長、靈 敏度低、易出現(xiàn)假陽性。未見采用實時熒光PCR檢測PVV的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的試劑及其應用。本發(fā)明提供的輔助鑒定馬鈴薯V病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序 列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。所述試劑可由所述特異引物和特異探針組成；所述特異探針的核苷酸序列如序列 表的序列4所示。所述特異探針可為TaqMan探針。
所述試劑可用于制備輔助鑒定馬鈴薯V病毒的試劑盒。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的試劑盒，包括所述試劑。所述試劑可用于輔助鑒定馬鈴薯V病毒。本發(fā)明還提供了一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒 的cDNA為模板，用特異引物對甲進行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測病毒的cDNA為模板，用 特異弓丨物對乙進行PCR，得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為67bp且PCR產(chǎn)物乙為85bp，待 測病毒為候選的馬鈴薯V病毒；所述特異引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的 序列2所示DNA組成的引物對；所述特異引物對乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的 序列3所示DNA組成的引物對。本發(fā)明還提供了另一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的方法，包括如下步驟以待測病 毒的cDNA為模板，用特異引物對甲和特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增曲線甲；以待測 病毒的cDNA為模板，用特異引物對乙和所述特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增曲線乙； 根據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測病毒是否為候選的馬鈴薯V病毒；所述特異引物對 甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述特異引物對 乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對；所述特異探針為 TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴增曲線甲和所述擴增曲線乙 均為陽性，待測病毒為候選的馬鈴薯V病毒。所述待測病毒具體可為李痘病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯V病毒、馬鈴薯Y病毒或 香石竹環(huán)斑病毒。本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有馬鈴薯V病毒的方法，包括如下步 驟(1)提取待測樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對甲和特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增 曲線甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對乙和所述特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增 曲線乙；根據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測樣本中是否含有馬鈴薯V病毒；所述特異 引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述特異 引物對乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對；所述特異 探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴增曲線甲和所述擴增 曲線乙均為陽性，待測樣本含有馬鈴薯V病毒。所述TaqMan探針5’末端具體可連接有熒光報告染料FAM，3’末端具體可連接有 熒光淬滅染料TAMRA。不同的方法，靈敏度和準確性差異較大，如ELISA與PCR凝膠電泳方法靈敏度相差 100倍以上，PCR凝膠電泳與實時熒光PCR技術靈敏度相差也在100倍以上。即使同樣采用 實時熒光PCR技術，由于引物的擴增效率不一樣，靈敏度差異也可達到1000倍以上。在實 際檢測鑒定工作中，為了提高結(jié)果的準確性，經(jīng)常需要對一個結(jié)果進行兩個以上的確認試 驗，不同方法檢測靈敏度不一樣，很難保證兩個試驗的結(jié)果完全一樣，這就為結(jié)果的判斷增 加了難度，特別是在檢測目標含量極少的情況下，這種難度就會進一步加大。若兩套方法檢 測靈敏度一樣或非常接近，這個難題就迎刃而解。實時熒光PCR(Realtime-PCR)檢測技術是國際最近十余年發(fā)展起來的高新檢測
4技術，該技術將PCR擴增與熒光檢測系統(tǒng)有機結(jié)合起來。與目前已報道的其它檢測技術 相比，該技術具有巨大的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在(a)能實時觀察PCR過程中待檢測樣品模板 DNA(或cDNA)擴增情況，無需進行電泳、染色和紫外檢測，大大簡化了操作程序并縮短檢測 時間；(b)采用熒光信號放大功能，大大提高了靈敏度；(c)特異性引物與特異熒光探針雙 保險結(jié)構有效提高了檢測的準確性；(d)全封閉的操作系統(tǒng)，減少了 PCR產(chǎn)物對實驗室環(huán)境 的染污和樣品間的交叉染污，有效降低和避免了假陽性結(jié)果。實時熒光PCR技術，是目前最 準確、最靈敏的技術，其優(yōu)越性使之在植物檢疫中具有廣闊的應用范圍和前景。馬鈴薯V病毒(Potato virus V，PVV)是我國重要的檢疫性有害生物。本研究根據(jù) PVV中CP基因(coat protein gene)的保守序列，設計了三條巢式PCR引物和一條TaqMan 探針，建立了半巢式-RT-Realtime PCR檢測PVV的方法。與現(xiàn)有技術比較，本發(fā)明的優(yōu)點如下⑴上述實時熒光PCR技術的優(yōu)點在本發(fā)明 得以全部體現(xiàn)，如準確、靈敏、簡便、快速和能有效減少污染等；(2)設計上非常巧妙地將巢 式PCR的原理運用到實時熒光PCR技術中，并與實時熒光PCR技術有機結(jié)合；(3)在實時熒 光PCR技術的基礎上僅增加一條引物，就形成兩套獨立的實時熒光PCR反應系統(tǒng)；(4)兩套 引物探針相互驗證，進一步有效提高了結(jié)果的準確性；(5)兩套引物探針的擴增效率一致， 因此對于同一個樣品的兩次驗證實驗，結(jié)果的能保證基本一致，從而降低了結(jié)果判斷的難 度，在實際檢測工作、科研和解決重大的國際貿(mào)易爭端中具有極強的可操作性；(6)兩套引 物探針的擴增效率極高，檢出低限均可達5fg/y 1植物總RNA。


圖1為特異性測定中試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù)；A 為 PVV, B 為 PVA, C 為 PPV，D 為 PVY，E 為 CRSV, F 為 CKl, G 為 CK2。圖2為特異性測定中試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù)；A 為 PVV, B 為 PVA，C 為 PPV，D 為 PVYn，E 為 CRSV, F 為 CK1，G 為 CK2。圖3為靈敏度測定中試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù)；Α、 B、C、D、E、F、G、H、I、J 所對應的 RNA 濃度依次為 5ng/μ l、500pg/μ l、50pg/μ l、5pg/μ 1、 500fg/ μ 1、50pg/ μ 1、5fg/ μ 1、0· 5fg/ μ 1、0· 05fg/ μ 1、0· 005fg/ μ 1，K 對應 DEPC 水。圖4為靈敏度測定中試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù)；Α、 B、C、D、E、F、G、H、I、J 所對應的 RNA 濃度依次為 5ng/μ l、500pg/μ l、50pg/μ l、5pg/μ 1、 500fg/ μ 1、50pg/ μ 1、5fg/ μ 1、0· 5fg/ μ 1、0· 05fg/ μ 1、0· 005fg/ μ 1，K 對應 DEPC 水。圖5為試劑甲和試劑乙的擴增效率對比圖；縱軸為ARn,橫軸為循環(huán)數(shù)；A為試劑 甲，B為試劑乙。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實時熒光PCR基因擴增儀為ABI PRISM 7000(美國ABI公 司)；核酸蛋白分析儀為BioPhotometer (德國印pendorf公司)；植物總RNA提取試劑盒 (商品名Ε. Ζ. N.A ，美國Omega公司產(chǎn)品，貨號R2867_01)購自北京雙羸生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司(TaKaRa)(貨號DRR037A)、實時熒光PCR試劑盒(Platinum 定量PCR SuperMix-UDG，貨號C11730-025)購自美國Invitrogen公司。以下實施例中的 定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。實時熒光PCR的結(jié)果的判定標準為Ct值 < 40，為陽性；Ct值彡40，為陰性。馬鈴薯V 病毒(potato V virus, PVV) =ATCC 編號 PV-754 ；香石竹環(huán)斑病毒(Carnationringspot virus, CRSV) :ATCC 編號 PV-21 ；李痘病毒(Plumpox virus, PPV) =ATCC 編號 PVAS-709 ；馬鈴薯A 病毒(Potato Virus A, PVA) =ATCC 編號 PVAS-266 ；馬鈴薯Y 病毒(potato virus Y, PVY) =ATCC 編號 PV-50 ；ATCC 即美國標準菌種收藏所(American Type Culture Collection) , http:// www, atcc. orR/ο實施例1、試劑的制備一、引物和探針的設計根據(jù)美國NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中馬鈴薯V病毒基因組(NC_004010)中CP基因序列保 守區(qū)，分別設計一條上游引物(PVVF)、兩條下游引物(PVVR1和PVVR2)和一條Taqmam探針 (PVVP)。二、試劑的組成1、試劑甲的組成試劑盒由PVVF、PVVRl和PVVP組成(引物和探針由上海生工合成)。PVVF(上游引物)5，-CCGCAGCTGGTGAGCAAT-3，(序列表的序列 1)；PVVRl (下游引物)5，-GTGCCAGTTGTTCCTGCATTT-3，(序列表的序列 2)；PWP (探針)5，(FAM)-CATCCCGTTCTTCGAGACCCTTACTT-3，(TAMARA)；(核苷酸序 列為序列表的序列4，5’端標記報告熒光染料FAM，3’端標記淬滅熒光染料TAMRA)。PVVF和PVVRl的靶序列大小為67bp (見序列表的序列5)。2、試劑乙的組成試劑乙由PVVF、PVVR2和PVVP組成(引物和探針由上海生工合成)。PWF(上游引物)5，-CCGCAGCTGGTGAGCAAT-3，(序列表的序列 1)；PWR2(下游引物)5，-ATGCGCGGGATTGTGAAC-3，(序列表的序列 3)；PWP(探針)5，(FAM)-CATCCCGTTCTTCGAGACCCTTACTT-3，(TAMARA)；(核苷酸序 列為序列表的序列4，5’端標記報告熒光染料FAM，3’端標記淬滅熒光染料TAMRA)。PVVF和PVVR2的靶序列大小為85bp (見序列表的序列6)。實施例2、試劑的應用分別取感染五種病毒(PPV、PVA、PVV、PVY和CRSV)的馬鈴薯，取健康馬鈴薯葉片 作為對照，應用實施例1制備的試劑甲和試劑乙分別進行特異性測定、靈敏度測定，并進行 試劑甲和試劑乙的擴增效率對比。一、試劑的特異性測定1、總RNA提取及質(zhì)量控制用植物總RNA提取試劑盒從感染每種病毒的葉片(5種)和健康葉片(CKl)中分 別提取總RNA。用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測定其OD值，得出其濃度與純度值，并以此控制核酸質(zhì)量。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將步驟1從6種葉片中提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ； DEPC水作為總RNA的對照(CK2)。反應體系(25μ L) 5 μ L PrimerScript buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ), 1. 25 μ L Random 6 mers (100 μ Μ)，2 μ L 總 RNA,力口 DEPC 水至 25 μ L。反應條件37°C、15min，85°C、5s。3、試劑的特異性用實時熒光PCR試劑盒和實施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進行實時熒光PCR。試齊[J甲的反應體系(25yL) =PCR buffer (2 Χ) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVVF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVRl (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2.0 μ 1，補充 DEPC/K 至 25 μ 1。每個cDNA設置2個重復。試齊[J乙的反應體系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVVF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVR2(15yM)ly 1，PVVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2. 0 μ 1，補充 DEPC/K 至 25 μ 1。每個cDNA設置2個重復。試劑盒和試劑乙的反應體系均在ABI PRISM 7000的96孔板中進行；循環(huán)條件為 50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 個循環(huán)。采用試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果見圖1。采用試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果見圖2。 應用試劑甲只有在PW中出現(xiàn)擴增曲線(Ct值=24)，判為陽性；應用試劑乙只有在PVV中 出現(xiàn)擴增曲線(Ct值=25)。PVA、PPV、PVY、CRSV、CK1和CK2均未出現(xiàn)擴增信號，判為陰性。 結(jié)果表明，試劑甲(或試劑乙)的特異性很好，結(jié)果與預計相符。二、試劑的靈敏度測定1、總RNA提取和各個稀釋液的制備用植物總RNA提取試劑盒從感染PVV的葉片中提取總RNA。用核酸蛋白分析 儀BioPhotometer測定其OD值，得出其濃度和純度值。濃度值為50ng/l·! 1，純度值為 0D260/280 = 2. 14，0D260/230 = 2. 38。用DEPC水將提取的總RNA進行10倍梯度稀釋，得到各個稀釋液。各個稀釋液中， RNA 濃度分別為 5ng/ μ 1、500pg/ μ 1、50pg/ μ 1、5pg/ μ 1、500fg/ μ 1、50pg/ μ 1、5fg/ μ 1、 0. 5fg/y 1、0· 05fg/y 1、0· 005fg/y 1。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將各個稀釋液進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的 對照。反應體系(25μ L) 5 μ L PrimerScriρt Buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ), 1. 25 μ L Random 6 mers (100 μ Μ)，2 μ L 稀釋液，加 DEPC 水至 25 μ L。反應條件37°C、15min，85°C、5s。3、試劑的靈敏度
用實時熒光PCR試劑盒和實施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進行實時熒光PCR。試齊[J甲的反應體系(25yL) =PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVVF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVRl (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2.0 μ 1，補充 DEPC/K 至 25 μ 1。每個cDNA設置2個重復。試齊[J乙的反應體系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVVF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVR2(15yM)ly 1，PVVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2. 0 μ 1，補充 DEPC/K 至 25 μ I0每個cDNA至少2個重復。試劑甲和試劑乙的反應體系均在ABI PRISM 7000的96孔板中進行；循環(huán)條件為 50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 個循環(huán)。采用試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果見圖3。采用試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果見圖4。 應用試劑甲可以判為陽性的最低稀釋度為5fg/y 1植物總RNA(Ct值=39)；應用試劑乙可 以判為陽性的最低稀釋度為5fg/yl植物總RNA(Ct值=38)。結(jié)果表明，應用試劑甲(或 試劑乙)檢測的靈敏度可達10_7，即5fg/ μ 1植物總RNA0三、試劑甲和試劑乙的擴增效率對比1、總 RNA 提取用植物總RNA提取試劑盒從感染PPV的葉片中提取總RNA。用核酸蛋白分析儀 BioPhotometer測定其OD值，得出其濃度和純度值。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對照。反應體系同步驟一的2。3、試劑的靈敏度用實時熒光PCR試劑盒和實施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進行實時熒光PCR。方法同步驟一的3。實時熒光PCR結(jié)果見圖5。采用試劑甲的Ct值=21 ；采用試劑乙的Ct值=21。 結(jié)果表明，試劑甲和試劑乙的擴增效率幾乎完全一樣。
權利要求
1.一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序列1 所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。
2.如權利要求1所述的試劑，其特征在于所述試劑由所述特異引物和特異探針組成； 所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
3.如權利要求2所述的試劑，其特征在于所述特異探針為TaqMan探針。
4.權利要求1至3中任一所述的試劑在制備輔助鑒定馬鈴薯V病毒的試劑盒中的應用。
5.一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的試劑盒，包括權利要求1至3中任一所述的試劑。
6.權利要求1至3中任一所述的試劑在輔助鑒定馬鈴薯V病毒中的應用。
7.一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒的cDNA為模板，用 特異引物對甲進行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測病毒的cDNA為模板，用特異引物對乙進行 PCR,得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為67bp且PCR產(chǎn)物乙為85bp，待測病毒為候選的馬 鈴薯V病毒；所述特異引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組 成的引物對；所述特異引物對乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組 成的引物對。
8.一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒的cDNA為模板，用 特異引物對甲和特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增曲線甲；以待測病毒的cDNA為模板， 用特異引物對乙和所述特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增曲線乙；根據(jù)擴增曲線甲和 擴增曲線乙判斷待測病毒是否為候選的馬鈴薯V病毒；所述特異引物對甲為序列表的序列 1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述特異引物對乙為序列表的序列1 所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸 序列如序列表的序列4所示。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待測病毒為李痘病毒、馬鈴薯A病 毒、馬鈴薯V病毒、馬鈴薯Y病毒或香石竹環(huán)斑病毒。
10.一種檢測待測樣本中是否含有馬鈴薯V病毒的方法，包括如下步驟(1)提取待測樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為CDNA；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對甲和特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增曲線 甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對乙和所述特異探針進行實時熒光PCR，得到擴增曲線 乙；根據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測樣本中是否含有馬鈴薯V病毒；所述特異引物 對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述特異引物 對乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對；所述特異探針 為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定馬鈴薯V病毒的試劑及其應用。本發(fā)明提供的試劑包括由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的特異引物。所述試劑還可包括核苷酸序列如序列表的序列4所示的特異探針。馬鈴薯V病毒是我國重要的檢疫性有害生物。本發(fā)明中利用三條PCR引物和一條TaqMan探針，建立了半巢式-RT-Realtime PCR檢測PVV的方法。該方法有機地結(jié)合了巢式PCR和實時熒光PCR技術；三條引物形成的兩套PCR體系相互驗證，有效提高了結(jié)果的準確性；熒光探針有效提高了檢測的靈敏度。實驗結(jié)果表明，本方法準確、靈敏、簡便、快速，檢出低限均可達5fg/μl植物總RNA。
文檔編號G01N21/64GK102002538SQ20101056115
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權日2010年11月26日
發(fā)明者張永江, 李彬, 李明福, 楊益娥, 王真, 粟智平, 陳洪俊 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院, 煙臺出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心