專利名稱：含色氨酸殘基的肽的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用固相法來(lái)合成含色氨酸(Trp)殘基的肽的方法。
背景技術(shù)：
促黃體激素釋放激素(LHRH)是一種由下腦丘產(chǎn)生的神經(jīng)傳遞質(zhì)，其功能是使垂體穩(wěn)定分泌促黃體生成激素(LHRH)和促卵泡激素(FSH)，這些激素反過(guò)來(lái)會(huì)刺激甾類激素的合成，比如來(lái)自于性腺的睪丸激素。許多目前出售的促黃體激素釋放激素肽的類似物(比如激動(dòng)劑和拮抗劑)是用來(lái)治療子宮內(nèi)膜異位、前列腺癌、性早熟以及其他的激素紊亂癥狀。合成這種LHRH類似物的方法難度大，而且昂貴。
固相肽的合成在1963年引入，目的是克服許多與溶液相合成相關(guān)的中間體的純化問(wèn)題。Stewart等，固相肽合成(Pierce Chemical Co.，第二版)1984。在固相合成中，氨基酸組裝(即偶聯(lián))在任意所需的序列肽上，其鏈的一端固定在一個(gè)不溶性支持物上。一旦所需的序列肽已連接在支持物上，肽就被從支持物上剝離(即切割)。
美國(guó)專利No.4,010,125(1977)描述了[D-Trp6]-LHRH的合成，其中LHRH激動(dòng)劑十個(gè)殘基中有四個(gè)殘基的側(cè)鏈被保護(hù)(例如L-甲苯磺?；M氨酰、芐基絲氨酰、(2，6-二-氯-Bzl)酪氨酰和L-甲苯磺?；滨?。然而，Coy等，Int.J.Peptide Protein Res.14359(1979)后來(lái)報(bào)道的合成許多其他LHRH激動(dòng)劑的方法，其中最小量的側(cè)鏈保護(hù)，比如只有鹽保護(hù)的精氨酸(即Arg.HCl)，比相應(yīng)的保護(hù)合成的產(chǎn)量要大。本發(fā)明涉及下述發(fā)現(xiàn)在固相合成中色氨酸殘基的保護(hù)的確提高了含色氨酸殘基的LHRH類似物(比如[D-Trp6]-LHRH)的產(chǎn)量，盡管在合成LHRH類似物中本領(lǐng)域的趨勢(shì)不是保護(hù)氨基酸的側(cè)鏈。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供了一種合成具有通式(I)的肽的方法A1-A2-A3-Ser-A5-D-Trp-Leu-A8-Pro-A10-R1(I)其中A1是對(duì)谷氨酸(pGlu)或N-Ac-D-β-Nal；A2是組氨酸、D-p-Cl-Phe或D-p-F-Phe；A3是色氨酸或D-色氨酸；A5是酪氨酸、NicLys、cPzACAla或PicLys；A8是精氨酸、hArg(Et)2、hArg(Bu)、hArg(CH2CF3)2或Lys(iPr)；A10是甘氨酸、D-丙氨酸或缺失的；和R1是NH2或NHEt；其包含以下步驟(a)如果A10存在，就將Boc-A10的銫鹽，或者如果A10不存在，就將Boc-Pro的銫鹽連接在氯甲基化的聚苯乙烯樹脂上以分別產(chǎn)生Boc-A10-樹脂或Boc-Pro-樹脂；(b)通過(guò)使Boc-A10-樹脂或Boc-Pro-樹脂與Boc去封閉的有機(jī)酸混合分別產(chǎn)生H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂的有機(jī)酸鹽而將Boc-A10-樹脂或Boc-Pro-樹脂去封閉；(c)將H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂的有機(jī)酸鹽與堿中和分別產(chǎn)生H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂；(d)以從C端到N端的順序，將H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂與Boc-α-胺保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)，所述保護(hù)的氨基酸對(duì)應(yīng)于通式(I)中所限定的氨基酸，其包括(i)將H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂與Boc-α-胺保護(hù)的氨基酸在肽偶合劑的存在下反應(yīng)產(chǎn)生Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物；(ii)通過(guò)將Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物和Boc去封閉的有機(jī)酸混合，從Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物中去封閉Boc基團(tuán)，生成偶聯(lián)產(chǎn)物；(iii)將偶聯(lián)產(chǎn)物和下一個(gè)Boc-α-胺保護(hù)的氨基酸在肽偶合劑的存在下反應(yīng)產(chǎn)生Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物；(iv)通過(guò)將Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物和Boc去封閉的有機(jī)酸混合，從Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物中去封閉Boc基團(tuán)，生成下一個(gè)偶聯(lián)產(chǎn)物；(v)重復(fù)步驟(d)(iii)和(d)(iv)直到通式(I)的肽的N端氨基酸偶聯(lián)完畢，N端氨基酸Boc基團(tuán)被去封閉產(chǎn)生完整保護(hù)的肽-樹脂；(e)切割及去保護(hù)被完整保護(hù)的肽樹脂以生成通式(I)的肽，其包括(i)在乙醇/極性非質(zhì)子惰性溶劑混合物中制備完整保護(hù)的肽樹脂溶液；(ii)將溶液冷卻到約0℃-約10℃；(iii)將氨氣或乙胺氣體緩慢通入溶液起泡，保持冷卻溫度直到溶液被氨氣充分飽和而產(chǎn)生飽和溶液；(iv)在無(wú)冷卻條件下混合飽和溶液大約15-36小時(shí)，直到大于95％的游離甲酯，若用氨氣，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺，或若用乙胺氣體，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的乙酰胺；和(f)從所述溶液中分離出肽。
上述方法的優(yōu)選方法是A10是甘氨酸。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中將以下的Boc-α-胺氨基酸從C端到N端連續(xù)偶聯(lián)N-α-Boc-L-脯氨酸、N-α-Boc-L-精氨酸·鹽酸、N-α-Boc-L-亮氨酸、N-α-Boc-D-色氨酸(N’-吲哚-甲?；?、N-α-Boc-L-酪氨酸、N-α-Boc-L-絲氨酸水合物、N-α-Boc-色氨酸(N’-吲哚-甲?；?、N-α-Boc-L-組氨酸(甲苯磺?；?-環(huán)己胺鹽和焦谷氨酸。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中通過(guò)用包含氨、伯胺或仲胺和乙醇的溶液處理去掉色氨酸側(cè)鏈上甲?；Ｗo(hù)基。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中該溶液包含氨和甲醇。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中從該溶液中分離出該肽的步驟包括(i)過(guò)濾該溶液得到濾液；和(ii)濃縮該濾液。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中具有通式(I)的肽是pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中當(dāng)偶聯(lián)N-α-Boc-D-色氨酸(N’-吲哚-甲?；?、N-α-Boc-L-酪氨酸、N-α-Boc-L-絲氨酸水合物和N-α-Boc-色氨酸(N’-吲哚-甲?；?時(shí)也用到1-羥基苯并三唑(HOBT)。
另一方面，本發(fā)明提供了固相合成具有通式(II)的肽的方法，A1-A2-A3-Ser-A5-A6-Leu-A8-Pro-A10-R1，(II)其中A1是對(duì)谷氨酸或N-Ac-D-β-Nal；A2是組氨酸D-p-Cl-Phe或D-p-F-Phe；A3是色氨酸、D-色氨酸、D-β-Nal或D-Pal；A5是酪氨酸、NicLys、cPzACAla或PicLys；A6是D-β-Nal、D-hArg(Et)2、D-Lys(iPr)、D-hArg(Bu)、D-hArg(CH2CF3)2、D-His(Bzl)、D-Leu、D-Pal、D-Ser(tBu)、D-Trp、D-Cit、D-Arg、D-NicLys、D-PicLys或D-Qal；A8是精氨酸、hArg(Et)2、hArg(Bu)、hArg(CH2CF3)2或Lys(iPr)；A10是甘氨酸、NHNHCO或D-丙氨酸或缺失的；和。
R1是NH2或NHEt。
其中A3或A6中至少一個(gè)是色氨酸或D-色氨酸，該方法包含用對(duì)堿不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)臨時(shí)性保護(hù)任何色氨酸殘基，其中所述保護(hù)基團(tuán)在與堿反應(yīng)時(shí)從固相支持物上切割具有通式(II)的肽時(shí)被去掉。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中該色氨酸(Trp)或D-色氨酸(D-Trp)側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是酰基。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中該Trp或D-Trp側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)通過(guò)用包含氨、伯胺或仲胺和乙醇的溶液處理來(lái)去掉。
緊接著上述方法的另一個(gè)優(yōu)選方法是該側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是甲酰基，以及該堿是含有氨的甲醇溶液。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中A3是色氨酸。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中A1是對(duì)谷氨酸，A2是組氨酸，A5是酪氨酸，A6是D-色氨酸，A8是精氨酸，A10是甘氨酸和R1是NH2。
另一方面，本發(fā)明涉及一種固相合成具有通式pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的肽的方法，其包含將下列被保護(hù)的氨基酸連續(xù)偶聯(lián)到固相支持物上的步驟Boc-甘氨酸、Boc-脯氨酸、Boc-精氨酸·鹽酸、Boc-亮氨酸、Boc-D-色氨酸(PG-1)、Boc-酪氨酸、Boc-絲氨酸、Boc-色氨酸(PG-1)、Boc-組氨酸(PG-2)和Boc-對(duì)谷氨酸，其中PG-1是對(duì)堿不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)，PG-2是組氨酸的保護(hù)基團(tuán)，以及所述方法包括從所述支持物上切割該肽和用含堿的溶液從色氨酸殘基上去除該P(yáng)G-1。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中該P(yáng)G-1是?；?。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中該溶液包含氨、伯胺或仲胺。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中該P(yáng)G-2是甲苯磺?；?tosyl)。
緊接著上述方法的優(yōu)選方法是其中該P(yáng)G-1是甲?；?，及該溶液包含氨。
本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)可以從本發(fā)明的詳細(xì)描述以及權(quán)利要求中一目了然。
縮寫詞BOC＝叔丁氧基羰基Cit＝瓜氨酸CPzACAla＝順式-3-(4-吡嗪基羰基氨基環(huán)己基)丙氨酸hArg(Bu)＝N-胍基-(丁基)-高精氨酸hArg(Et)2＝N，N’-胍基-(二甲基)-高精氨酸hArg(CH2CF3)2＝N，N’-胍基-雙-(2，2，2-三氟乙基)-高精氨酸HOBT＝1-羥基苯并三唑Lys(iPr)＝Nε-異丙基賴氨酸β-Nal＝β-1-萘基丙氨酸或β-2-萘基丙氨酸，除非有其他說(shuō)明NicLys＝Nε-煙酰賴氨酸
Pal＝吡啶基丙氨酸p-Cl-Phe＝3-(4-氯苯)丙氨酸p-F-Phe＝3-(4-氟苯)丙氨酸PicLys＝Nε-甲基吡啶酰基賴氨酸(picolinoyl lysine)Qal＝喹啉基丙氨酸可以肯定本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本說(shuō)明的基礎(chǔ)上會(huì)最大限度地利用此專利。因此以下的具體實(shí)施方案僅僅是說(shuō)明而不是為本發(fā)明限定范圍。
除非另有定義，這里所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域中一個(gè)普通技術(shù)人員通常所理解的意思相同。這里提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)在此專門引作參考。
具有通式(I)的肽的制備方法是可以在Merrifield樹脂上用Boc化學(xué)固相肽合成，接著用氨、伯胺或仲胺的乙醇溶液將肽從樹脂上切割。
根據(jù)本發(fā)明，該方法中的第一步是將C端氨基酸的銫鹽，Boc-A10，通過(guò)酯鍵連接在Merrifield樹脂上。在甲醇和水的混合溶液中將Boc-A10加入碳酸銫中可得到Boc-A10的銫鹽。真空干燥Boc-A10的銫鹽，然后在無(wú)水的極性非質(zhì)子溶劑，比如二甲基甲酰胺中與聚苯乙烯上的氯甲芐基反應(yīng)。該反應(yīng)要進(jìn)行24到48小時(shí)，優(yōu)選是在45℃到60℃反應(yīng)36小時(shí)，50℃為最佳。然后過(guò)濾反應(yīng)樹脂，用水、極性非質(zhì)子溶劑比如DMF(二甲基甲酰胺)、醇比如甲醇清洗，優(yōu)選在減壓條件下干燥至恒重。干燥的樹脂可以被測(cè)試以確定Boc-A10的含量，該含量以每克干樹脂中所含A10的毫摩爾數(shù)來(lái)表示。計(jì)算值用來(lái)為隨后的材料用量和理論產(chǎn)量確定該組裝反應(yīng)的規(guī)模。
合成通式(I)的肽可以在底部有燒結(jié)的玻璃圓盤過(guò)濾器的玻璃反應(yīng)器中的Boc-A10-樹脂上進(jìn)行。反應(yīng)器用機(jī)械攪拌子攪拌，其排液方法是施加惰性氣壓比如氮?dú)鈮簛?lái)強(qiáng)迫液體通過(guò)底部的燒結(jié)的圓盤，同時(shí)保留樹脂在反應(yīng)器中。首先，通過(guò)兩次將A10-樹脂與有機(jī)酸的混合物在氯化了的溶劑中混合約兩分鐘，再繼續(xù)混合約25分鐘使Boc-A10上的Boc基團(tuán)從A10-樹脂中除去(如去封閉)，溶劑優(yōu)選是25％三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)，接著用氮?dú)鈮号鸥伞10-樹脂用DCM清洗三次，用醇比如異丙醇(IPA)清洗兩次，在惰性溶劑中將所得的氨基TFA鹽與堿中和兩次，優(yōu)選是在10％三乙胺堿的DCM中，每次中和約五分鐘，接著再用DCM清洗三次。在極性非質(zhì)子溶劑中用肽偶合劑，優(yōu)選二異丙基碳二亞胺(DIC)，將樹脂與2.5摩爾當(dāng)量的Boc-α-氨保護(hù)的對(duì)應(yīng)于通式(I)定義的氨基酸從C端到N端偶聯(lián)，優(yōu)選的反應(yīng)介質(zhì)是DMF/DCM混合物。每次偶聯(lián)之后都要用DMF和DCM清洗。對(duì)各偶聯(lián)完成，樹脂都可以用Kaiser Ninhydrin測(cè)試，除了精氨酸是用靛紅檢測(cè)未被偶聯(lián)的脯氨酸殘基上的仲胺以外。從每個(gè)偶聯(lián)的氨基酸上去除Boc基團(tuán)，按上述方法進(jìn)行測(cè)試。下列對(duì)應(yīng)于通式(I)的氨基酸的保護(hù)的氨基酸在本發(fā)明的合成中是最佳的N-α-Boc-L-脯氨酸、N-α-Boc-L-精氨酸·鹽酸、N-α-Boc-L-亮氨酸、N-α-Boc-D-色氨酸(N’-吲哚-甲酰基)、N-α-Boc-L-酪氨酸、N-α-Boc-L-絲氨酸水合物、N-α-Boc-L-組氨酸(甲苯磺?；?-環(huán)己胺鹽和焦谷氨酸。
當(dāng)偶聯(lián)D-色氨酸、酪氨酸、絲氨酸和色氨酸的被保護(hù)衍生物時(shí)可采用1-HOBT(3-5當(dāng)量)。在最終的氨基酸偶聯(lián)后，在DMF中用HOBT處理兩次(每次-小時(shí))可將組氨酸的甲苯磺酰基側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)去掉。Boc-D-色氨酸和Boc-L-色氨酸的側(cè)鏈用位于吲哚環(huán)的氮上的甲?；Ｗo(hù)。在從樹脂上切割肽時(shí)用堿將甲?；サ簟?br> 完整的肽-樹脂在配衡的燒結(jié)玻璃漏斗中用惰性的氯化了的溶劑比如DCM清洗，用醇比如甲醇清洗兩次，然后真空干燥。干燥的肽-樹脂轉(zhuǎn)移到一升的三頸圓底燒瓶中。以每克肽-樹脂約15毫升的9∶1的甲醇/DMF的混合液加入圓底燒瓶中。如果肽上的C端的酰胺形式是理想的，則將溶液冷卻到低于約10℃，在強(qiáng)冷條件下通入氨氣起泡直到充分飽和(大約一小時(shí))，其中肽從樹脂上以游離甲酯中間體形式被釋放。讓溶液在無(wú)冷卻條件下進(jìn)一步混合15-36小時(shí)，此時(shí)大約大于95％的游離甲酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺產(chǎn)物。反應(yīng)進(jìn)程可被監(jiān)測(cè)，比如用高效液相色譜(HPLC)，達(dá)到理想結(jié)果時(shí)可以終止反應(yīng)。產(chǎn)物用燒結(jié)玻璃漏斗過(guò)濾到溶液中，樹脂用甲醇和DMF清洗幾次。所有清洗液和過(guò)濾液均被濃縮至非常濃的油狀物。加入乙酸乙酯，溶液研磨得到固化產(chǎn)品，傾析，繼續(xù)用乙酸乙酯研磨。粗產(chǎn)物溶解在甲醇中，加入等體積的4N醋酸。濃縮溶液去掉所有甲醇。產(chǎn)物用4N醋酸稀釋。
通過(guò)在前一段中的過(guò)程將氨替代為乙胺可以獲得肽的C端乙酰胺形式，其中在用乙胺飽和溶液的過(guò)程中，其溫度保持在約16℃以下，最佳溫度是約5℃到約15℃。
粗材料可以通過(guò)反復(fù)的反相制備色譜運(yùn)行來(lái)純化，凍干得到最終產(chǎn)品。
對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言可以用其他的溶劑體系，包括但是并不是局限于低分子量的醇比如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、叔-丁醇以及類似物，其他極性非質(zhì)子溶劑及其混合物。
實(shí)施發(fā)明的方式下面的實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明的方法，但本發(fā)明并不局限于此。實(shí)施例合成pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2([D-Trp6]LHRH-NH2)通過(guò)固相肽合成法在merrifield樹脂上用Boc化學(xué)制備[D-Trp6]LHRH-NH2，然后用甲醇氨從樹脂上切割肽以產(chǎn)生標(biāo)題肽。
該方法的第一步是將C端氨基酸的銫鹽，Boc-甘氨酸，通過(guò)酯鍵連接在Merrifield樹脂上。在甲醇和水的混合溶液(80ml/40ml)中將Boc-甘氨酸(40.9g)與碳酸銫反應(yīng)可得到Boc-甘氨酸的銫鹽。真空干燥Boc-甘氨酸的銫鹽，然后在無(wú)水的二甲基甲酰胺(DMF；200ml)中與聚苯乙烯珠(Merrifield樹脂；Advanced Chemtech，88.2g)上的氯甲芐基反應(yīng)。該反應(yīng)要在約50℃下在BuchiTMModel 110旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行約36小時(shí)。然后過(guò)濾反應(yīng)樹脂，用水、DMF、甲醇清洗，在低于35℃下真空干燥至恒重。然后干燥的樹脂可以被測(cè)試以確定Boc-甘氨酸的含量，該含量以每克干樹脂中所含甘氨酸的毫摩爾數(shù)來(lái)表示。計(jì)算值為0.872毫摩爾/克，并用來(lái)為隨后的材料用量和理論產(chǎn)量確定該組裝反應(yīng)的規(guī)模。
肽的合成可以在底部和頂端有燒結(jié)的玻璃圓盤過(guò)濾器的500ml玻璃反應(yīng)器中的Boc-甘氨酸樹脂(12.5克)上進(jìn)行。反應(yīng)器從底部裝滿然后倒置搖晃(在三秒內(nèi)旋轉(zhuǎn)180度)。首先，通過(guò)兩次將樹脂與175毫升25％的三氟乙酸(TFA)混合在二氯甲烷(DCM)(2分鐘和25分鐘)中使Boc基團(tuán)從甘氨酸樹脂中除去，接著在氮?dú)鈮褐信鸥?。樹脂?25毫升DCM清洗三次，用異丙醇(IPA)清洗兩次，再用125毫升DCM清洗三次。所得的氨基TFA鹽與125ml的10％三乙胺堿在DCM中中和兩次，每次五分鐘，然后再用DCM清洗三次。
將樹脂與2.5摩爾當(dāng)量的下列Boc保護(hù)的氨基酸和4.2毫升的二異丙基碳二亞酰胺(DIC)的混合物在16毫升DMF和47毫升DCM中偶聯(lián)和去封閉5.84g Boc-L-脯氨酸、8.93g Boc-L-精氨酸·鹽酸、6.77gBoc-L-亮氨酸、9.0g Boc-D-色氨酸(甲?；?、7.64g Boc-L-酪氨酸、9.0gBoc-L-色氨酸(甲?；?、6.06g Boc-L-絲氨酸水合物、16g Boc-L-組氨酸(甲苯磺?；?-環(huán)己胺鹽和13.5g焦谷氨酸。在D-Trp、酪氨酸、絲氨酸、色氨酸偶聯(lián)中也用1-HOBT。在偶聯(lián)精氨酸時(shí)以75ml二甲基乙酰胺(DMA)取代DMF和DCM。樹脂用DMF和DCM清洗，用KaiserNinhydrin來(lái)檢測(cè)偶聯(lián)完成。如上所述Boc基團(tuán)從每個(gè)偶聯(lián)的氨基酸中去除。組氨酸用甲苯磺酰基進(jìn)行側(cè)鏈保護(hù)，在最終氨基酸偶聯(lián)之后以4.16克HOBT的105毫升DMF處理兩次，每次1小時(shí)，來(lái)去掉甲苯磺?；oc-D-色氨酸和Boc-L-色氨酸用甲?；M(jìn)行側(cè)鏈保護(hù)，在從樹脂上切割肽時(shí)去掉甲?；?。
完整的肽-樹脂用DCM清洗到配衡的燒結(jié)玻璃漏斗中，用甲醇清洗兩次，然后真空干燥。干燥的肽-樹脂轉(zhuǎn)移到一升的三頸圓底燒瓶中。每克肽-樹脂15毫升的9∶1的甲醇/DMF(380ml對(duì)應(yīng)于10.9mM)的混合液加入燒瓶中。溶液冷卻到低于約10℃，在強(qiáng)冷條件下緩慢通入氨氣起泡直到充分飽和(大約一小時(shí))。讓溶液在無(wú)冷卻條件下繼續(xù)混合約15-36小時(shí)，直到大于95％的游離甲酯轉(zhuǎn)化為由高效液相色譜(HPLC)監(jiān)測(cè)所確定的酰胺產(chǎn)物。產(chǎn)物用燒結(jié)玻璃漏斗過(guò)濾到溶液中，樹脂用甲醇和DMF清洗幾次。所有清洗液和過(guò)濾液均在溫度低于40℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至非常濃的油狀物。加入乙酸乙酯(0.08升)，溶液研磨得到固化的產(chǎn)品，傾析，繼續(xù)用0.08升乙酸乙酯研磨。把又硬又粘的產(chǎn)品浸泡在乙酸乙酯中過(guò)夜，然后傾析。粗產(chǎn)物溶解在(0.07升)甲醇中，加入等體積的4N醋酸。在溫度低于40℃時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮溶液去掉所有甲醇。產(chǎn)物用4N醋酸稀釋到濃度為35克/升。
粗材料可以通過(guò)反復(fù)的反相制備色譜運(yùn)行來(lái)純化，凍干得到最終產(chǎn)品(8.4克，59％產(chǎn)率)為純度大于99％的白色固體。
其他實(shí)施方案從以上描述中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地確認(rèn)本發(fā)明的必要特點(diǎn)，在不偏離本發(fā)明范圍和實(shí)質(zhì)的情況下，能夠作出許多的變化和調(diào)整以適應(yīng)不同的用途和條件。這樣，其他的實(shí)施方案也在本權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備具有通式(I)的肽的方法，A1-A2-A3-Ser-A5-D-Trp-Leu-A8-Pro-A10-R1(I)其中A1是對(duì)谷氨酸或N-Ac-D-β-Nal；A2是組氨酸、D-p-Cl-Phe或D-p-F-Phe；A3是色氨酸或D-色氨酸；A5是酪氨酸、NicLys、cPzACAla或PicLys；A8是精氨酸、hArg(Et)2、hArg(Bu)、hArg(CH2CF3)2或Lys(iPr)；A10是甘氨酸、D-丙氨酸或缺失的；和R1是NH2或NHEt；其包含以下步驟(a)如果A10存在，就將Boc-A10的銫鹽，或者如果A10不存在，就將Boc-Pro的銫鹽連接在氯甲基化的聚苯乙烯樹脂上以分別產(chǎn)生Boc-A10-樹脂或Boc-Pro-樹脂；(b)通過(guò)使Boc-A10-樹脂或Boc-Pro-樹脂與Boc去封閉的有機(jī)酸混合分別產(chǎn)生H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂的有機(jī)酸鹽而將Boc-A10-樹脂或Boc-Pro-樹脂去封閉；(c)將H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂的有機(jī)酸鹽與堿中和分別產(chǎn)生H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂；(d)以從C端到N端的順序，將H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂與Boc-α-胺保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)，所述保護(hù)的氨基酸對(duì)應(yīng)于通式(I)中所限定的氨基酸，其包括(i)將H2N-A10-樹脂或H2N-Pro-樹脂與Boc-α-胺保護(hù)的氨基酸在肽偶合劑的存在下反應(yīng)產(chǎn)生Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物；(ii)通過(guò)將Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物和Boc去封閉的有機(jī)酸混合，從Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物中去封閉Boc基團(tuán)，生成偶聯(lián)產(chǎn)物；(iii)將偶聯(lián)產(chǎn)物和下一個(gè)Boc-α-胺保護(hù)的氨基酸在肽偶合劑的存在下反應(yīng)產(chǎn)生Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物；(iv)通過(guò)將Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物和Boc去封閉的有機(jī)酸混合，從Boc封閉的偶聯(lián)產(chǎn)物中去封閉Boc基團(tuán)，生成下一個(gè)偶聯(lián)產(chǎn)物；(v)重復(fù)步驟(d)(iii)和(d)(iv)直到通式(I)的肽的N端氨基酸偶聯(lián)完畢，以及N端氨基酸的Boc基團(tuán)被去封閉產(chǎn)生完整保護(hù)的肽樹脂；(e)切割以及去保護(hù)被完整保護(hù)的肽樹脂生成通式(I)的肽，其中所述切割和去保護(hù)包括(i)在乙醇/極性非質(zhì)子惰性溶劑混合物中制備被完整保護(hù)的肽樹脂溶液；(ii)將溶液冷卻到約0℃-約10℃；(iii)將氨氣或乙胺氣體緩慢通入溶液起泡，并保持冷卻溫度直到溶液被氨氣充分飽和以產(chǎn)生飽和溶液；(iv)在無(wú)冷卻條件下使飽和溶液混合大約15-36小時(shí)，直到大于95％的游離甲酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺，條件是用氨氣，或轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的乙酰胺，條件是用乙胺氣體；(f)從該溶液中分離肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中A10是甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中將下列Boc-α-胺氨基酸從C端到N端連續(xù)偶聯(lián)N-α-Boc-L-脯氨酸、N-α-Boc-L-精氨酸·鹽酸、N-α-Boc-L-亮氨酸、N-α-Boc-D-色氨酸(N’-吲哚-甲?；?、N-α-Boc-L-酪氨酸、N-α-Boc-L-絲氨酸水合物、N-α-Boc-色氨酸(N’-吲哚-甲?；?、N-α-Boc-L-組氨酸(甲苯磺?；?-環(huán)己胺鹽和焦谷氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中色氨酸側(cè)鏈上的甲酰基保護(hù)基團(tuán)用包含氨、伯胺或仲胺和醇的溶液處理來(lái)去掉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述溶液包含氨和甲醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述肽的通式(I)為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在偶聯(lián)N-α-Boc-D-色氨酸(N’-吲哚-甲?；?、N-α-Boc-L-酪氨酸、N-α-Boc-L-絲氨酸水合物和N-α-Boc-色氨酸(N’-吲哚-甲?；?時(shí)還使用1-羥基苯并三唑(HOBT)。
8.一種固相合成具有通式(II)的肽的方法，A1-A2-A3-Ser-A5-A6-Leu-A8-Pro-A10-R1，(II)其中A1是對(duì)谷氨酸或N-Ac-D-β-Nal；A2是組氨酸、D-p-Cl-Phe或D-p-F-Phe；A3是色氨酸、D-色氨酸、D-β-Nal或D-Pal；A5是酪氨酸、NicLys、cPzACAla或PicLys；A6是D-β-Nal、D-hArg(Et)2、D-Lys(iPr)、D-hArg(Bu)、D-hArg(CH2CF3)2、D-His(Bzl)、D-Leu、D-Pal、D-Ser(tBu)、D-Trp、D-Cit、D-Arg、D-NicLys、D-PicLys或D-Qal；A8是精氨酸、hArg(Et)2、hArg(Bu)、hArg(CH2CF3)2或Lys(iPr)；A10是甘氨酸、NHNHCO或D-丙氨酸或缺失的；和R1是NH2或NHEt；其中A3或A6中至少一個(gè)是色氨酸或D-色氨酸，該方法包含用對(duì)堿不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)臨時(shí)性保護(hù)任何色氨酸殘基，其中所述保護(hù)基團(tuán)通過(guò)與堿反應(yīng)從固相支持物上切割具有通式(II)的肽時(shí)被去掉。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述色氨酸或D-色氨酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是?；?。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述色氨酸或D-色氨酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)用包含氨、伯胺或仲胺和醇的溶液處理來(lái)去掉。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是甲?；约霸搲A是包含氨的甲醇溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中A3是色氨酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中A1是對(duì)谷氨酸，A2是組氨酸，A5是酪氨酸，A6是D-色氨酸，A8是精氨酸，A10是甘氨酸，和R1是NH2。
14.一種固相合成具有通式為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的肽的方法，其包括將以下被保護(hù)的氨基酸連續(xù)偶聯(lián)在固相支持物上的步驟Boc-甘氨酸、Boc-脯氨酸、Boc-精氨酸·鹽酸、Boc-亮氨酸、Boc-D-色氨酸(PG-1)、Boc-酪氨酸、Boc-絲氨酸、Boc-色氨酸(PG-1)、Boc-組氨酸(PG-2)和Boc-對(duì)谷氨酸，其中PG-1是對(duì)堿不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)和PG-2是組氨酸的保護(hù)基團(tuán)，該方法包含從所述支持物上切割該肽以及用含堿的溶液從所述色氨酸殘基上去除PG-1。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述PG-1是?；?br> 16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述溶液包含氨、伯胺或仲胺。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述PG-2是甲苯磺?；?。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述PG-1是甲酰基，以及該溶液包含氨。
19.一種制備具有通式(I)的肽的方法，其在權(quán)利要求1中給出并限定，基本上如本說(shuō)明書所描述和舉例。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固相合成含有至少一個(gè)色氨酸殘基的肽的方法，其中所述方法包含用對(duì)堿不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)暫時(shí)性保護(hù)所述色氨酸殘基的吲哚環(huán)，其中所述保護(hù)基團(tuán)在所述肽從固相支持物上切割過(guò)程中被去除。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1481389SQ01821038
公開日2004年3月10日 申請(qǐng)日期2001年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月22日
發(fā)明者史蒂文·艾倫·杰克遜, 史蒂文 艾倫 杰克遜 申請(qǐng)人:基納頓有限公司