一種具有dpp-iv抑制活性的鹿肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽GPAGPXGVXGL在制備抑制二肽基肽酶一IV(DPP-IV)及降血糖中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 二膚基膚酶一IV (dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV) (EC3. 4. 14. 5)是一種絲氨 酸蛋白酶，廣泛分布于人體內(nèi)。DPP-IV通過對多肽的剪切使其失活，從而達(dá)到調(diào)節(jié)生理功能 的作用。DPP-IV優(yōu)先水解N-末端第二位上具有脯氨酸（Pro)或丙氨酸（Ala)的蛋白質(zhì)。 其作用底物包括：胰高血糖素樣肽-I (GLP217-36)、抑胃肽（GIP1-42)、神經(jīng)肽（NPY)、YY肽 (PYY)以及胰多肽家族（PP-family)等。這些物質(zhì)的共同特點(diǎn)就是N-末端第二位的氨基酸 殘基或者是脯氨酸或者是丙氨酸殘基。DPP-IV通過作用于以上多肽底物而在糖尿病、葡萄 糖耐量、肥胖、食欲調(diào)節(jié)、高血脂癥、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)肽新陳代謝和T-細(xì)胞激活等相關(guān)疾病 中起著重要的作用。因此，體內(nèi)給予DPP-IV抑制劑可預(yù)防相關(guān)底物肽的N-末端降解，從而 保障人體機(jī)能正常運(yùn)行。
[0003] DPP-IV將完整的GLP-I和GIP反應(yīng)切斷N-末端2個(gè)氨基酸殘基后，使其失活從而 影響GLP-I和GIP相關(guān)的血糖調(diào)節(jié)等生理反應(yīng)。體內(nèi)給予DPP-IV抑制劑可預(yù)防GLP-I和 GIP的N-末端降解，使胰島素分泌物增加從而改善葡萄糖耐量。鑒于DPP-IV抑制劑與血糖 代謝的密切關(guān)系，DPP-IV抑制劑已成為新型2型糖尿病藥物的研究熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供多肽GPAGPXGVXGL在抑制DPP-IV活性和降血糖中的應(yīng)用；多 肽GPAGPXGVXGL具有DPP-IV抑制活性及降血糖活性，作為糖尿病、心臟病、心血管病、肥胖 癥、腎病、免疫紊亂等疾病的保健品和藥物先導(dǎo)化合物具有良好的應(yīng)用前景。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以所述多肽GPAGPXGVXGL為抑制DPP-IV活性和降血糖的 有效成份。
[0006] 其具有序列表SEQ ID NO : 1中氨基酸序列；多肽GPAGPXGVXGL為DPP-IV抑制劑及 降血糖藥物的活性成份，其中可添加藥物學(xué)上可接受的載體或輔料。
[0007] 具有抑制DPP-IV活性和降血糖活性的多肽化合物GPAGPXGVXGL的氨基酸序列為 Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Val-Hyp-Gly-Leu。單鏈線性結(jié)構(gòu)，分子量為 950.1 Da，白色 粉末狀，易溶于水，對DPP-IV活性具有很強(qiáng)的抑制作用，IC5。為0. 32mM。
[0008] 多肽GPAGPXGVXGL具備DPP-IV抑制劑所要求的特征=DPP-IV優(yōu)先水解N-末端第 二位上具有脯氨酸（Pro)或丙氨酸（Ala)的蛋白質(zhì)或肽，GPAGPXGVXGL的N-末端第二位上 是脯氨酸（Pro)。
[0009] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：
[0010] 本發(fā)明首次從鹿蛋白中獲得并確定了活性化合物的結(jié)構(gòu)，化合物具有較好的抑制 DPP-IV的活性，因此作為糖尿病、心臟病、心血管病、肥胖癥、腎病、免疫紊亂等疾病的保健 品和藥物先導(dǎo)化合物具有良好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)施例1多肽GPAGPXGVXGL的制備
[0012] 100g新鮮的馬鹿鹿皮，用質(zhì)量濃度10% NaOH于50°C煮30分鐘進(jìn)行脫脂處理后， 純水清洗干凈，剪為2~3平方厘米的碎片。鹿皮碎片按照1:100 (原料：緩沖液質(zhì)量比） 加入0.0 lM醋酸緩沖液，再按1:100 (酶：原料）質(zhì)量比加入胃蛋白酶，于40°C攪拌反應(yīng)2小 時(shí)。將上述反應(yīng)液的pH用IM NaOH調(diào)至7,加入復(fù)合酶（糜胰蛋白酶，中性蛋白酶，質(zhì)量混 合比例1:1)進(jìn)行酶解，加酶量為反應(yīng)物質(zhì)量的0. 1%，于40°C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后 90°C滅活20min。將上述反應(yīng)液5000rpm離心5min，收集上清，上述酶解產(chǎn)物經(jīng)制備色譜分 離，色譜柱為C18 (20X250mm，10 μ m)，所用的流動相A為質(zhì)量濃度0. 1 %甲酸/水溶液，流 動相B為質(zhì)量濃度0. 1 %的甲酸/乙腈溶液，流速為2mL/min，洗脫過程如下：5% B- 35 % B(V/V) - 80% B(V/V)。將在280nm下所檢測到的色譜峰分別收集得到不同組分冷凍干燥， 為乳白色粉末狀樣品。
[0013] 所得樣品分別經(jīng)反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（RPLC-MS/MS)分析：將冷凍干燥后 的酶解樣品用體積濃度〇. 1 %甲酸溶液配制為〇. 4 μ g/ μ L，進(jìn)樣20 μ L進(jìn)行LTQ線性離子 阱質(zhì)譜（配置納升級電噴霧源）分析。利用Xcalibur軟件（Thermo)進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù) 收集。實(shí)驗(yàn)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果分別在honeybee, Brassica campestris L.蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (http://www. uniprot. org/)中進(jìn)行檢索，技術(shù)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)庫檢索軟件為SEQUEST。獲 得序列為 Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Val-Hyp-Gly-Leu。
[0014] 實(shí)施例2多肽GPAGPXGVXGL的DPP-IV抑制活性檢測
[0015] ⑴原理
[0016] 采用以甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺（Gly-Pro-PNA)為底物的發(fā)色底物 法篩選DPP-IV抑制劑，該方法的檢測原理為在堿性條件下DPP-IV催化底物 Gly-Pro-p-nitroanilide水解，生成黃色的對硝基苯胺，后者在波長405nm處有特征性吸 收峰，通過酶標(biāo)儀在405nm處測得的吸光度大小反映酶活性高低。
[0017] ⑵方法
[0018] 樣品：將樣品溶解于IOOmM的Tris-HCl緩沖液（pH = 8. 0)，配成40mg/mL儲備液， 再將儲備液稀釋成不同的濃度，作為樣品溶液。
[0019] 底物：Gly-pr〇-p-nitroanilide 溶液，用 IOOmM 的 Tris-HCl 緩沖液（pH = 8. 0)將 Gly-pr〇-p-nitroanilide 配置成 L 59mM 的 Gly-pr〇-p-nitroanilide 溶液。
[0020] 酶：DPP-IV 溶液，用 IOOmM 的 Tris-HCl 緩沖液（pH = 8. 0)配置成 0· OlU/mL 的 DPP-IV 溶液。
[0021 ] 終止溶液：IM的醋酸一醋酸鈉緩沖液（pH = 4. 0)。
[0022] 實(shí)驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行，利用酶標(biāo)儀在405nm檢測吸光度。首先將酶、緩沖液及藥物 在37°C溫度下分別水浴30min，然后將樣品（或緩沖液）、底物依次加入96孔板內(nèi)37°C孵育 10分鐘，再加入DPP-IV酶溶液，混勻后于37°C溫育60分鐘，加入100 μ L IM的醋酸-醋酸 鈉緩沖液（pH 4. 0)使反應(yīng)終止。用酶標(biāo)儀測定405nm吸光度（OD)。反應(yīng)總體積為100 μ 1。 實(shí)驗(yàn)分為4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組分別為：
[0023] 樣品組（S組）：樣品+酶+底物。
[0024] 樣品空白組（SB組）：樣品+底物。
[0025] 陰性對照組（C組）：酶+底物。
[0026] 空白組（B組）：底物。
[0027] 具體各組加樣品見表1。
[0028] 表1 DPP-VI抑制活性實(shí)驗(yàn)分組及加樣量
[0029]
[0030] 注：（1)表中數(shù)字的單位均為μ 1。
[0031] (2)反應(yīng)總體積為100 μ 1，各組按照表中所列加入反應(yīng)物后用緩沖液將最終體積 補(bǔ)至100 μ 1。
[0032] (3)抑制率的計(jì)算
[0034] (4)檢測結(jié)果
[0035] 分別用 12. 5 μ g/ml, 25 μ g/ml，50 μ g/ml，100 μ g/ml，250 μ g/ml，500 μ g/ml 的多 肽濃度，按上述方法進(jìn)行DPP-IV抑制活性檢測。結(jié)果如下表：
[0038] 經(jīng)ICm計(jì)算器計(jì)算該序列的ICm為0· 30mg/mL,即0· 32mM。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有DPP-?ν抑制活性的鹿肽，其特征在于：所述多肽為GPAGPXGVXGL，具有序列 表SEQ ID N0:1中氨基酸序列；該多肽的氨基酸序列具體為，Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-G ly-Val-Hyp-Gly-Leu 〇2. -種權(quán)利要求1所述鹿肽在制備DPP-IV抑制劑或降血糖藥物中的應(yīng)用。3. 按照權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述DPP-IV抑制劑及降血糖藥物是以多 肽GPAGPXGVXGL為活性成份，其中可添加藥物學(xué)上可接受的載體或輔料。4. 按照權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述多肽在制備預(yù)防和/或治療糖尿病、 心臟病、心血管病、肥胖癥、腎病、免疫紊亂中的一種或二種以上疾病藥物和/或保健品中 的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有DPP-IV抑制活性的鹿肽GPAGPXGVXGL，其氨基酸序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Val-Hyp-Gly-Leu。多肽GPAGPXGVXGL具有DPP-IV抑制活性及降血糖活性，作為糖尿病、心臟病、心血管病、肥胖癥、腎病、免疫紊亂等疾病的保健品和藥物先導(dǎo)化合物具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K38/08, A61P13/12, A61P3/04, A61P3/10, A61P37/00, C07K7/06, A61P9/00
【公開號】CN105504008
【申請?zhí)枴緾N201410495171
【發(fā)明人】鄒漢法, 靳艷, 晏嘉澤
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2014年9月24日