專利名稱：大蹼鈴蟾博瑪津蛋白及其基因和在制藥中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大蹼鈴蟾(Bombina maxima)博瑪津蛋白及其基因和在制藥中的應用，屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血小板是一種多功能的細胞。它的主要功能是參與止血與血栓形成，并且在動脈粥樣硬化，癌轉(zhuǎn)移和炎癥反應等過程中起重要作用。血小板在這些生理，病理過程中所起的重要作用與血小板黏附，釋放和聚集等功能密切相關(guān)。抑制血小板黏附，釋放和聚集的抗血小板藥物篩選一直是備受人們關(guān)注的研究熱點，而血小板黏附，釋放和聚集等功能的誘導劑則可作為篩選專一的，低毒的，作用機理明確的抗血小板藥物的分子工具。
胃腸道炎癥和潰瘍，胃腸道腫瘤是危害人類健康的一類主要疾病，容易復發(fā)，很難徹底治愈，而且治療藥物匱乏，毒性大，副作用強，不穩(wěn)定，給藥途徑受限制，所以針對這類疾病的高效低毒穩(wěn)定的新藥研究開發(fā)具有廣闊的市場前景。
很多兩棲類動物在中國屬于傳統(tǒng)中藥，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)等。大蹼鈴蟾主要分布在我國的云南省，四川省，是我國的特色資源動物之一，也是特色的民族民間藥物。從這些傳統(tǒng)中藥中尋找特定藥理活性的單體化合物是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容，在國外，兩棲類動物皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點之一。
發(fā)明人將本發(fā)明的大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(博瑪津)全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未能發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽，將本發(fā)明的大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(博瑪津)編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未能發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有的技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種具有血小板聚集誘導活性以及抗胃腸道炎癥和潰瘍的大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的大蹼鈴蟾博瑪津蛋白及其基因和在制藥中的應用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明之目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(博瑪津)，是我們首次從大蹼鈴蟾(Bombinamaxima)皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈蛋白質(zhì)，含104個氨基酸，全序列一級結(jié)構(gòu)甘氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-門冬氨酸-門冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-纈氨酸-門冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-精氨酸-纈氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-丙氨酸-賴氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-異亮氨酸-絲氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-門冬酰胺-蘇氨酸-異亮氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-谷氨酸-絲氨酸-丙氨酸-門冬酰胺-丙氨酸-色氨酸-賴氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-纈氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-門冬酰胺-蘇氨酸-精氨酸-纈氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-甘氨酸-賴氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-門冬氨酸-絲氨酸-絲氨酸-酪氨酸-酪氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸
(NH2GFPIYEIDNRPGCYVDPAERVACAGAGVTKAECKAKGCCFISARRNTIWCFKLKESADAWKCAVPMNTRVACAGAGVTPAECKGKGCCFYYGTV WCFKPQE-COOH)定義為SEQ NO1大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(博瑪津)的制備方法，是將活體大蹼鈴蟾用清水洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚，密閉容器3-5分鐘，輕揉按摸動物，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集皮膚分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)，上清液經(jīng)冷凍干燥，即得皮膚分泌物。將皮膚分泌物用3500D透析袋對50mM Tris-HCl，10mMEDTA，PH 7.2緩沖液于4℃透析，透析內(nèi)液經(jīng)DEAE-A50陰離子交換柱層析，收集穿透峰，經(jīng)凍干后，再過Sephadex G50分子篩，收集第III峰，經(jīng)HPLC-SP陽離子柱層析，收集箭頭所示峰，再經(jīng)HPLC-C8反相柱層析，收集箭頭所示峰，抽干即得大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(博瑪津)然后用電泳及HPLC鑒定其純度并用氨基酸自動測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(博瑪津)可誘導血小板聚集，能對抗各類血小板功能缺陷所導致的出血性疾病，并可分子工具，篩選專一性抗血小板藥物。其結(jié)構(gòu)特性使其在藥物制備，給藥途徑等方便可靠，這為其產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了堅實的基礎(chǔ)。因而具有極其廣闊的應用前景。
大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(博瑪津)基因的克隆包括大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取，mRNA純化及反轉(zhuǎn)錄，cDNA文庫構(gòu)建，在通過含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)N-端序列設(shè)計引物基礎(chǔ)上，利用PCR方法篩選博瑪津蛋白編碼基因。根據(jù)N-端序列所設(shè)計的擴增引物長度為18個核苷酸，其序列為5’GGNTTCCCNATATACTGT 3’，其中N＝A，C，T，G，PCR另一擴增引物為位于克隆插入部分的3’端的載體SP6啟動子引物，其序列為5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG 3’。所獲陽性克隆進行基因核苷酸序列測定?；蛐蛄袦y定結(jié)果表明，其編碼大蹼鈴蟾博瑪津蛋白的基因的cDNA由1061個核苷酸組成，其自5’端至3’端核苷酸序列為GGGTTTCCTGCCAAGCAAGATGATCTTCATAGTGATAATGGCATTGGCTATTGACTGTGCACATGGAGGTTTTCCAATCTATGAGATAGATAACAGACCTGGATGCTATGTTGACCCTGCAGAGAGAGTTGCATGTGCAGGTGCAGGAGTGACAAAAGCTGAATGCAAGGCTAAAGGCTGCTGTTTTATTTCAGCAAGGAGAAATACAATTTGGTGCTTTAAACTTAAAGAATCAGCGGATGCCTGGAAATGTGCTGTCCCCATGAATACGAGAGTTGCATGCGCTGGCGCAGGTGTCACACCTGCTGAATGCAAGGGAAAAGGTTGTTGTTTCAATTCAAGCTACTATGGAACAGTATGGTGCTTTAAACCTCAAGAATAACTCATCTATAAAATGGAATTGTTCAAGATCAGAACAAGGTTGATGATAAGTGCTCTATTACTGTCCACTTTTTCTTCTCCCCTTTTTTTTGTTTGTGCAAATGCTCCAGCATTTGCAAGCAGTGTACATTTATTTATTTTTTTTGGTCTATGGATCGTTTTAAAAATATAGTTTAAATTTGAGCAACATAAGGCTATTAAACATAGGCTATTATACAAAATGAATAATTAAAATTAGCAATTAAAGTGAAGGTAAACTTTTATGAATGAAAGCCCTGTTTTTTAATAGGCAAAATACAAAAATATGGGCACTGCTTGTAAATGCTGGAGCAGCATTTCCCCAATGTATTGTATATTTCTAGATCCAAAACATATCATAAGTTTTCAAATGGAAAAATTGTTAATTCTGCTATCATAAAGAAGGGGAATTTGTGTACTTGTGTGTAACTGGAAAGAAACAATTCTAATTGTATGTTTATATTTTGGATTACATTTGACCAAAGTAACTCCCACATTTGTATGCAAATTATATTTAAATTAATAAAATTGCAATATGCTTATGGTACATTTAAAAATATGTTTAACAATGTTACCAAAAATGTTTGGCAAAAAAATAAACATCCACTGGATCAGCACCTCTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA定義為SEQ NO2，編碼權(quán)利要求書1所述的成熟的含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)博瑪津為第67-378位核苷酸，其編碼的氨基酸序列為SEQ NO1大蹼鈴蟾博瑪津蛋白基因作為基因工程置備大蹼鈴蟾博瑪津蛋白的應用。
下面用本發(fā)明的大蹼鈴蟾博瑪津蛋白的藥理實驗結(jié)果來說明本發(fā)明的藥效作用和有益效果1.大蹼鈴蟾博瑪津蛋白誘導人血小板聚集的作用將待測化合物用生理鹽水進行5倍倍比稀釋，共6個稀釋度，每個稀釋度設(shè)3個重復，每管加入200μL人富血小板血漿或洗滌人血小板，37℃保溫20分鐘，用比濁法在血小板聚集儀上測定不同濃度的待測化合物在5分鐘內(nèi)誘導人血小板聚集的聚集率。EC50是對血小板產(chǎn)生一半最大聚集作用時的藥物濃度。
表1大蹼鈴蟾博瑪津蛋白誘導人血小板聚集的作用

由表1可見，大蹼鈴蟾博瑪津蛋白第一步DEAE-A50離子交換粗樣品及不同批號的純化的博瑪津蛋白均具有顯著的誘導人血小板聚集的作用。迄今為止，在全世界范圍內(nèi)，大蹼鈴蟾博瑪津蛋白是第一個來自兩棲類動物的血小板聚集誘導劑。
2.大蹼鈴蟾博瑪津蛋白對鹽酸誘導的大鼠急性胃炎和應急性胃炎的保護作用取體重300克左右的雄性Wistar大鼠，每組3只，給藥組尾靜脈注射不同劑量的大蹼鈴蟾博瑪津蛋白，對照組注射生理鹽水。在全麻，無菌操作下，結(jié)扎幽門，術(shù)后將動物分籠單獨飼養(yǎng)，禁食，禁水，防止吞食鼠糞。19h后，用麻醉法將動物迅速處死。剖檢胃粘膜病變，測量各個潰瘍的長徑，求其總和，作為潰瘍指數(shù)進行比較。EC50是指大鼠潰瘍指數(shù)降低50％的藥物劑量μg/kg表2大蹼鈴蟾博瑪津蛋白對鹽酸誘導的大鼠急性胃炎和應急性胃炎的保護作用

表1


實施例一1.制備大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白博瑪津活體大蹼鈴蟾用清水洗干凈，用乙醚加輕揉按摸法刺激，收集皮膚分泌物，離心，冷凍干燥，低溫保存。
第一步DEAE SephadexA-50離子交換按上述方法獲得原材料大蹼鈴蟾皮膚分泌物凍干粉溶解于50mMTris-HCl，10mMEDTA，PH＝7.2緩沖液，裝與3500D透析袋中，對同樣緩沖液透析24小時，離心，取上清液上樣于經(jīng)同樣緩沖液平衡的DEAESephadex A-50(Pharmacia產(chǎn)品)陰離子交換柱(500mm長，直徑26mm)，經(jīng)兩個柱體積同樣緩沖液沖洗，收集穿透峰。
第二步分子篩Sephadex G-50層析穿透峰經(jīng)凍干濃縮，溶解于0.15M PBS，PH＝6.0緩沖液中，離心，取上清液上樣于經(jīng)同一緩沖液緩沖液平衡的Sephadex G-50(Pharmacia產(chǎn)品)分子篩柱(1000mm長，直徑26mm)經(jīng)同樣緩沖液沖洗，收集III峰。
第三步陽離子高壓液相層析(Cation exchange-HPLC)分子篩Sephadex G-50層析所得III峰經(jīng)凍干濃縮，溶解于20mM PBS，PH＝6.0緩沖液中，對同樣緩沖液透析24小時，離心，取上清液上樣于經(jīng)同樣緩沖液平衡的SP柱(75mm長，直徑7.5mm)，經(jīng)兩個柱體積同樣緩沖液沖洗后，再用含NaCL的PBS緩沖液進行梯度洗脫，收集箭頭所示峰。
第四步反相高壓液相層析(RP-HPLC)經(jīng)陽離子高壓液相(Cationexchange-HPLC)層析所得收集峰以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫，收集箭頭所示峰即為純化的大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白博瑪津。
純化的三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白博瑪津用SDS-PAGE電泳測定其分子量，并與HPLC方法鑒定其純度，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列。
通過上述方法制備的大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白博瑪津，是我們首次從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽，含104個氨基酸，多肽氨基酸全序列結(jié)構(gòu)為甘氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-門冬氨酸-門冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-纈氨酸-門冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-精氨酸-纈氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-丙氨酸-賴氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-異亮氨酸-絲氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-門冬酰胺-蘇氨酸-異亮氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-谷氨酸-絲氨酸-丙氨酸-門冬酰胺-丙氨酸-色氨酸-賴氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-纈氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-門冬酰胺-蘇氨酸-精氨酸-纈氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-甘氨酸-賴氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-門冬氨酸-絲氨酸-絲氨酸-酪氨酸-酪氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸。
(NH2GFPIYEIDNRPGCYVDPAERVACAGAGVTKAECKAKGCCFISARRNTIWCFKLKESADAWKCAVPMNTRVACAGAGVTPAECKGKGCCFYYGTVWCFKPQECOOH)，SEQ ID NO1，大蹼鈴蟾博瑪津蛋白可作為研究血小板生理病理功能及信號傳導的分子工具，篩選抗血小板藥物的分子探針，抗胃潰瘍藥物。
實施例二1.大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白博瑪津基因克隆1)大蹼鈴蟾皮膚總RNA的提取活體大蹼鈴蟾用清水洗干凈，投入液氮中4小時后取皮膚組織，稱重，取30mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL產(chǎn)品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘，加入等體積的酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄沉淀，上清液加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4C，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為大蹼鈴蟾皮膚總RNA。
2)大蹼鈴蟾皮膚mRNA的純化采用美國PROMEGA公司的mRNA分離純化試劑盒，取大蹼鈴蟾皮膚總RNA500μg溶于500ul DEPC水中，放入65C水浴10分鐘，加入3ulOligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液，磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加入0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，棄上清，最后加入0.1ml 0.5×SSC，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.11×SSC洗滌四次，最后棄上清，加入0.1ml DEPC C水懸浮，至磁力架吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15mlDEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，再加入0.15mlDEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，將上清移至新的試管，純化的大蹼鈴蟾皮膚mRNA即含于上清中。加入1/10體積的PH5.2的3M乙酸鈉，等體積的異午醇，于-70C放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶于10μl DEPC水中。
3)大蹼鈴蟾皮膚cDNA文庫的構(gòu)建采用美國GIBCOBRL公司的SuperScriptTM質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒，但操作方法有改進。CDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)，于1.5ml試管中加入2μlNotI引物和7μlmRNA，3ulDEPC水，70℃保溫10分鐘，立即放入冰浴冷卻，然后加入4μl 5X第一鏈合成緩沖液，2μl 0.1M DTT，1ul 10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶，于37℃保溫1小時后放入冰浴。CDNA第二鏈合成，在第一鏈合成試管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二鏈合成緩沖液，3μl10mMdNTP混合物，1μl大腸桿菌DNA連接酶，4μl大腸桿菌DNA多聚酶I，1μl大腸桿菌RNA酶，反應總體積150μl，混勻后于16℃保溫2小時；加入2μlT4DNA多聚酶繼續(xù)保溫5分鐘.DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm離心5分鐘，取140μl上層溶液轉(zhuǎn)移倒干凈試管中，加入70μl7.5M乙酸銨，0.5ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。Sal I adapter的連接，上述沉淀溶于25μl DEPC水中，加入10μl5XT4DNA連接酶緩沖液，10μl Sal II adapter，5μlT4DNA連接酶，反應總體積50μl，于16℃保溫16小時。重復上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于41μl DEPC水中.Not I酶，反應體積50μl，于cDNA溶液中加入5μlReact3緩沖液，4μl Not I酶，反應體積50μl，于37℃保溫2小時。重復上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于100μl TEN緩沖液中。將cDNA樣品過DNA分級分離柱(試劑盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的組分合并，體積為20μl，加入5μl酵母tRNA，100μl7.5M乙酸銨，0.6ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN緩沖液中.合成的cDNA連接酶緩沖液，1μlpSPORT1質(zhì)粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μl 5X T4DNA連接酶，反應體積20μl，室溫3小時，可準備轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞.感受態(tài)細胞的制備，挑取單個HB101菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時，待菌液540nmOD值為0.4時，4℃，2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1MCaCl2重懸，分裝后置冰浴內(nèi)備用.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取上述連接產(chǎn)物5μl加入100μl感受態(tài)細胞冰浴60分鐘，42℃熱休克60秒，再置冰浴5分鐘，加入無氨芐青霉素的SOC培養(yǎng)基0.9ml，37℃培養(yǎng)1小時，取200μl涂布于含氨芐青霉素的LB平皿(15cm直徑)，37℃培養(yǎng)16小時，每個LB平皿用5mlLB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加10％甘油凍存構(gòu)建的cDNA大約含4×104個單獨克隆。
4)大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白博瑪津基因克隆篩選利用PCR篩選法篩選大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白“博瑪津”基因，所用正向引物P1，根據(jù)大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白“博瑪津”N-端6個氨基酸序列的可能的編碼核苷酸所設(shè)計，長度為18個核苷酸，其序列為5′GGNTTCCCNATNTATTGC3′，其中N＝A、C、G、T；和位于克隆插入部分的3’端的載體SP6啟動子引物，其序列為5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反應在如下條件下進行94℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃1分鐘，30個循環(huán)。首先滴定構(gòu)建的細菌cDNA文庫，然后用含100μl/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當?shù)募毦鷿舛?大約5000個細菌/毫升，和30個細菌/毫升分別用于首輪篩選和第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板(Costar)上按行、列分別合并細菌培養(yǎng)液，有16個樣品進行PCR鑒定，交叉陽性孔細菌樣品進入第二輪篩選。
2.大蹼鈴蟾博瑪津蛋白基因序列測定和結(jié)果提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國Applied Biosystem373A全自動核苷酸序列測定儀，測序引物為SP6和T7啟動子，SP6啟動子序列5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG 3’，T7啟動子序列5’TAATACGACTCTATAGGGA 3’克隆篩選和基因測序結(jié)果表明，有一個基因可編碼大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白博瑪津，其cDNA序列自5’端至3’(見圖4)。圖5所示大蹼鈴蟾博瑪津蛋白基因核苷酸的序列表為基因(SEQ ID NO2)序列長度1061個核苷酸，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓撲學直線鏈狀，序列種類cDNA，來源大蹼鈴蟾皮膚，序列特征編碼成熟大蹼鈴蟾含三葉環(huán)型結(jié)構(gòu)域蛋白博瑪津為第367-678位核苷酸，其氨基酸序列見圖5。
大蹼鈴蟾博瑪津蛋白基因作為基因工程制備血小板激活蛋白及抗胃潰瘍的應用。
說明書序列表<110>中國科學院昆明動物研究所<120>博瑪津蛋白及其基因和在制藥中的應用<160>3<210>1<211>1061<212>DNA<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)<220>
<221>CDS<222>(20)...(382)<400>1gggtttcctg ccaagcaag atg atc ttc ata gtg ata atg gca ttg gct att gac 55Met Ile Phe Ile Val Ile Met Ala Leu Ala Ile Asp1 5 10tgt gca cat gga ggt ttt cca atc tat gag ata gat aac aga cct gga tgc106Cys Ala His Gly Gly Phe Pro Ile Tyr Glu Ile Asp Asn Arg Pro Gly Cys15 20 25tat gtt gac cct gca gag aga gtt gca tgt gca ggt gca gga gtg aca aaa157Tyr Val Asp Pro Ala Glu Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Lys30 35 40 45gct gaa tgc aag gct aaa ggc tgc tgt ttt att tca gca agg aga aat aca208Ala Glu Cys Lys Ala Lys Gly Cys Cys Phe Ile Ser Ala Arg Arg Asn Thr50 55 60att tgg tgc ttt aaa ctt aaa gaa tca gcg gat gcc tgg aaa tgt gct gtc259Ile Trp Cys Phe Lys Leu Lys Glu Ser Ala Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val65 70 75 80ccc atg aat acg aga gtt gca tgc gct ggc gca ggt gtc aca cct gct gaa310Pro Met Asn Thr Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Pro Ala Glu85 90 95tgc aag gga aaa ggt tgt tgt ttc aat tca agc tac tat gga aca gta tgg361Cys Lys Gly Lys Gly Cys Cys Phe Asn Ser Ser Tyr tyr Gly Thr Val Trp100 105 110tgc ttt aaa cct caa gaa taa382Cys Phe Lys Pro Gln Glu *115 120ctcatctata aaatggaatt gttcaagatc agaacaaggt tgatgataag tgctctatta 442ctgtccactt tttcttctcc cctttttttt gtttgtgcaa atgctccagc atttgcaagc 502agtgtacatt tatttatttt ttttggtcta tggatcgttt taaaaatata gtttaaattt 562gagcaacata aggctattaa acataggcta ttatacaaaa tgaataatta aaattagcaa 622ttaaagtgaa ggtaaacttt tatgaatgaa agccctgttt tttaataggc aaaatacaaa 682aatatgggca ctgcttgtaa atgctggagc agcatttccc caatgtattg tatatttcta 742gatccaaaac atatcataag ttttcaaatg gaaaaattgt taattctgct atcataaaga 802aggggaattt gtgtacttgt gtgtaactgg aaagaaacaa ttctaattgt atgtttatat 862tttggattac atttgaccaa agtaactccc acatttgtat gcaaattata tttaaattaa 922taaaattgca atatgcttat ggtaatttaa aaatatgttt aacaatgtta ccaaaaatgt 982ttggcaaaaa aataaacatc cactggatca gcacctctaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1042aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1061<210>2<211>104<212>PRT<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)<220>
<221>PRPTEIN<222>(17)...(120)<400>2Met Ile Phe Ile Val Ile Met Ala Leu Ala Ile Asp Cys Ala His Gly1 5 10 15Gly Phe Pro Ile Tyr Glu Ile Asp Asn Arg Pro Gly Cys Tyr Val Asp20 25 30Pro Ala Glu Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Lys Ala Glu35 40 45Cys Lys Ala Lys Gly Cys Cys Phe Ile Ser Ala Arg Arg Asn Thr Ile50 55 60
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<221>
<222>(104)<400> 3Gly Phe Pro Ile Tyr Glu Ile Asp Asn Arg Pro Gly Cys Tyr Val Asp1 5 10 15Pro Ala Glu Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Lys Ala Glu20 25 30Cys Lys Ala Lys Gly Cys Cys Phe Ile Ser Ala Arg Arg Asn Thr Ile35 40 45Trp Cys Phe Lys Leu Lys Glu Ser Ala Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val50 55 60Pro Met Asn Thr Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Pro Ala65 70 75 80Glu Cys Lys Gly Lys Gly Cys Cys Phe Asn Ser Ser Tyr tyr Gly Thr85 90 95Val Trp Cys Phe Lys Pro Gln Glu100 10權(quán)利要求
1.大蹼鈴蟾博瑪津蛋白，其特征是從中國特產(chǎn)兩棲動物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離純化得到的一種單鏈蛋白，含104個氨基酸，其多肽氨基酸全序列一級結(jié)構(gòu)為SEQ ID NO1。
2.大蹼鈴蟾博瑪津蛋白基因核苷酸序列，其特征在于編碼大蹼鈴蟾博瑪津蛋白的基因的cDNA由1061個核苷酸組成，其自5’端至3’端核苷酸序列為SEQ NO2。
3.權(quán)利要求2所述的大蹼鈴蟾博瑪津蛋白的基因核苷酸序列，其特征在于編碼成熟的大蹼鈴蟾博瑪津蛋白為SEQ NO2中的第67-378位核苷酸，其氨基酸序列為SEQ NO1。
4.權(quán)利要求1所述的大蹼鈴蟾博瑪津蛋白，其特征在于該蛋白可作為血小板聚集誘導劑。
5.權(quán)利要求1所述的大蹼鈴蟾博瑪津蛋白，其特征在于該蛋白可作為制備胃潰瘍藥物的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大蹼鈴蟾博瑪津蛋白及其基因和在制藥中的應用，屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域。大蹼鈴蟾博瑪津蛋白是從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽，氨基酸全序列為NH
文檔編號A61P7/02GK1629190SQ20041004053
公開日2005年6月22日 申請日期2004年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者張云, 張 杰, 李文輝 申請人:中國科學院昆明動物研究所