專利名稱：色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種氨基酸合成代謝途徑加強的基因工程菌。
背景技術(shù)：
L-色氨酸(tryptophan)，又名β-吲哚-α-氨基丙酸，屬于芳香族氨基酸。L-色氨酸在人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝中起重要作用。目前，L-色氨酸作為原料廣泛應用于加工配制飼料、保健食品、配方膳、氨基酸片劑和氨基酸注射液等。
L-色氨酸最早生產(chǎn)時主要依賴于蛋白質(zhì)水解和化學合成，以后又出現(xiàn)了發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)工藝，但是，上述方法存在著工藝繁瑣、成本高或產(chǎn)量不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)需求等問題，使國際氨基酸市場上L-色氨酸價格長期居高不下。隨著基因工程技術(shù)方法的產(chǎn)生和發(fā)展，為構(gòu)建高產(chǎn)氨基酸基因工程菌提供了新的機遇，尤其是近年來第三代基因工程技術(shù)(即代謝途徑工程技術(shù))的出現(xiàn)更進一步推動了氨基酸基因工程菌研究的發(fā)展。1979年，前蘇聯(lián)首先成功地利用體外構(gòu)建重組質(zhì)粒的基因工程方法選育了高產(chǎn)蘇氨酸生產(chǎn)菌，滿足了工業(yè)化生產(chǎn)蘇氨酸的要求，開創(chuàng)了氨基酸發(fā)酵工業(yè)的新紀元。自上世紀80年代中期以來，用體外重組技術(shù)的方法構(gòu)建氨基酸生產(chǎn)菌株的研究在國外廣泛開展，并取得了不少進展。目前，國內(nèi)尚沒有采用第三代基因工程技術(shù)研究選育色氨酸基因工程菌的專利申請。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌。
本發(fā)明的第四個目的是提供一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌的應用。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒，用下述方法制成采用pET22b(+)單質(zhì)粒多基因串聯(lián)表達的策略，將色氨酸合成酶基因trpBA與磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體M3serA基因串聯(lián)，得重組質(zhì)粒pET-T7 promotor-M3serA-T7promotor-trpBA-T7 terminator，命名為M3BAT-I。
一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，用下述方法獲得以λDE3噬菌體侵染宿主菌Escherichisa coli 491，使溶源化后的命名為DE3-491的細菌的染色體上含有一拷貝由lacUV5控制的T7 RNA聚合酶基因，將一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒M3BAT-I轉(zhuǎn)入感受態(tài)DE3-491后，成為一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，命名為M3BAT-I+DE3-491。
一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，用下述方法獲得(1)選取tnaA基因上下游側(cè)翼序列片段與卡那霉素抗性基因kanr，連接構(gòu)建串聯(lián)基因盒pET22b-tnaA5′-kanr-tnaA3′，并將線性化片段tnaA5′-kanr-tnaA3′通過Red同源重組系統(tǒng)替換掉命名為M3BAT-I+DE3-491的一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌染色體上的tnaA基因，導致該基因正常功能的喪失，得到色氨酸酶缺陷株，命名為M3BAT-I+DE3-491ΔT。
一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌的應用，包括下述步驟將命名為M3BAT-I+DE3-491ΔT的敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌按質(zhì)量百分含量為3％-7％比例加入M63培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600達到1.0后，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)50-54小時。
一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，以IPTG誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE分析，M3BAT-I在DE3-491可表達44kD、37kD、29kD蛋白(圖2)，分別相當于色氨酸合成酶β亞基、磷酸甘油酸脫氫酶M3突變體、色氨酸合成酶α亞基。酶活性分析表明，色氨酸合成酶的活性分別比含空載體的對照菌株提高了3倍左右，磷酸甘油酸脫氫酶總活性提高了約4倍。一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清液色氨酸含量由原來的2mg/L提高到99mg/L。


圖1為本發(fā)明一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒(M3BAT-I)構(gòu)建流程圖。
圖2為含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒(M3serA與trpBA串聯(lián)質(zhì)粒)在DE3-491中的表達。(1.蛋白質(zhì)分子量標準；2.DE3-491/M3BAT-II；3.DE3-491/M3BAT-I；4.DE3-491/pET22b(+)。
圖3為含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒(M3serA與trpBA串聯(lián)質(zhì)粒)表達后相對酶活性比較。(系列1表示色氨酸合成酶活性；系列2表示磷酸甘油酸脫氫酶酶活性，1pET22b(+)；2、3其它串聯(lián)質(zhì)粒；4M3BAT-I串聯(lián)質(zhì)粒)圖4為一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌PCR鑒定結(jié)果。(1.MarkerIII；2.突變后的基因組擴增片斷；3.突變前的基因組擴增片斷.)圖5為tnaA基因敲除后的部分序列測定。
圖6為改造前氨基酸分析，Trp含量很低。
圖7為改造后氨基酸分析，Trp含量升高。
具體實施例方式
本發(fā)明采用一種大腸桿菌(Escherichisa coli 491，購自美國典型菌種保藏中心)為原始菌株，采用第三代基因工程的方法，通過對其色氨酸代謝途徑的改造，提高了其色氨酸合成能力。
在大腸桿菌芳香族氨基酸代謝途徑中，色氨酸合成酶(EC4.2.1.20)是一具有α2β2亞基結(jié)構(gòu)的異質(zhì)四聚體，β、α兩個亞基分別由trpB和trpA基因編碼，該酶能以吲哚和L-絲氨酸為底物酶促合成L-色氨酸。將trpBA基因與serA基因突變體(M3serA基因)串聯(lián)在表達載體pET22b(+)中，實現(xiàn)了2個基因分別在各自啟動子下的共表達，并選取編碼色氨酸酶的tnaA基因上下游側(cè)翼序列片段與卡那霉素抗性基因kanr，連接構(gòu)建串聯(lián)基因盒，采用Red同源重組系統(tǒng)替換掉tnaA基因，從而達到加強色氨酸代謝流和色氨酸積累的目的。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒，是用下述方法制成采用pET22b(+)單質(zhì)粒多基因串聯(lián)表達的策略，將色氨酸合成酶基因trpBA基因與磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體M3serA基因串聯(lián)，得重組質(zhì)粒pET-T7 promotor-M3serA-T7promotor-trpBA-T7 terminator，命名為M3BAT-I，構(gòu)建流程見圖1。
有關(guān)serA基因突變體(M3serA基因)構(gòu)建方法已經(jīng)發(fā)表于《中國生物化學與分子生物學報》2006年第10期806～810頁。
有關(guān)trpBA基因克隆方法已經(jīng)發(fā)表于《生物技術(shù)通訊》2006年第1期12～14頁。
實施例2一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，是用下述方法獲得以λDE3噬菌體侵染宿主菌Escherichisa coli 491，使溶源化后的命名為DE3-491的細菌的染色體上含有一拷貝由lacUV5控制的T7 RNA聚合酶基因，將實施例1制成的一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒M3BAT-I轉(zhuǎn)入感受態(tài)DE3-491后，成為命名為M3BAT-I+DE3-491的一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌。以IPTG誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE分析，M3BAT-I在DE3-491可表達44kD、37kD、29kD蛋白(圖2)，分別相當于色氨酸合成酶β亞基、磷酸甘油酸脫氫酶M3突變體、色氨酸合成酶α亞基。酶活性分析表明，色氨酸合成酶的活性比含空載體的對照菌株提高了3倍左右，磷酸甘油酸脫氫酶總活性分別提高了約4.0倍(圖3)。
實施例3一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，是用下述方法獲得(1)選取tnaA基因上下游側(cè)翼序列片段與卡那霉素抗性基因kanr，連接構(gòu)建串聯(lián)基因盒pET22b-tnaA5′-kanr-tnaA3′，并將線性化片段tnaA5′-kanr-tnaA3′通過Red同源重組系統(tǒng)替換掉一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌(M3BAT-I+DE3-491)染色體上的tnaA基因，導致該基因正常功能的喪失，得到色氨酸酶缺陷株，命名為M3BAT-I+DE3-491ΔT。
PCR擴增(圖4)和序列測定(圖5)證實tnaA基因已被成功敲除。
實施例4一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌的應用，包括下述步驟將敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌(M3BAT-I+DE3-491ΔT)按質(zhì)量百分含量為5％(也可以選用3％或7％)比例加入M63培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600達到1.0后，加入IPTG誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)52小時(也可以培養(yǎng)50小時或54小時)，取發(fā)酵液用氨基酸自動分析儀分析L-色氨酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中的色氨酸含量達99mg/L，而原始菌培養(yǎng)后發(fā)酵液中的色氨酸含量為2mg/L。(見圖6、圖7)5×M63鹽的配制方法(1L)(NH4)2SO410g，KH2PO468g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.5mg。用KOH調(diào)PH為7.0。
M63培養(yǎng)基配制方法臨用前用無菌水將5×M63鹽稀釋成1×培養(yǎng)基，并在每升加入以下無菌溶液1mol/L MgSO4·7H2O 1ml，20％葡萄糖10ml，0.5％維生素B10.1ml。
權(quán)利要求
1.一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒，其特征是用下述方法制成采用pET22b(+)單質(zhì)粒多基因串聯(lián)表達的策略，將色氨酸合成酶基因trpBA與磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體M3serA基因串聯(lián)，得重組質(zhì)粒pET-T7promotor-M3serA-T7promotor-trpBA-T7terminator，命名為M3BAT-I。
2.一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，其特征是用下述方法獲得以λDE3噬菌體侵染宿主菌Escherichisa coli 491，使溶源化后的命名為DE3-491的細菌的染色體上含有一拷貝由lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，將權(quán)利要求1的一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒M3BAT-I轉(zhuǎn)入感受態(tài)DE3-491后，成為一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，命名為M3BAT-I+DE3-491。
3.一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，其特征是用下述方法獲得(1)選取tnaA基因上下游側(cè)翼序列片段與卡那霉素抗性基因kanr，連接構(gòu)建串聯(lián)基因盒pET22b-tnaA5′-kanr-tnaA3′，并將線性化片段tnaA5′-kanr-tnaA3′通過Red同源重組系統(tǒng)替換掉權(quán)利要求2的命名為M3BAT-I+DE3-491的一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌染色體上的tnaA基因，導致該基因正常功能的喪失，得到色氨酸酶缺陷株，命名為M3BAT-I+DE3-491ΔT。
4.一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌的應用，其特征是包括下述步驟將權(quán)利要求3的敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌按質(zhì)量百分含量為3％-7％比例加入M63培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600達到1.0后，加入異丙基硫代半乳糖苷誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)50-54小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌、該菌中含有的重組質(zhì)粒、一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌及應用，重組質(zhì)粒制法是采用pET22b(+)單質(zhì)粒多基因串聯(lián)表達的策略，將色氨酸合成酶基因trpBA與磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體M3serA基因串聯(lián)，得M3BAT－I，一種色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌，以IPTG誘導表達，經(jīng)SDS－PAGE分析，可表達色氨酸合成酶β亞基、磷酸甘油酸脫氫酶M3突變體、色氨酸合成酶α亞基。一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強的基因工程菌培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清液色氨酸含量由原來的2mg/L提高到99mg/L。
文檔編號C12N15/53GK101050469SQ20071005696
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月21日
發(fā)明者郭長江, 徐琪壽, 張緒梅, 劉云, 吳健全, 韋京豫, 楊繼軍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所