專利名稱：大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽及其制備方法和其基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種大蹼鈴蟾(Bombina maxima)神經營養(yǎng)肽及其制備方法和其基因，屬生物醫(yī)學領域。
腦的增齡性變化從20多歲就已經開始，到50多歲后在有些腦區(qū)如額葉皮層呈現(xiàn)明顯的退行性變化，在黑質和藍斑的神經細胞的數(shù)量減少到30％-40％。與腦的老年性退行性變化有關的疾病主要有帕金森氏病，阿爾茨海默病，肌萎縮性側索硬化等疾病。動物實驗研究表明，神經營養(yǎng)肽對神經細胞具有保護作用，可以減緩神經細胞的衰老和修復神經細胞的損傷，增強學習與記憶能力。因此，神經營養(yǎng)肽已成為開發(fā)新型預防和治療老年性疾病藥物的熱點。
很多兩棲類動物在中國屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。大蹼鈴蟾主要分布于我國的云南、四川省，是我國的特色資源動物之一，也是特色的民族民間藥物。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點。據(jù)文獻報道，國外學者已從東方鈴蟾(Bombina orientalis)中分離出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。從蟾蜍和林蛙皮膚中得到的降壓肽類物質bufokinin和ranakinin有舒張血管和降血壓的作用，已在治療心血管疾病方面顯示出誘人的應用前景；最近，一種兩棲類核酸酶對HIV的選擇性抑制作用更引起了人們對兩棲類活性物質的注意。近十幾年對170多種兩棲類皮膚活性肽和類似物進行了篩選，證明有40多種活性肽有較好的藥物開發(fā)前景。
發(fā)明人將本發(fā)明的大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽全序列氨基酸結構經蛋白質數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽，與從歐洲花鈴蟾(Bombina variegata)皮膚中得到的神經營養(yǎng)肽Bv8有11個氨基酸的差異。發(fā)明人將本發(fā)明的神經營養(yǎng)肽編碼基因經基因數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術基礎，提供一種主要用于開發(fā)減緩神經細胞衰老和修復神經細胞損傷，增強學習記憶和治療老年性疾病藥物的大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽及其制備方法和其基因。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術方案大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽，為我們從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾(Bombina maxima)皮膚分泌物中分離得到的由77個氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量8044.7，等電點8.4，多肽氨基酸全序列一級結構為丙氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-天冬酰胺-異亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-組氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-組氨酸-賴氨酸-纈氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-賴氨酸-精氨酸-亮氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺-蘇氨酸-甘氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-賴氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-絲氨酸。
AVITGVCDRDAQCGSGTCCAASAFSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCP
CNTGLTCSKSGEKFQCS大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽的制備方法，是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)，冷凍干燥后，分子篩凝膠過濾分離，收取所得峰III再經高效液相色譜(HPLC)反相C18柱分離純化，取第二步HPLC反相C18柱層析分離出的峰(箭頭所示)即可。然后用HPLC方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。
大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽具有顯著的神經細胞保護營養(yǎng)作用，作為制備神經性疾病，抗衰老，增強學習記憶治療藥物的應用。
大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因的克隆包括大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，在歐洲花鈴蟾神經營養(yǎng)肽Bv8編碼信號肽的核苷酸序列的基礎上設計引物，利用PCR方法篩選大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因。根據(jù)Bv8編碼信號肽核苷酸序列所設計的擴增引物LR52，其長度為24個核苷酸，其序列為5’TTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGC3’，PCR另一擴增引物為位于克隆插入部分的3’端的載體SP6啟動子引物，其序列為5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定?；驕y序結果表明編碼大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽的基因由404個核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為CAAGAACTTTAGTCCTGAGGTTTAGTTTTACTATTCAGTTTATCATGAAGTGTTTTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGCTTGTCATAGCCTTCTCACACGGTGCTGTCATCACTGGGGTATGTGATAGAGACGCACAGTGCGGGTCAGGTACCTGTTGTGCTGCCAGTGCGTTTTCACGTAACATCAGATTTTGCGTCCCACTTGGAAATAACGGGGAGGAATGTCACCCAGCCAGCCATAAGGTGCCTTATAATGGAAAGCGGTTGAGTTCCTTGTGCCCCTGCAACACCGGACTAACTTGCTCCAAGTCTGGAGAAAAATTTCAGTGTTCTTAATAGTGATATTAAGTGAAAATGTAAAAGGACAATAAAACATGAGCCTTGTAAATTAAAAAAAAAAAAAAA其中編碼成熟大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽為第102-332位核苷酸，其氨基酸序列為AVITGVCDRDAQCGSGTCCAASAFSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCNTGLTCSKSGEKFQCS大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因作為基因工程制備神經營養(yǎng)肽的應用。下面結合附圖用實施例來進一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內容并不局限于此。


圖1為本發(fā)明大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽的Sephadex G-50凝膠過濾層析圖。
圖2為本發(fā)明大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽的HPLC反相C18柱層析圖。
圖3為本發(fā)明大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因核苷酸序列。
圖4為本發(fā)明成熟大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽氨基酸序列。
實施例一1，制備大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，將大蹼鈴蟾置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥、低溫保存。
第一步SephadexG-50凝膠過濾按上述方法獲得原材料大蹼鈴蟾分泌物凍干粉溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液，裝于3.5KDa透析袋，于同樣緩沖液透析12小時；上樣品于經0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液平衡的SephadexG-50凝膠過濾柱(1000mm長，26mm直徑)，經0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液洗脫，收集峰III。
第二步，反相高壓液相層析(RP-HPLC)SephadexG-50凝膠過濾得到的峰III以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)構成的洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫，收集HPLC反相C18柱層析峰(箭頭標記)即大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽。
2.純化的大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。
通過上述方法制備的大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽，為我們從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的由77個氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量8044.7，等電點8.4，多肽氨基酸全序列一級結構為丙氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-天冬酰胺-異亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-組氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-組氨酸-賴氨酸-纈氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-賴氨酸-精氨酸-亮氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺-蘇氨酸-甘氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-賴氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-絲氨酸。
AVITGVCDRDAQCGSGTCCAASAFSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCNTGLTCSKSGEKFQCS大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽具有顯著的神經細胞保護營養(yǎng)作用，作為制備神經性疾病，抗衰老，增強學習記憶治療藥物的應用。
實施例二1，大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因克隆1)，大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBC0BRL公司產品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘，加入等體積酚/氯仿溶液，，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀，上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為大蹼鈴蟾皮膚總RNA。
2)，大蹼鈴蟾皮膚mRNA的純化采用美國PROMEGA公司的mRNA分離純化試劑盒。取大蹼鈴蟾皮膚總RNA500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的大蹼鈴蟾皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異戊醇，于一70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
3)，大蹼鈴蟾皮膚cDNA文庫構建采用美國GIBC0BRL公司SuperScriptTM質粒cDNA文庫構建試劑盒，但方法操作有改進。cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄)，于1.5ml試管中加入2μl Not I引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保溫10分鐘，立即放入冰浴冷卻，然后加入4μl 5X第一鏈合成緩沖液，2μl 0.1MDTT，1μl 10mM dNTP混合物，在加入1μl SuperScript II反轉錄酶，于37℃保溫1小時后放入冰浴。cDNA第二鏈合成，在第一鏈合成試管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二鏈合成緩沖液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大腸桿菌DNA連接酶，4μl大腸桿菌DNA多聚酶I，1μl大腸桿菌RNA酶，反應總體積150μl，混勻后于16℃保溫2小時；加入2μlT4 DNA多聚酶繼續(xù)保溫5分鐘。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm離心5分鐘，取140μl上層溶液轉移到干凈試管中，加入70μl 7.5M乙酸銨，0.5ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。SalI adapter的連接，上述沉淀溶于25μlDEPC水中，加入10μl 5XT4 DNA連接酶緩沖液，10μl SalI adapter，5μl T4 DNA連接酶，反應總體積50μl，于16℃保溫16小時。重復上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶水解，于cDNA溶液中加入5μl React 3緩沖液，4μl Not I酶，反應體積50μl，于37℃保溫2小時。重復上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于100μlTEN緩沖液中。將cDNA樣品過DNA分級分離柱(試劑盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的組份合并，體積為200μl，加入5ml酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸銨，0.6ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN緩沖液中。合成的cDNA連接到pSPORT 1質粒，取10μl溶解于TEN緩沖液中的cDNA，加入4μl 5XT4 DNA連接酶緩沖液，1μl pSPORT 1質粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μlDEPC水，1μl T4 DNA連接酶，反應體積20μl，室溫3小時，可準備轉化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞的制備，挑取單個HB101菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于，50ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時，待菌液540nm OD值為0.4時，4℃，2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1M CaCl2懸浮，再2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀以適量0.1M CaCl2重懸，分裝后置冰浴內備用。連接產物的轉化取上述連接產物5μl加入100μl感受態(tài)細胞冰浴60分鐘，42℃熱休克60秒，再置冰浴5分鐘，加入無氨芐青霉素的SOC培養(yǎng)基0.9ml，37℃培養(yǎng)1小時，取200μl涂布于含氨芐青霉素的LB平皿(15cm直徑)，37℃培養(yǎng)16小時，每個LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加10％甘油凍存。構建的cDNA含4×104個單獨克隆。
4)，大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因克隆篩選利用PCR篩選法篩選大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因，所用正向引物LR52，根據(jù)歐洲鈴蟾神經營養(yǎng)肽Bv8信號肽核苷酸序列所設計，長度為24個核苷酸，其序列為5’TTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGC3’；和位于克隆插入部分的3’端的載體SP6啟動子引物，其序列為5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反應在如下條件下進行94℃1分鐘，45℃1分鐘和72℃1分鐘，30個循環(huán)。首先滴定構建的細菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當?shù)募毦鷿舛?大約500個細菌/毫升，和30個細菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板(Costar)上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl)，37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細菌培養(yǎng)液，有16個樣品進行PCR鑒定，交叉陽性孔細菌樣品進入第二輪篩選。
6〕，大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因序列測定和結果提取質粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國Applied Biosystems373A全自動核昔酸序列測定儀，測序引物為SP6和T7啟動子，SP6啟動子序列5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’，T7啟動子序列5’TAATACGACTCACTATAGGGA3’?；驕y序結果自5’端至3’端(見圖3)。圖3所示大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因核苷酸的序列表為序列長度，404個堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓撲學直鏈狀，序列種類cDNA，來源大蹼鈴蟾皮膚，序列特征1編碼成熟神經營養(yǎng)肽為第102-332位核苷酸，其氨基酸序列見圖4，大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因作為基因工程制備神經營養(yǎng)肽的應用。
權利要求
1，大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽，其特征是從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的由77個氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量8044.7，等電點8.4，多肽氨基酸全序列一級結構為丙氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-天冬酰胺-異亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-組氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-組氨酸-賴氨酸-纈氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-賴氨酸-精氨酸-亮氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺-蘇氨酸-甘氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-賴氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-絲氨酸。
2，大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽的制備方法，其特征是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心去除沉淀、冷凍干燥后，經凝膠過濾、高壓液相反相柱層析分離純化后即得到。
3，大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由404個核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為CAAGAACTTTAGTCCTGAGGTTTAGTTTTACTATTCAGTTTATCATGAAGTGTTTTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGCTTGTCATAGCCTTCTCACACGGTGCTGTCATCACTGGGGTATGTGATAGAGACGCACAGTGCGGGTCAGGTACCTGTTGTGCTGCCAGTGCGTTTTCACGTAACATCAGATTTTGCGTCCCACTTGGAAATAACGGGGAGGAATGTCACCCAGCCAGCCATAAGGTGCCTTATAATGGAAAGCGGTTGAGTTCCTTGTGCCCCTGCAACACCGGACTAACTTGCTCCAAGTCTGGAGAAAAATTTCAGTGTTCTTAATAGTGATATTAAGTGAAAATGTAAAAGGACAATAAAACATGAGCCTTGTAAATTAAAAAAAAAAAAAAA
4，根據(jù)權利要求3所述的大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽基因核苷酸序列，其特征在于，編碼成熟大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽為第102-332位核苷酸，其氨基酸序列為AVITGVCDRDAQCGSGTCCAASAFSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCNTGLTCSKSGEKFQCS
全文摘要
本發(fā)明涉及大蹼鈴蟾神經營養(yǎng)肽及其制備方法和其基因，屬于生物醫(yī)學領域。其神經營養(yǎng)肽為從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾(Bombina maxima)皮膚分泌物中分離得到的由77個氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量8044.7，等電點8.4，多肽氨基酸全序列一級結構為AVITGVCDRDAQCGSGTCCAASAFSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCNTGLTCSKSGEKFQCS。制備方法是收集大蹼鈴蟾皮膚分泌物，離心去除沉淀、冷凍干燥后，經凝膠過濾、高壓液相反相柱層析分離純化后即得到。編碼神經營養(yǎng)肽的基因由404個核苷酸組成，其中編碼成熟神經營養(yǎng)肽為第102－332位核苷酸。其基因作為基因工程制備神經營養(yǎng)肽的應用。
文檔編號C07K14/435GK1390849SQ01108519
公開日2003年1月15日 申請日期2001年6月8日 優(yōu)先權日2001年6月8日
發(fā)明者張云, 賴仞, 李文輝, 劉衡 申請人:中國科學院昆明動物研究所