預測受試者患癌癥的風險或診斷癌癥的方法
【專利說明】預測受試者患癌癥的風險或診斷癌癥的方法
[0001] 本發(fā)明的主題為預測未患癌癥的受試者患癌癥的風險或者診斷受試者癌癥的方 法，包括：
[0002] 確定獲自所述受試者的體液中包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽的速激肽原或其至少5個 氨基酸的片段的水平；以及
[0003] 將所述速激肽原或其片段的水平與患癌癥的風險相關(guān)聯(lián)，其中水平降低預示患 癌癥的風險增加，或者診斷癌癥，其中水平降低與癌癥診斷相關(guān)。
[0004] 物質(zhì)P(SP)為神經(jīng)肽：一種十一氨基酸多肽，其作為神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)發(fā)揮功 能。其屬于速激肽神經(jīng)肽家族。在差異剪接前速激肽原A基因后，物質(zhì)P及其密切相關(guān)的 神經(jīng)肽--神經(jīng)激肽A(NKA)由多蛋白前體產(chǎn)生。在CNS中，物質(zhì)P參與疼痛傳遞系統(tǒng)。
[0005] 物質(zhì)P在炎性過程中起作用（Ang et al, 2011)，并且在癌細胞中具有抗凋亡活性 (Munoz et al, 2005)〇
[0006] 物質(zhì)P受體（神經(jīng)激肽1受體）在癌癥發(fā)展中起著關(guān)鍵作用（Fries et al，2003 ; Munoz et al, 2010 ;Rameshwar, 2007 ;Schulz et al, 2006)。體外阻斷物質(zhì) P通路顯著降低 腫瘤細胞的生長（綜述參見Munoz and Rossow, 2009)。
[0007] Belting 等（Cancer, Epidemiology, Biomarkes&Prevention)已報導了使用血管 活性肽預測男性癌癥風險。1991-1994年，測量了來自在基線檢查前無癌癥的馬爾摩膳食與 癌癥研宄的參與者（1768名男性和2293名女性）空腹血漿的MR-pro-ANP、MR-pro-ADM和 肽素。作者認為在女性中，生物標志物與癌癥發(fā)生之間沒有關(guān)系。
[0008] 本發(fā)明的主題是研宄速激肽原預測癌癥發(fā)生和預測癌癥復發(fā)風險的預測和診斷 能力。為了解決這一問題，在15年的隨訪期間，測量了所述瑞典前瞻性隊列研宄（馬爾摩 膳食與癌癥研宄）中空腹血漿的速激肽原的穩(wěn)定片段（Ernst et al，2008)以及乳腺癌發(fā) 生的該生物標志物的相關(guān)基線水平。
[0009] 令人吃驚地，顯示速激肽原是預測未患癌癥的受試者患癌癥的風險或者診斷受試 者癌癥的有力且高度顯著的生物標志物。
[0010] 因此，本發(fā)明的主題為預測未患癌癥的受試者患癌癥的風險或者診斷受試者癌癥 的方法，其包括：
[0011] 魯確定獲自所述受試者的體液中包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽的速激肽原、其剪接變體 或其至少5個氨基酸的片段的水平；以及
[0012] 魯將所述速激肽原、其剪接變體或其片段水平與患癌癥的風險相關(guān)聯(lián)，其中水平 降低預示患癌癥的風險增加，或者診斷癌癥，其中水平降低與癌癥診斷相關(guān)。
[0013] 在本發(fā)明的另一主題中，所述方法另外包括以下步驟：
[0014] 魯另外確定獲自所述受試者的體液中神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段 的水平；以及
[0015] ?另外將所述神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段水平與患癌癥的風險相 關(guān)聯(lián)，其中神經(jīng)降壓素原或其片段水平增加預示患癌癥的風險增加，或者診斷癌癥，其中神 經(jīng)降壓素原或其片段水平增加與癌癥診斷相關(guān)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，上述方法可另外包括以下步驟：
[0017] 魯另外確定獲自所述受試者的體液中腦啡肽原或其至少5個氨基酸的片段的水 平；以及
[0018] 魯另外將腦啡肽原或其至少5個氨基酸的片段與患癌癥的風險相關(guān)聯(lián)，其中腦啡 肽原或其片段水平降低預示患癌癥的風險增加，或者診斷癌癥，其中腦啡肽原或其片段水 平降低與癌癥的診斷相關(guān)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，上述方法可另外包括以下步驟：
[0020] 魯另外確定獲自所述受試者的體液中胰島素的水平；以及
[0021] 魯另外將所述胰島素水平與患癌癥的風險相關(guān)聯(lián)，其中胰島素水平降低預示患癌 癥的風險增加，或者診斷癌癥，其中水平降低與癌癥診斷相關(guān)。
[0022] 因此，本發(fā)明的方法包括確定體液中包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽的速激肽原、其剪接 變體或其至少5個氨基酸的片段的水平，并且還可任選地包括選自以下的至少一種進一步 確定和另外與癌癥風險相關(guān)聯(lián)：
[0023] ?確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段的水平，以及
[0024] ?確定腦啡肽原或其至少5個氨基酸的片段的水平，以及
[0025] ?確定胰島素的水平。
[0026] 在本發(fā)明的一實施方案中，除了包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽的速激肽原、其剪接變體 或其至少5個氨基酸的片段外，還進一步確定了前述另外的生物標志物中的至少一種，并 另外與所述癌癥風險相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的一實施方案中，除了包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽的速 激肽原、其剪接變體或其至少5個氨基酸的片段外，還進一步確定了前述另外的生物標志 物中的至少兩種，并另外與所述風險相關(guān)聯(lián)。在一實施方案中，確定了所有上述四種生物標 志物。
[0027] 在上述方法的一個具體實施方案中，其中除了包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽的速激肽 原、其剪接變體或其至少5個氨基酸的片段外，還確定了其他的生物標志物并與所述風險 相關(guān)聯(lián)，"另外關(guān)聯(lián)"是指通過考慮由個別生物標志物獲得的癌癥發(fā)展的相對風險因素而確 定的生物標志物水平的組合分析。
[0028] 多于一種標志物的組合分析作為一個實例在實施例5中說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員知 道可進行多于一種標志物或參數(shù)的組合分析的統(tǒng)計方法。
[0029] 在上述方法的一實施方案中，速激肽原、其剪接變體或其片段水平降低為閾值以 下的水平，其中所述閾值為約l〇〇pmol/l或100pmol/l以下，優(yōu)選約80pmol/L或80pmol/ L以下，優(yōu)選約60pmol/L或60pmol/L以下，優(yōu)選約50pmol/L或50pmol/L以下，優(yōu)選約 45. 6pmol/L 或 45. 6pmol/L 以下，優(yōu)選約 40pmol/L。
[0030] 在上述方法的一實施方案中，神經(jīng)降壓素原或其片段水平增加為閾值以上的水 平，其中所述閾值為約78pmol/l PNT或78pmol/l PNT以上，優(yōu)選約100pmol/l或lOOpmol/ 1以上，更優(yōu)選約150pmol/l〇
[0031] 在上述方法的一實施方案中，腦啡肽原或其片段水平降低為閾值以下的水平，其 中所述閾值為約l〇〇pmol/l或100pmol/l以下，優(yōu)選約75pmol/L或75pmol/L以下，優(yōu)選約 50pmol/L 或 50pmol/L 以下，優(yōu)選約 40. 4pmol/L。
[0032] 在上述方法的一實施方案中，胰島素水平降低為閾值以下的水平，其中所述閾值 為約 70pmol/l。
[0033] 閾值必須根據(jù)使用的校準方法來理解，并且上述值必須根據(jù)本文實施例1、3和4 中使用的測定和校準方法來理解。
[0034] 在一具體實施方案中，所述受試者為女性。在一具體實施方案中，所述受試者為女 性，并且所述癌癥為乳腺癌。
[0035] 在一具體實施方案中，所述癌癥為肺癌。
[0036] 癌癥的其他實例可選自乳腺癌、肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌。
[0037] 在整個本說明書中，術(shù)語速激肽原和速激肽原A(PTA)同義使用。該術(shù)語包括速激 肽原A的所有剪接變體，即aFTA、0FTA、yFTA和SFTA。在整個本說明書 中，應理解術(shù)語速激肽原的片段還包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽。
[0038] 術(shù)語"確定包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽的速激肽原、其剪接變體或其至少5個氨基酸的 片段的水平"通常是指確定對前述分子內(nèi)區(qū)域的免疫反應性。這意味著并非必須選擇性測 量某一片段。應理解用于確定包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽的速激肽原或其至少5個氨基酸的片 段水平的結(jié)合劑，與包含所述結(jié)合劑的結(jié)合區(qū)域的任何片段相結(jié)合。所述結(jié)合劑可為抗體 或抗體片段或非IgG支架。
[0039] 因此，在一實施方案中，本發(fā)明的主題為確定男性或女性獲得癌癥如乳腺癌、肺癌 等的易感性。
[0040] 馬爾摩研宄中獲得的數(shù)據(jù)揭示了男性受試者患癌癥的風險與獲自所述男性受試 者的體液中速激肽原、其剪接變體或其至少5個氨基酸的片段水平之間的關(guān)聯(lián)性；然而，該 關(guān)聯(lián)性對于當前數(shù)據(jù)集并無統(tǒng)計顯著性，盡管在男性中也存在速激肽原、其剪接變體或其 片段水平降低下癌癥風險增加的明顯趨勢。然而，本發(fā)明的方法對于男性受試者也同樣具 有價值，但在本研宄中，對于男性所觀測到的效應相比女性并不強。這可能主要是由于男性 群體中癌癥發(fā)生的數(shù)目較低。
[0041] 如本文所用的術(shù)語"受試者"是指活的人或非人有機體。優(yōu)選地，在本文中所述受 試者為人類受試者。
[0042] 術(shù)語"水平降低"是指某一閾值水平以下的水平。術(shù)語"水平增加"是指某一閾值 以上的水平。體液可選自血液、血清、血漿、尿液、腦脊液（csf)和唾液。
[0043] 在具體實施方案中，所述體液為血液、血清或血漿。
[0044] 在本發(fā)明的一實施方案中，在從所述受試者采取體液樣品時，所述受試者從未被 診斷過患有癌癥。
[0045] 在另一實施方案中，在從所述受試者采取體液樣品時，所述受試者在先前已被診 斷為患有癌癥且已治愈，并且確定了患癌癥復發(fā)的風險，或者預測了癌癥復發(fā)。
[0046] 速激肽原可具有以下序列：
[0047] SEQ ID N0. 1(速激肽原 A(l-107)
[0048] EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALY GHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRR
[0049] 體液中可確定的速激肽原的片段可以，例如選自以下片段：
[0050] SEQ ID N0. 2 (速激肽原 1-37, P37)
[0051] EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA
[0052] SEQ ID NO. 3 (物質(zhì) P)
[0053] RPKPQQFFGLM(-NH2)
[0054] SEQ ID NO. 4 (神經(jīng)肽 K)
[0055] DADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLM(-NH2)
[0056] SEQ ID NO. 5 (神經(jīng)肽 y )
[0057] GHGQISHKRHKTDSFVGLM(-NH2)
[0058] SEQ ID NO. 6 (神經(jīng)激肽 1)
[0059] HKTDSFVGLM(-NH2)
[0060] SEQ ID NO. 7 (C-端側(cè)翼肽，PTA 192-107)
[0061] ALNSVAYERSAMQNYE
[0062] SEQ ID NO. 8 (PTA 同種型 a)
[0063] EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALY GHGQISHKMAYERSAMQNYERRR
[0064] SEQ ID NO. 9 (PTA 同種型 0 )
[0065] EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALY GHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRR
[0066] SEQ ID NO. 10 (PTA 同種型 〇 )
[0067] EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDAGHGQISHKMAYERSA MQNYERRR
[0068] SEQ ID NO. 11 (PTA 同種型 y)
[0069] EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDAGHGQISHKRHKTDSF VGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRRSEQ
[0070] SEQ ID NO. 12(PTA3-22)
[0071] GANDDLNYWSDWYDSDQIK
[0072] SEQ ID NO. 13 (PTA 21-36)
[0073] IKEELPEPFEHLLQRI
[0074] 確定PTA、其剪接變體或其片段的水平可指確定針對包含物質(zhì)P和神經(jīng)激肽的PTA 或其片段的免疫反應性。依賴于結(jié)合區(qū)域的用于確定PTA、其剪接變體或其片段的結(jié)合劑可 結(jié)合多于一種的以上所示的分子。這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
[0075] 根據(jù)本發(fā)明方法的更具體的實施方案中，確定了 P37(PTA 1-37, SEQ ID N0. 2, EEI GANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA)的水平。根據(jù)本發(fā)明的甚至更具體的實施方案中， 如果多于一種的結(jié)合劑優(yōu)先與 PTA 1-37，SEQ ID NO. 2，EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPF