專(zhuān)利名稱(chēng)：大蹼鈴蟾多肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種大蹼鈴蟾多肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
自從抗生素發(fā)明以來(lái)，人類(lèi)在控制和治療微生物感染疾病中取得了較大的成就，但隨著藥物的持續(xù)使用，目前微生物抗藥性已成為臨床微生物感染疾病治療的重大問(wèn)題，以至于某些病原細(xì)菌已沒(méi)有臨床治療的一線藥物。萬(wàn)古霉素抗性的葡萄球菌、腸球菌以及其他革蘭氏陰性感染疾病目前均是世界范圍內(nèi)的臨床難題。三類(lèi)主要引起腦膜炎的細(xì)菌在臨床上也出現(xiàn)了強(qiáng)的抗藥性，抗青霉素、氯霉素腦膜炎雙球菌，肺炎球菌，對(duì)抗新頭孢菌素抗生素的肺炎球菌也廣泛出現(xiàn)。因此新一類(lèi)抗生素的研制已成為當(dāng)務(wù)之急和國(guó)際上的熱點(diǎn)。與目前廣泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多優(yōu)點(diǎn)如在最小作用濃度時(shí)，快速而廣譜的殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)，對(duì)真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，對(duì)局部感染和全身感染都有效。由此看來(lái)，在目前不少病原菌對(duì)已有抗生素逐漸產(chǎn)生耐藥性，而新的抗生素發(fā)現(xiàn)又極為困難的情況下，多肽類(lèi)物質(zhì)正成為新一類(lèi)抗生素，其研制目前受到廣泛重視。
腫瘤也是危害人類(lèi)健康的另一類(lèi)主要疾病，而且治療藥物匱乏，目前在化療中所使用的藥物，如阿霉素，環(huán)磷酰胺等等均具有較大的人體毒性，副作用非常大，因而腫瘤治療藥物的開(kāi)發(fā)是藥物研制的熱點(diǎn)。
艾滋病(AIDS)是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)引起的破壞肌體免疫系統(tǒng)的致死疾病。這一被稱(chēng)為“二十世紀(jì)瘟疫”的病魔，已蔓延到世界的每個(gè)角落，眾多的發(fā)展中國(guó)家正在遭受它的危害。據(jù)WHO最新公布的材料，AIDS流行的國(guó)家和地區(qū)達(dá)170多個(gè)，全球感染HIV者已達(dá)4400多萬(wàn)人，已有1400萬(wàn)人死亡，據(jù)專(zhuān)家估計(jì)，我國(guó)目前實(shí)際HIV感染人數(shù)超過(guò)50萬(wàn)人。由于目前尚無(wú)可預(yù)防的有效疫苗，抗HIV藥物成為防治AIDS的有效手段。另一方面，目前發(fā)現(xiàn)HIV病毒易變異及對(duì)許多藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥性，造成治療上的巨大困難，從傳統(tǒng)藥物和天然資源中尋找新的抗AIDS藥物和先導(dǎo)化合物的研究，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外新藥研制中的重要研究方面和非常活躍的領(lǐng)域。
兩棲類(lèi)動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，很多兩棲類(lèi)動(dòng)物在中國(guó)屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)等。已報(bào)道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用等。從這些傳統(tǒng)藥物中尋找特定藥理活性的單體化合物是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一。在國(guó)外，兩棲類(lèi)皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道從爪蟾(Xenopuslaevis)皮膚分泌液獲得的抗菌肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時(shí)具有抗腫瘤活性；國(guó)外學(xué)者也已報(bào)道從東方鈴蟾(Bombina orientalis)和花鈴蟾(Bombinavariegata)中分離出若干具廣譜抗微生物活性的多肽類(lèi)物質(zhì)，如Bombinin和BLP-like多肽。由于抗菌肽作為新一代抗菌藥物的誘人前景，肽類(lèi)抗生素已引起世界的廣泛關(guān)注，如Magainin制藥公司宣布，他們生產(chǎn)的爪蟾皮膚抗菌肽Magainin類(lèi)似物MSI-78用于治療926例糖尿病患者因多種細(xì)菌感染而引起足部潰瘍的III期臨床結(jié)果表明，MSI-78與ofloxacin有同樣的效果，但產(chǎn)生更小的副作用。Intrabiotics公司生產(chǎn)的抗菌肽IB-367已獲準(zhǔn)用于治療癌癥病人因多種細(xì)菌感染而引起的口腔潰瘍一期臨床試驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，天蠶抗菌肽和蜂毒抗菌肽的部分序列雜合而成的含12-18氨基酸殘基的多肽對(duì)綠膿假單胞菌引起的兔眼感染有良好的治療作用。在國(guó)外，抗菌肽已開(kāi)始用于抗腫瘤和抗帶外殼病毒的研究和治療，但未見(jiàn)詳細(xì)的報(bào)道。最近，一種兩棲類(lèi)核酸酶對(duì)HIV的選擇性抑制作用更引起了人們對(duì)兩棲類(lèi)活性物質(zhì)的注意。
我國(guó)對(duì)兩棲類(lèi)藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對(duì)其皮膚活性肽類(lèi)物質(zhì)的研究還較少。大蹼鈴蟾(Bombina maxima)主要分布于我國(guó)的云南、四川省，是我國(guó)的特色資源動(dòng)物之一，也是特色的民族民間藥物。
發(fā)明人將本發(fā)明的大蹼鈴蟾多肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。也未發(fā)現(xiàn)關(guān)于兩棲類(lèi)多肽同時(shí)具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒活性的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌)，抗腫瘤和抗HIV活性的大蹼鈴蟾多肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用。，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案大蹼鈴蟾多肽，是我們首次從兩棲類(lèi)動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽，分子量2698.4，等電點(diǎn)10.0，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為蘇氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-賴(lài)氨酸-賴(lài)氨酸-亮氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-賴(lài)氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-亮氨酸-賴(lài)氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-賴(lài)氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-蘇氨酸(NH2-TITTKKLSGLKTALKGAAKELASTYT-COOH)。
大蹼鈴蟾多肽制備的方法，是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無(wú)水乙醚(1升體積容積加1毫升無(wú)水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見(jiàn)大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來(lái)，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥后，經(jīng)DEAE-Sephadex A-50離子交換后，收取所得峰I經(jīng)Sephadex G-50凝膠過(guò)濾后取峰IV，峰IV再經(jīng)CM-Sephadex C-25離子交換，取第三步柱層析分離出的峰II，再經(jīng)高效液相色譜(HPLC)反相C18柱分離純化，取第四步HPLC反相C18柱層析分離出的峰I即可。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
大蹼鈴蟾多肽作為制備廣譜抗微生物藥、抗腫瘤藥、抗艾滋病藥中的應(yīng)用。
下面用本發(fā)明的大蹼鈴蟾多肽的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的藥效作用和有益效果1，大蹼鈴蟾多肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用抗菌活性檢測(cè)，采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來(lái)源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此試驗(yàn)重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1。
表1，大蹼鈴蟾多肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用
由表1可見(jiàn)，大蹼鈴蟾多肽第一步DEAE-Sephadex A-50離子交換粗品及純化大蹼鈴蟾多肽均具有顯著的抑制細(xì)菌(包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌)生長(zhǎng)的作用，而且與文獻(xiàn)報(bào)道的其他來(lái)源抗菌多肽相比，大蹼鈴蟾多肽的抗菌活性平均高10-50倍。表2，大蹼鈴蟾多肽抑制真菌生長(zhǎng)的作用
2，大蹼鈴蟾多肽抑制真菌生長(zhǎng)的作用抗真菌活性檢測(cè)，采用杯碟法。培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。真菌株來(lái)源于云南大學(xué)微生物研究所，此試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，結(jié)果如表2。
由表2可見(jiàn)，除抑制細(xì)菌生長(zhǎng)外，大蹼鈴蟾多肽第一步DEAE-Sephadex A-50離子交換粗品及純化大蹼鈴蟾多肽均具有顯著的抑制真菌生長(zhǎng)的作用，而且與其他來(lái)源抗菌多肽相比，抗真菌活性平均也高10-50倍。
3，大蹼鈴蟾多肽抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板上，將待測(cè)化合物用完全培養(yǎng)基進(jìn)行5倍或2倍倍比稀釋?zhuān)擦鶄€(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。每孔滴加3×105/ml的C8166細(xì)胞或Molt-4細(xì)胞100μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。72小時(shí)(C8166)或48小時(shí)(Molt-4)用MTT方法測(cè)定待測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。EC50是對(duì)50％宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用時(shí)的藥物濃度。
4，大蹼鈴蟾多肽對(duì)HIV-1誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制作用在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板上，將待測(cè)化合物用完全培養(yǎng)基進(jìn)行5倍或2倍倍比稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照，HIV感染細(xì)胞對(duì)照。每實(shí)驗(yàn)孔滴加3×104個(gè)C8166細(xì)胞和200 TCID50的HIV-1mB，即感染復(fù)數(shù)為0.007，每孔的總體積為200μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。感染后第3天觀察待測(cè)化合物對(duì)合胞體形成的影響。在100倍的倒置顯微鏡下，選取5個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)HIV-1IIIB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成的合胞體數(shù)。EC50為抑制合胞體形成達(dá)50％時(shí)的藥物濃度。CC50是對(duì)50％宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用時(shí)的藥物濃度，治療指數(shù)(TI)為CC50/EC50的比值表3大蹼鈴蟾多肽抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用
目前臨床上所用大部分抗生素類(lèi)藥物不具有抑制腫瘤細(xì)胞作用。由表3可見(jiàn)，除抑制微生物生長(zhǎng)外，大蹼鈴蟾多肽粗品及純化大蹼鈴蟾多肽均具有顯著的體外抑制人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。表4大蹼鈴蟾多肽對(duì)HIV-1IIIB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制作用
從表4可見(jiàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道的其他來(lái)源抗菌多肽和目前目前臨床上所用抗生素類(lèi)藥物不同，大蹼鈴蟾多肽粗品及不同批號(hào)的純化大蹼鈴蟾多肽均有顯著的體外抑制HIV-1IIIB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的作用。
從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出本發(fā)明大蹼鈴蟾多肽的有益效果在于大蹼鈴蟾多肽粗品及不同批號(hào)的純化大蹼鈴蟾多肽均有顯著的抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的作用(包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌，真菌；MIC在0.5-10μg/ml范圍內(nèi))。而且與文獻(xiàn)報(bào)道的其他來(lái)源抗菌多肽相比，大蹼鈴蟾多肽的抗菌活性平均高10-50倍。與文獻(xiàn)報(bào)道的其他來(lái)源抗菌多肽和目前目前臨床上所用抗生素類(lèi)藥物不同，大蹼鈴蟾多肽具有顯著地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，對(duì)C8166，Molt-4腫瘤細(xì)胞的抑制率EC50平均分別為24.6μg/ml，27.6μg/ml；另一方面，大蹼鈴蟾多肽具顯著的抗艾滋病病毒活性，多肽濃度達(dá)到3.0μg/ml時(shí)，大蹼鈴蟾多肽對(duì)病毒復(fù)制抑制率達(dá)50％。因此，本發(fā)明的大蹼鈴蟾多肽是一種首次從我國(guó)特色藥用生物資源中自己研制的具有抗微生物，抗腫瘤，抗艾滋病病毒的生物活性多肽。
下面結(jié)合附圖用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。


圖1為本發(fā)明大蹼鈴蟾多肽的DEAE-Sephadex A-50離子交換層析圖。
圖2為本發(fā)明大蹼鈴蟾多肽的Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析圖。
圖3為本發(fā)明大蹼鈴蟾多肽的CM-Sephadex C-25離子交換層析圖。
圖4為本發(fā)明大蹼鈴蟾多肽的HPLC反相C18柱層析圖。
實(shí)施例1，制備大蹼鈴蟾多肽活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，將大蹼鈴蟾置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無(wú)水乙醚(1升體積容積加1毫升無(wú)水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見(jiàn)大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來(lái)，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥、低溫保存。第一步DEAE Sephadex A-50離子交換，按上述方法獲得原材料大蹼鈴蟾分泌物凍干粉，凍干粉溶解于0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH7.3的緩沖液，裝于3.5KDa透析袋，于同樣緩沖液透析12小時(shí)；DEAE SephadexA-50(Pharmacia產(chǎn)品)陰離子交換柱(500mm長(zhǎng)，26mm直徑)經(jīng)0.05M Tris-HCl，
含10mM EDTA，pH7.3緩沖液平衡，已透析好的樣品上柱，經(jīng)兩個(gè)柱體積同樣緩沖液沖洗至穿透峰被完全洗脫，再用含NaCl的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集穿透峰I。
第二步，Sephadex G-50凝膠過(guò)濾第一步得到的活性成分穿透峰I凍干，溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液，上樣于Sephadex G-50(Pharmacia產(chǎn)品)凝膠過(guò)濾柱(1000mm長(zhǎng)，26mm直徑)，用同樣緩沖液洗脫，收集峰IV。
第三步，CM Sephadex C-25離子交換凝膠過(guò)濾得到的活性成分峰IV上樣品于經(jīng)0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液平衡的CM SephadexC-25(Pharmacia產(chǎn)品)陽(yáng)離子交換柱(300mm長(zhǎng)，26m直徑)，再用含NaCl的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集峰II。
第四步，反相高壓液相層析(RP-HPLC)CM Sephadex C-25離子交換得到的活性成分峰II以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，收集HPLC反相C18柱層析峰I(箭頭標(biāo)記)即為大蹼鈴蟾多肽。
2，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment massspectrometry，F(xiàn)AB-MS)，以甘油∶間硝基芐醇∶二甲亞砜(1∶1∶1，V∶V∶V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。
3，純化大蹼鈴蟾多肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過(guò)上述方法制備的大蹼鈴蟾多肽，是我們首次從中國(guó)兩棲類(lèi)動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽，分子量2698.4，等電點(diǎn)10.0，全序列結(jié)構(gòu)為蘇氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-賴(lài)氨酸-賴(lài)氨酸-亮氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-賴(lài)氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-亮氨酸-賴(lài)氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-賴(lài)氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-蘇氨酸(NH2-TITTKKLSGLKTALKGAAKELASTYT-COOH)。作為制備抗微生物感染、抗腫瘤、抗艾滋病藥物。
權(quán)利要求
1，大蹼鈴蟾多肽，其特征是從中國(guó)兩棲類(lèi)動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽，分子量2698.4，等電點(diǎn)10.0，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為蘇氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-賴(lài)氨酸-賴(lài)氨酸-亮氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-賴(lài)氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-亮氨酸-賴(lài)氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-賴(lài)氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-蘇氨酸。
2，大蹼鈴蟾多肽的制備方法，其特征是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無(wú)水乙醚，密閉容器3-5分鐘，可見(jiàn)大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來(lái)，收集分泌物，離心去除沉淀、冷凍干燥后，經(jīng)離子交換、凝膠過(guò)濾、高壓液相反相柱層析分離純化，即可得到大蹼鈴蟾多肽。
3，大蹼鈴蟾多肽作為制備治微生物感染疾病藥物、腫瘤治療藥物、艾滋病治療藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。大蹼鈴蟾多肽是從中國(guó)兩棲類(lèi)動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽,分子量2698.4,等電點(diǎn)10.0,多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為:NH
文檔編號(hào)A61K38/17GK1336386SQ0012241
公開(kāi)日2002年2月20日 申請(qǐng)日期2000年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月29日
發(fā)明者張?jiān)? 賴(lài)仞, 鄭永唐, 劉廣杰, 李文輝, 唐紹宗 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所