專(zhuān)利名稱(chēng)：基于avl9的癌癥的診斷及治療的制作方法
基于AVL9的癌癥的診斷及治療本發(fā)明涉及用于免疫治療方法的肽、核酸和細(xì)胞。特別是，本發(fā)明涉及癌癥的免疫療法。本發(fā)明還涉及單獨(dú)使用或與其他腫瘤相關(guān)肽(刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答疫苗復(fù)合物的活性藥物成分)聯(lián)合使用的由CD8+T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤相關(guān)表位。本發(fā)明涉及33種新型肽序列及其變體，它們?cè)醋钥捎糜谝l(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的人腫瘤HLA-I類(lèi)分子，尤其是細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
胃癌是惡性細(xì)胞在胃壁形成的一種疾病。胃癌可發(fā)生于胃部的任何部分，可能擴(kuò)散到整個(gè)胃部以及其他器官；尤其是食道、肺和肝臟。胃癌是全球第四最常見(jiàn)的癌癥，2002年有93萬(wàn)確診病例。胃癌具有高死亡率(每年 80萬(wàn))，使之成為全球僅次于肺癌導(dǎo)致癌癥死亡的第二大最常見(jiàn)原因。此病較常見(jiàn)于男性，更常見(jiàn)于亞洲國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家。(http://www. who. int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.)
在美國(guó)，胃癌約占每年所有新發(fā)癌癥病例的2% (25500例)，但在其他國(guó)家更常見(jiàn)。在韓國(guó)，胃癌是位于第一位的癌癥，占惡性腫瘤的20. 8%。在日本，胃癌仍是男性最常見(jiàn)的癌癥。在美國(guó)，每年約有8000名男性和13000女性被診斷患有胃癌。大部分患者為70歲以上。胃癌是全球第四大常見(jiàn)癌癥，僅次于肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和直腸癌。此外，胃癌仍是第二大最常見(jiàn)癌癥死因。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，2007年有一百萬(wàn)新發(fā)病例，其中近70%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，大約 80 萬(wàn)例死亡。(http://www. cancer, org/downloads/STT/Global_Facts_and_Figures_2007_rev2. pdf.)此疾病的全球發(fā)病率中存在巨大的地域差異。該疾病的發(fā)病率在亞洲和南美洲部分地區(qū)最高，在北美最低。根據(jù)記錄，該疾病的死亡率在智利、日本、南美和前蘇聯(lián)最高。除了日本通常進(jìn)行早期檢測(cè)外(在韓國(guó)以有限的方式進(jìn)行)，世界大部分地區(qū)均不進(jìn)行篩查，因此，胃癌在得到確診時(shí)通常已為晚期。因而，胃癌仍然對(duì)醫(yī)療保健專(zhuān)業(yè)人士帶來(lái)重大挑戰(zhàn)。胃癌的危險(xiǎn)因素為幽門(mén)螺桿菌OLpylori)感染、吸煙、攝入高量鹽分、以及其他飲食因素。少數(shù)胃癌(1%至3%)與胃癌遺傳易感性癥候群相關(guān)。在彌漫型胃癌常染色體顯性遺傳易感性家族中，大約25%發(fā)生上皮鈣黏蛋白基因突變。這一亞群胃癌被稱(chēng)為遺傳性彌漫性胃癌。12提供遺傳咨詢，并考慮在種系截?cái)嗟哪贻p無(wú)癥狀攜帶者中進(jìn)行預(yù)防性胃切除術(shù)可能是有益的。胃壁由3層組織組成粘膜(最內(nèi))層、肌(中間)層和漿膜(最外)層。胃癌首先發(fā)生于粘膜層內(nèi)壁，隨著生長(zhǎng)而擴(kuò)散至外層。有四種標(biāo)準(zhǔn)治療方法可治療胃癌。胃癌治療方法包括手術(shù)、化療、放療或放化療。手術(shù)是胃癌的主要治療方法。手術(shù)的目的是進(jìn)行完全切除，并使切緣為陰性(R0切除)。但是，大約有50%局部胃癌不能進(jìn)行RO切除。Rl切除表示在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)殘留癌細(xì)胞(切緣陽(yáng)性)，R2切除表示有肉眼可見(jiàn)的殘留癌細(xì)胞，但疾病未向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?；颊呓Y(jié)果取決于診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)的最初期別(NCCN腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南 )。對(duì)于II期疾病的患者，治療性手術(shù)切除后的5年生存率為30-50%，III期患者為10-25%。這些患者局部及全身復(fù)發(fā)的可能性極高。80-90%的胃癌患者均會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，在較早期別得到確診的患者中6個(gè)月生存率為65%，而在較晚期確診的患者中不到15%。因此，仍然需要對(duì)以下癌癥患者實(shí)施安全有效、并且在不使用化療藥物或可能導(dǎo)致嚴(yán)重副作用的藥物即可提升患者健康的新型治療方案胃癌、攝護(hù)腺(上皮)癌、口腔癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)、急性髓性白血病(AML)、幽門(mén)螺旋桿菌引起的MALT淋巴瘤、結(jié)腸(上皮)癌/結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、宮頸(上皮)癌、人乳腺癌、攝護(hù)腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌、肝癌、不同表型的腦腫瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宮內(nèi)膜癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔(上皮)癌、膀胱癌、卵巢(上皮)癌、腎細(xì)胞癌、非典型腦膜瘤、乳頭狀甲狀腺癌、腦腫瘤、涎腺導(dǎo)管癌、宮頸癌、結(jié)外型T/NK細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和乳腺癌等惡性實(shí)體瘤、以及其他腫瘤。本發(fā)明采用刺激免疫系統(tǒng)的肽以一種無(wú)創(chuàng)方式作為抗腫瘤制劑
發(fā)明內(nèi)容
是否能刺激免疫應(yīng)答取決于是否存在被宿主免疫系統(tǒng)視為異物的抗原。發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原的存在增加了運(yùn)用宿主免疫系統(tǒng)干預(yù)腫瘤生長(zhǎng)的可能性。對(duì)于癌癥免疫療法，目前正在探索各種利用免疫系統(tǒng)的體液和細(xì)胞免疫作用的機(jī)制，用于癌癥免疫治療。細(xì)胞免疫應(yīng)答的特定元素能特異性地識(shí)別和破壞腫瘤細(xì)胞。從腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞群或外周血中分離出的細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(CTL)表明，這些細(xì)胞在癌癥的天然免疫防御中發(fā)揮了重要作用。特別是⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞CTCD8+)在這種反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，T⑶8+能識(shí)別通常8至10個(gè)源自蛋白或位于細(xì)胞質(zhì)的缺損核糖體產(chǎn)物(DRIP)的氨基酸殘基的主要組織兼容性復(fù)合體(MHC)所載的肽中所含的I類(lèi)分子。人MHC分子也稱(chēng)為人白細(xì)胞-抗原(HLA)。MHC分子有兩類(lèi)大部分有細(xì)胞核的細(xì)胞上都可發(fā)現(xiàn)的MHC-I類(lèi)分子。MHC分子分別由一條α重鏈和β_2-微球蛋白(MHC-I類(lèi)受體)或α和β鏈(MHC-II類(lèi)受體)組成。其三維構(gòu)造形成一個(gè)結(jié)合槽，用于與肽進(jìn)行非共價(jià)相互作用。MHCI類(lèi)分子提呈的肽主要為內(nèi)源性的蛋白、DRIPS和較大肽裂解生成的。MHC II類(lèi)分子主要發(fā)現(xiàn)于專(zhuān)業(yè)抗原提呈細(xì)胞(APC)上，它們主要提呈在內(nèi)吞作用過(guò)程中由APC占據(jù)且隨后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和MHC I類(lèi)分子的復(fù)合體由負(fù)載相應(yīng)T細(xì)胞受體(TCR)的CD8陽(yáng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，而肽和MHC II類(lèi)分子的復(fù)合體由負(fù)載相應(yīng)TCR的CD4陽(yáng)性輔助T細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。本領(lǐng)域已熟知其中的TCR、肽和MHC按1:1:1的化學(xué)計(jì)量比例而存在。對(duì)于引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的肽，它必須與MHC分子結(jié)合。這一過(guò)程依賴(lài)于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態(tài)性。MHC-I類(lèi)-結(jié)合肽的長(zhǎng)度通常為8-12個(gè)氨基酸殘基，并且在其與MHC分子相應(yīng)結(jié)合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個(gè)保守殘基(「錨」)。這樣，每個(gè)MHC的等位基因都有「結(jié)合基序」，從而確定哪些肽能與結(jié)合溝槽特異性
彡口口 在MHC-I類(lèi)依賴(lài)性免疫應(yīng)答中，肽不僅能與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的某些MHC-I類(lèi)分子結(jié)合，而且它們還必須能被帶有T細(xì)胞特異性受體的T細(xì)胞(TCR)識(shí)別。腫瘤特異性CTL所識(shí)別的抗原，即它們的表位，可以是源自所有蛋白類(lèi)型的分子，如酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子等，它們?cè)谙鄳?yīng)腫瘤的細(xì)胞中被表達(dá)，并且與同源未變的細(xì)胞相比，其表達(dá)上調(diào)。
目前將腫瘤相關(guān)肽分類(lèi)為以下主要幾組a)癌-睪丸抗原T細(xì)胞能夠識(shí)別的最先確認(rèn)的TAA屬于這一類(lèi)抗原，由于其成員表達(dá)于組織學(xué)相異的人腫瘤中、正常組織中、僅在睪丸的精母細(xì)胞/精原細(xì)胞中、偶爾在胎盤(pán)中，因此，它最初被稱(chēng)為癌-睪丸(CT)抗原。由于睪丸細(xì)胞不表達(dá)HLA I類(lèi)和II類(lèi)分子，所以，在正常組織中，這些抗原不能被T細(xì)胞識(shí)別，因此在免疫學(xué)上可考慮為具有腫瘤特異性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成員或NY-ES0-1。b)分化抗原腫瘤和正常組織(腫瘤源自該組織)都含有TAA，大多數(shù)TAA發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤和正常黑色素細(xì)胞中。許多此類(lèi)黑色素細(xì)胞譜系相關(guān)蛋白參與黑色素的生物合成，因此這些蛋白不具有腫瘤特異性，但是仍然被廣泛用于癌癥的免疫治療。實(shí)例包括，但不僅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-Ι或攝護(hù)腺癌的PSA。c)過(guò)量表達(dá)的TAA :在組織學(xué)相異的腫瘤中以及許多正常組織中都檢測(cè)到了基因編碼被廣泛表達(dá)的TAA，一般表達(dá)水平較低。有可能許多由正常組織加工和潛在提呈的表位低于T細(xì)胞識(shí)別的閾值水平，而它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)能夠透過(guò)打破先前確立的耐··受性而引發(fā)抗癌反應(yīng)。這類(lèi)TAA的典型實(shí)例為Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。d)腫瘤特異性抗原這些獨(dú)特的TAA產(chǎn)生于正?；?如聯(lián)蛋白XDK4等)的突變。這些分子變化中有一些與致瘤性轉(zhuǎn)化和/或進(jìn)展相關(guān)。腫瘤特異性抗原一般可在不對(duì)正常組織帶來(lái)自體免疫應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)的情況下誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫應(yīng)答。另一方面，這些TAA在多數(shù)情況下只與其上確認(rèn)了有TAA的確切腫瘤相關(guān)，并且通常在許多個(gè)體腫瘤之間并非共享 ΤΑΑ。e)由異常轉(zhuǎn)譯后修飾產(chǎn)生的TAA :此類(lèi)TAA可能由腫瘤中既不具有特異性也不過(guò)量表達(dá)的蛋白產(chǎn)生，但其仍然具有腫瘤相關(guān)性(該相關(guān)性由主要對(duì)腫瘤具有活性的轉(zhuǎn)譯后加工所致)。此類(lèi)TAA產(chǎn)生于變糖基化模式的改變，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生針對(duì)MUCl的新型表位或在降解過(guò)程中導(dǎo)致諸如蛋白拼接的事件，這可能具有也可能不具有腫瘤特異性。f)腫瘤病毒蛋白這些TTA是病毒蛋白，可在致癌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且由于它們是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能夠激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。這類(lèi)蛋白的例子有人乳頭狀瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它們?cè)趯m頸癌中表達(dá)。對(duì)于被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別為腫瘤特異性抗原或相關(guān)性抗原以及用于治療的蛋白質(zhì)，必須具備特殊的先決條件。該抗原應(yīng)主要由腫瘤細(xì)胞表達(dá)，而不由正常健康組織表達(dá)，或表達(dá)數(shù)量相對(duì)較少。更為適宜的情況是，該相應(yīng)抗原不僅出現(xiàn)于一種腫瘤中，而且濃度(即每個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)肽拷貝數(shù)目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原往往是源自直接參與因細(xì)胞周期控制或凋亡抑制中的一項(xiàng)功能而發(fā)生的正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的蛋白。另外，這些直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化事件的蛋白的下游靶標(biāo)可能會(huì)被上調(diào)，因此可能與腫瘤間接相關(guān)。這些腫瘤間接相關(guān)抗原也可能是預(yù)防接種方法的祀標(biāo)(Singh-Jasuja H. , EmmerichN. P. , Rammensee H. G. , Cancer Tmmunol. Immunother. 2004 Mar; 453 (3) : 187-95)。在這兩種情況中，至關(guān)重要的是，都要存在抗原氨基酸序列的表位，所以這種來(lái)自腫瘤相關(guān)抗原的肽(「免疫原性肽」)可導(dǎo)致體外或體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答。基本上，任何能與MHC分子結(jié)合的肽都可能充當(dāng)一個(gè)T細(xì)胞表位。誘導(dǎo)體外或體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答的前提是存在具有相應(yīng)TCR的T細(xì)胞并且不存在對(duì)該特定表位的免疫耐受性。因此，TAA是研發(fā)腫瘤疫苗的起點(diǎn)。識(shí)別和表征TAA的方法基于可從患者或健康受試者分離出來(lái)的CTL的使用情況，或基于腫瘤與正常組織肽之間差別轉(zhuǎn)錄特性或差別表達(dá)模式的產(chǎn)生。然而，對(duì)腫瘤組織或人腫瘤細(xì)胞株中過(guò)量表達(dá)或選擇性表達(dá)的基因的識(shí)別并不提供在免疫療法中使用這些基因所轉(zhuǎn)錄抗原的準(zhǔn)確信息。這是因?yàn)?，有著相?yīng)TCR的T細(xì)胞必須要存在而且對(duì)這個(gè)特定表位的免疫耐受性必須不存在或?yàn)樽畹退?，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應(yīng)用。因此，只選擇那些蛋白過(guò)量表達(dá)或選擇性表達(dá)的肽，并且這些肽是與可找到對(duì)抗性功能性T細(xì)胞的MHC分子結(jié)合在一起被提呈，這一點(diǎn)非常重要。這種功能性T細(xì)胞被定義為在以特異性抗原刺激后能夠克隆地?cái)U(kuò)展并能夠執(zhí)行效應(yīng)子功能的T細(xì)胞(「效應(yīng)子T細(xì)胞」)。輔助T細(xì)胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應(yīng)子功能中發(fā)揮著重要作用。觸發(fā)Tm細(xì)胞應(yīng)答的輔助T細(xì)胞表位支援CD8陽(yáng)性殺傷T細(xì)胞的效應(yīng)子功能，其中包括直接作用于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能(該類(lèi)腫瘤細(xì)胞表面顯示有腫瘤相關(guān)肽/MHC復(fù)合體)。這樣，單獨(dú)形式的或與其他腫瘤相關(guān)肽形成組合物的腫瘤相關(guān)T輔助細(xì)胞肽表位可作為刺激抗腫瘤免 疫應(yīng)答疫苗組合物的活性藥物成分。


圖I :證實(shí)CDC2-001提呈于原發(fā)性腫瘤樣本GC2464的代表性質(zhì)譜。NanoESI-LCMS在從GC樣本2464中洗脫所得的肽庫(kù)上進(jìn)行。質(zhì)量色譜m/z597. 3501±0. OOlDa、z=2顯示肽在保留時(shí)間151. 63分鐘時(shí)達(dá)到峰值。B)質(zhì)量色譜中在151. 63分鐘時(shí)檢測(cè)到峰值顯示，信號(hào)在MS譜中為m/z 597.3501。C) nanoESI_LCMS實(shí)驗(yàn)中指定保留時(shí)間時(shí)所記錄的選定前體的碰撞誘導(dǎo)衰變質(zhì)譜為m/z597. 3501，證實(shí)了 GC2464腫瘤樣本中提呈CDC2-001。D)合成CDC2-001參考肽的破碎模式進(jìn)行了記錄，并且與C所示的自然TUMAP破碎模式以驗(yàn)證序列。圖2 :選定蛋白的mRNA在正常組織和25份胃癌樣本中的表達(dá)譜a)CDC2(Probeset ID:203213_at)b)ASPM(Probeset ID:219918_s_at)圖3 :I類(lèi)TUMAP肽特異性體外免疫原性的典型結(jié)果。CD8+T細(xì)胞用分別載有相關(guān)(左圖)和不相關(guān)肽(右圖)的人工抗原提呈細(xì)胞引入。經(jīng)過(guò)3個(gè)周期的刺激后，用相關(guān)和不相關(guān)的A*2402-多聚體二重染色法對(duì)肽反應(yīng)性細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。所示細(xì)胞在活CD8+淋巴細(xì)胞上得到門(mén)控，圖中數(shù)字代表多聚體陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。
具體實(shí)施例方式除非另有說(shuō)明，否則本文使用的所有術(shù)語(yǔ)定義如下。本文所用「肽」這一術(shù)語(yǔ)，系指一系列氨基酸殘基，通常以α-氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團(tuán)之間的肽鍵相互連接。這些肽的長(zhǎng)度優(yōu)選為9個(gè)氨基酸，但至短可為8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，最長(zhǎng)可為10、11、12、13或14個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。本文使用的術(shù)語(yǔ)「寡肽」是指一系列氨基酸殘基，通常以α -氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團(tuán)之間的肽鍵相互連接。寡肽的長(zhǎng)度對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不十分關(guān)鍵，只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常，寡肽長(zhǎng)度約小于30個(gè)氨基酸殘基，約長(zhǎng)于14個(gè)氨基酸。
「多肽」這一術(shù)語(yǔ)是指一系列氨基酸殘基，通常以α -氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團(tuán)之間的肽鍵相互連接。多肽的長(zhǎng)度對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不十分關(guān)鍵，只要保持正確的表位即可。與術(shù)語(yǔ)肽或寡肽相對(duì)，「多肽」這一術(shù)語(yǔ)是指包含多于約30個(gè)氨基酸殘基的分子。一種肽、寡肽、蛋白質(zhì)或編碼該分子的核苷酸如果能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，則具有「免疫原性」(因此是本發(fā)明中的一種「免疫原」)。在本發(fā)明的場(chǎng)合，免疫原性的更具體定義是誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的能力。因此，「免疫原」是一種能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子，并且在本發(fā)明的情況下，是一種能誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的分子。T細(xì)胞「表位」要求的是一種結(jié)合至MHC I類(lèi)受體上的短肽，從而形成一種三元復(fù)合體(MHC I類(lèi)α鏈、β-2-微球蛋白和肽)，其可由載有以相應(yīng)親和力結(jié)合至MHC/肽復(fù)合體的匹配T細(xì)胞受體的一種T細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。結(jié)合至MHC I類(lèi)分子的肽的典型長(zhǎng)度為8-14個(gè)氨基酸，最典型為9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
在人類(lèi)中，有三種編碼MHC I類(lèi)分子的不同基因位點(diǎn)(人MHC分子也是指定的人白細(xì)胞抗原(HLA) ) HLA-A, HLA-B 和 HLA-C。HLA_A*01、HLA_A*02 和 HLA_A*024 是可從這些基因位點(diǎn)表達(dá)的不同MHC I類(lèi)等位基因的實(shí)例。表I :HLA-A*024和最常見(jiàn)HLA*A02402血清類(lèi)型的表達(dá)頻率F。頻率根據(jù)Mori等人(Mori et al. 1017-27)使用的 Hardy-Weinberg 公式 F=I-(I-Gf) 2 改編,從美國(guó)人群范圍內(nèi)的單體型頻率中推導(dǎo)出。有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱Chanock等人的文獻(xiàn)(Chanock etal. 1211-23)。全球血清型HLA*24和A*2402的表達(dá)頻率等位基園人群根*等位*因頻率算得的顯型
A*24菲律賓人65%
A*24俄穸斯iM況茨人61%
A#2402H 本人59%
A*24馬來(lái)兩亞人58%
A*2402革律賓人54%
A*24印度人47%Α*24韓 I.Kl 人40%
Α*24斯1Ht 卡人37%
Α*24屮 W 人32%
Α*2402[丨度人29%
A*24澳人.利#.西部人22%
A *24劃1=:| 人22%
A*24俄羅斯薩4拉人20%
Α*24痛) 人20%
Α*24 歐洲人W%本文提到的DNA序列既包括單鏈DNA也包括雙鏈DNA。因此，除非本文另有所指，否則具體的序列是該序列的單鏈DNA、該序列與其互補(bǔ)序列的雙工(雙鏈DNA)以及該序列的互補(bǔ)序列。「編碼區(qū)」這一術(shù)語(yǔ)是指在基因的天然基因組環(huán)境中天然或正常編碼該基因的表達(dá)產(chǎn)物的那部分基因，即，體內(nèi)編碼該基因的天然表達(dá)產(chǎn)物的區(qū)域。編碼區(qū)可來(lái)自非突變(「正常」)基因、突變基因或異常基因，甚至還可以來(lái)自DNA序列，完全可在實(shí)驗(yàn)室中使用本領(lǐng)域熟知的DNA合成方法合成。術(shù)語(yǔ)「核苷酸序列」系指脫氧核苷酸的雜聚物。編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列，也可為合成核苷酸序列。一般來(lái)說(shuō)，編碼肽、多肽以及本發(fā)明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸銜接物，或一系列寡核苷酸組成，以提供一種合成基因，該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調(diào)節(jié)元素的重組轉(zhuǎn)錄單元中被表達(dá)?！副磉_(dá)產(chǎn)物」這一術(shù)語(yǔ)是指多肽或蛋白，它是基因和遺傳碼退化并因而編碼同樣的氨基酸所造成的任何核酸序列編碼同等物的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物?！钙瑪唷惯@一術(shù)語(yǔ)，當(dāng)指的是一種編碼序列時(shí)，表示包含非完整編碼區(qū)的DNA的一部分，其表達(dá)產(chǎn)物與完整編碼區(qū)表達(dá)產(chǎn)物基本上具有相同的生物學(xué)功能或活性。「DNA片段」這一術(shù)語(yǔ)是指一種DNA聚合物，以單獨(dú)的片段形式或一種較大DNA結(jié)構(gòu)的組分形式存在，它們從至少分離過(guò)一次的DNA中以基本純凈的形式獲得，即不含污染性內(nèi)源性材料，并且獲得的數(shù)量或濃度能夠使用標(biāo)準(zhǔn)生化方法，例如使用克隆載體，進(jìn)行識(shí)另|J、操縱和回收該片段及其組分核苷酸序列。此等片段以開(kāi)放閱讀框架(未被內(nèi)部未轉(zhuǎn)譯序列打斷)或內(nèi)含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未轉(zhuǎn)譯DNA序列可能存在于開(kāi)放閱讀框架的下游，在那里其不會(huì)干預(yù)編碼區(qū)的操縱或表達(dá)。「引物」這一術(shù)語(yǔ)表示一種短核酸序列，其可與一個(gè)DNA鏈配對(duì)，并在DNA聚合酶開(kāi)始合成脫氧核糖核酸鏈之處提供一個(gè)游離的3' -OH末端。「啟動(dòng)子」這一術(shù)語(yǔ)表示參與RNA聚合酶的結(jié)合從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。術(shù)語(yǔ)「分離」表示一種物質(zhì)從其原來(lái)的環(huán)境(例如，如果是天然發(fā)生的則是天然環(huán)境)中被移走。例如，活體動(dòng)物中的天然核苷酸或多肽不是分離的，但是，從天然系統(tǒng)中一些或所有共存物質(zhì)中分離出來(lái)的核苷酸或多肽是分離的。此類(lèi)多核苷酸可能是載體的一部分和/或此類(lèi)多核苷酸和多肽可能是一種組合物的一部分，并且由于該載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，因此它仍然是分離的。
本發(fā)明中披露的多核苷酸和重組或免疫原性多肽也可能以「純化」的形式存在。術(shù)語(yǔ)「純化」并非要求絕對(duì)的純度；它只是一個(gè)相對(duì)的定義，可以包括高度純化或部分純化的制劑，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員能理解這些術(shù)語(yǔ)。例如，各個(gè)從已用傳統(tǒng)方法純化為具有電泳同質(zhì)性的cDNA庫(kù)中分離出的各種克隆物。明確考慮到將起始材料或天然物質(zhì)純化至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，優(yōu)選為兩或三個(gè)數(shù)量級(jí)，更優(yōu)選為四或五個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，明確考慮到所述多肽的純度優(yōu)選為99. 999%，或至少為99. 99%或99. 9% ;更適宜者為以重量計(jì)99%或更高。根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的核酸和多肽表達(dá)產(chǎn)物，以及包含此類(lèi)核酸和/或多肽的表達(dá)載體可能以「濃縮的形式」存在。本文使用的術(shù)語(yǔ)「濃縮」是指材料的濃度至少是其自然濃度的大約2、5、10、100或1000倍，有優(yōu)勢(shì)的是，按重量計(jì)為O. 01%，優(yōu)選為至少O. 1%。也考慮了按重量計(jì)約為O. 5%、1%、5%、10%和20%的濃縮制劑。序列、構(gòu)型、載體、克隆物以及包含本發(fā)明的其他材料可有優(yōu)勢(shì)地以濃縮或分離的形式存在?！富钚云巍惯@一術(shù)語(yǔ)是指產(chǎn)生免疫應(yīng)答的片段(即具有免疫原性活性)，不論是單獨(dú)或可選地與合適的佐劑一起給予一種動(dòng)物，比如哺乳動(dòng)物，例如兔子或小鼠，也包括人；這種免疫應(yīng)答采用的形式是在接受動(dòng)物(如人)體內(nèi)刺激T細(xì)胞應(yīng)答。或者，「活性片段」也可用于誘導(dǎo)體外T細(xì)胞應(yīng)答。本文使用的「部分」(portion)、「節(jié)段」(segment)、「片段」(fragment)這幾個(gè)術(shù)語(yǔ)，當(dāng)與多肽相關(guān)地使用時(shí)是指殘基的連續(xù)序列，比如氨基酸殘基，其序列形成一個(gè)較大序列的子集。例如，如果一個(gè)多肽以任一種肽鏈內(nèi)切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)進(jìn)行處理，則該處理獲得的寡肽會(huì)代表起始多肽的部分、節(jié)段或片段。這表示，任何此類(lèi)片段必定包含與SEQ ID NO: I至33序列基本相同(如果不是完全相同)的一個(gè)節(jié)段、片段或部分作為其氨基酸序列的一部分，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: I至33的天然蛋白或「親本」蛋白。當(dāng)與多核苷酸相關(guān)地使用時(shí)，這些術(shù)語(yǔ)系指用任何共同核酸內(nèi)切酶處理所述多核苷酸產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)「百分等同度」或「百分等同性」，如果指的是序列，則表示在待對(duì)比序列(「被對(duì)比序列」)與所述序列或權(quán)利要求的序列(「參考序列」)對(duì)準(zhǔn)之后將被對(duì)比序列與所述序列或權(quán)利要求的序列進(jìn)行比較。然后根據(jù)下列公式計(jì)算百分等同度百分等同度=100[I-(C/R)]其中C是參考序列與被對(duì)比序列之間對(duì)準(zhǔn)長(zhǎng)度上參考序列與被對(duì)比序列之間的
差異數(shù)量，其中
(i)參考序列中每個(gè)鹼基或氨基酸序列在被對(duì)比序列中沒(méi)有對(duì)應(yīng)的對(duì)準(zhǔn)鹼基或氨
基酸；(ii)參考序列中每個(gè)空隙，以及(iii)參考序列中每個(gè)對(duì)準(zhǔn)鹼基或氨基酸與被比對(duì)比序列中對(duì)準(zhǔn)鹼基或氨基酸不同，即構(gòu)成一個(gè)差異；并且R是參考序列與被對(duì)比序列對(duì)準(zhǔn)長(zhǎng)度上在參考序列中產(chǎn)生任何空隙也計(jì)算為一個(gè)鹼基或氨基酸的參考序列中的鹼基或氨基酸數(shù)目。如果「被對(duì)比序列」和「參考序列」之間存在的一個(gè)對(duì)準(zhǔn)按上述計(jì)算的百分等同度大致等于或大于指定的最低百分等同度，則被對(duì)比序列與參考序列具有指定的最低百分等同度，雖然可能存在按本文上述計(jì)算的百分等同度低于指定百分等同度的對(duì)準(zhǔn)。如果沒(méi)有另外說(shuō)明，那么本文公開(kāi)的原始肽可以透過(guò)在肽鏈內(nèi)的不同(可能為選擇性)位點(diǎn)上取代一個(gè)或多個(gè)殘基而被修飾。此取代可能是保守性的，例如，其中一個(gè)氨基 酸被具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)的另一個(gè)氨基酸所取代，比如其中一個(gè)疏水性氨基酸被另一個(gè)疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類(lèi)似的大小和化學(xué)性質(zhì)的氨基酸間的取代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質(zhì)家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現(xiàn)出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關(guān)，這是確定「保守取代」的基礎(chǔ)。在本文中，保守取代定義為在以下五種基團(tuán)之一的內(nèi)部進(jìn)行交換基團(tuán)I-小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(Ala，Ser, Thr, Pro, Gly);基團(tuán)2-極性、帶負(fù)電荷的殘基及其酰胺(Asp, Asn, Glu, Gln);基團(tuán)3-極性、帶正電荷的殘基(His, Arg, Lys);基團(tuán)4-大脂肪族非極性殘基(Met, Leu, He, Val, Cys)以及基團(tuán)5_大芳香殘基(Phe, Tyr, Trp)。較不保守的取代可能涉及一個(gè)氨基酸被另一個(gè)具有類(lèi)似特點(diǎn)但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。高度不保守的取代可能涉及一個(gè)酸性氨基酸被另一個(gè)具有極性或甚至具有堿性性質(zhì)的氨基酸所取代。然而，這種「激進(jìn)」取代不能認(rèn)為是無(wú)效的而不予考慮，因?yàn)榛瘜W(xué)作用是不完全可預(yù)測(cè)的，激進(jìn)的取代可能會(huì)帶來(lái)其簡(jiǎn)單化學(xué)原理中無(wú)法預(yù)見(jiàn)的偶然效果。當(dāng)然，這種取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他結(jié)構(gòu)。因此，D-氨基酸可能被本發(fā)明的抗原肽中常見(jiàn)的L-氨基酸取代，也仍在本公開(kāi)的范圍之內(nèi)。此外，具有非標(biāo)準(zhǔn)R基團(tuán)的氨基酸(即，除了天然蛋白的20個(gè)常見(jiàn)氨基酸之外的R基團(tuán))也可以用于取代之目的，以生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的免疫原和免疫原性多肽。如果在一個(gè)以上位置上的取代發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定義值，則對(duì)這些取代的組合進(jìn)行測(cè)試，以確定組合的取代是否產(chǎn)生對(duì)肽抗原性的疊加或協(xié)同效應(yīng)。肽內(nèi)被同時(shí)取代的位置最多不能超過(guò)4個(gè)。術(shù)語(yǔ)「T細(xì)胞應(yīng)答」是指由一種肽在體外或體內(nèi)誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能的特異性擴(kuò)散和啟動(dòng)。對(duì)于MHC I類(lèi)限制性CTL，效應(yīng)子功能可能為溶解肽脈沖的、肽前體脈沖的或天然肽提呈的靶細(xì)胞、分泌細(xì)胞因子，優(yōu)選為肽誘導(dǎo)的干擾素- Y、TNF-α或IL-2，分泌效應(yīng)分子、優(yōu)選為肽或脫顆粒作用誘導(dǎo)的顆粒酶或穿孔素。優(yōu)選情況是，當(dāng)SEQ ID NO: I至33任何序列的肽特異性CTL相比于取代肽受到檢測(cè)時(shí)，如果取代肽在相對(duì)于背景肽溶解度增加達(dá)到最大值的一半，則該肽濃度不超過(guò)約ImM，優(yōu)選為不超過(guò)約I μ M,更優(yōu)選為不超過(guò)約InM,再優(yōu)選為不超過(guò)約IOOpM,最優(yōu)選為不超過(guò)約ΙΟρΜ。另一個(gè)優(yōu)選的情形為，取代肽被一個(gè)以上的CTL識(shí)別，最少為2個(gè)，更優(yōu)選為3個(gè)。因此，本發(fā)明所述的表位可能與天然腫瘤相關(guān)表位或腫瘤特異性表位相同，也可能包括來(lái)自參考肽的不超過(guò)4個(gè)殘基的不同肽，只要它們有基本相同的抗原活性即可。免疫治療方法是否能刺激免疫應(yīng)答取決于是否存在被宿主免疫系統(tǒng)視為異物的抗原。發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原的存在增加了運(yùn)用宿主免疫系統(tǒng)干預(yù)腫瘤生長(zhǎng)的可能性。對(duì)于癌癥免疫療法，目前正在探索控制免疫系統(tǒng)中的體液和細(xì)胞免疫的各種機(jī)制。細(xì)胞免疫應(yīng)答的特定元素能特異性地識(shí)別和破壞腫瘤細(xì)胞。從腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞群或外周血中分離出的細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(CTL)表明，這些細(xì)胞在癌癥的天然免疫防御中發(fā)揮了重要作用。特別是⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞在這種反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，它能識(shí)別通常8至12個(gè)源自蛋白或位于細(xì)胞質(zhì)的缺損核糖體產(chǎn)物(DRIP)的氨基酸殘基的主要組織兼容性復(fù)合體 (MHC)所帶有的肽中所含的I類(lèi)分子。人MHC分子也稱(chēng)為人白細(xì)胞-抗原(HLA)。MHC-I類(lèi)分子，在細(xì)胞核提呈因主要內(nèi)源性、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核蛋白質(zhì)、DRIPS和較大肽蛋白裂解產(chǎn)生的肽的細(xì)胞上都能發(fā)現(xiàn)此類(lèi)分子。然而，源自內(nèi)體結(jié)構(gòu)或外源性來(lái)源的肽也經(jīng)常在MHC-I類(lèi)分子上發(fā)現(xiàn)。這種I-類(lèi)分子非經(jīng)典提呈方式在文獻(xiàn)中被稱(chēng)為交叉提
Mo對(duì)于被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別為腫瘤特異性抗原或相關(guān)性抗原以及用于治療的蛋白質(zhì)，必須具備特殊的先決條件。該抗原應(yīng)主要由腫瘤細(xì)胞表達(dá)，而正常健康組織根本不表達(dá)或表達(dá)數(shù)量較少。更為適宜的情況是，該相應(yīng)抗原不僅出現(xiàn)于一種腫瘤中，而且濃度(即每個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)肽拷貝數(shù)目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原通常是源于由于細(xì)胞周期調(diào)控或凋亡等功能在正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞中直接涉及的蛋白。另外，這些直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的蛋白的下游靶標(biāo)也可能會(huì)被上調(diào)，因此間接與腫瘤相關(guān)。這些間接腫瘤相關(guān)抗原也可能是預(yù)防接種方法的靶標(biāo)。至關(guān)重要的是，在這兩種情況中，都存在抗原氨基酸序列的表位，所以這種來(lái)自腫瘤相關(guān)抗原的肽(「免疫原性肽」)可導(dǎo)致體外或體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答?；旧?，任何能與MHC分子結(jié)合的肽都可能充當(dāng)一個(gè)T細(xì)胞表位。誘導(dǎo)體外或體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答的前提是存在具有相應(yīng)TCR的T細(xì)胞并且不存在對(duì)該特定表位的免疫耐受性。因此，TAA是研發(fā)腫瘤疫苗的起點(diǎn)。識(shí)別和表征TAA的方法基于對(duì)患者或健康受試者CTL的使用情況，或基于腫瘤與正常組織肽之間差別轉(zhuǎn)錄特性或差別表達(dá)模式的產(chǎn)生(Lemmel et al. 450-54;Weinschenk et al. 5818-27)。然而，對(duì)腫瘤組織或人腫瘤細(xì)胞株中過(guò)量表達(dá)或選擇性表達(dá)的基因的識(shí)別并不提供在免疫療法中使用這些基因所轉(zhuǎn)錄抗原的準(zhǔn)確信息。這是因?yàn)?，有著相?yīng)TCR的T細(xì)胞必須存在且對(duì)這個(gè)特定表位的免疫耐受性必須不存在或?yàn)樽畹退?，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應(yīng)用。因此，只選擇那些蛋白過(guò)量表達(dá)或選擇性表達(dá)的肽，并且這些肽是與可找到對(duì)抗性功能性T細(xì)胞的MHC分子結(jié)合在一起被提呈，這一點(diǎn)非常重要。這種功能性T細(xì)胞被定義為在以特異性抗原刺激后能夠克隆地?cái)U(kuò)展并能夠執(zhí)行效應(yīng)子功能的T細(xì)胞(「效應(yīng)子T細(xì)胞」)。 輔助T細(xì)胞在安排抗腫瘤免疫的CTL效應(yīng)子功能中發(fā)揮著重要作用。觸發(fā)Tm細(xì)胞應(yīng)答的輔助T細(xì)胞表位支援CD8陽(yáng)性殺傷T細(xì)胞的效應(yīng)子功能，其中包括直接作用于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能(該類(lèi)腫瘤細(xì)胞表面顯示有腫瘤相關(guān)肽/MHC復(fù)合體)。這樣，腫瘤相關(guān)T輔助細(xì)胞表位單獨(dú)使用或與其他腫瘤相關(guān)肽結(jié)合使用可作為刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答的疫苗化合物的活性藥物成分。由于⑶8及⑶4依賴(lài)型反應(yīng)共同和協(xié)同促進(jìn)抗腫瘤作用，因此，⑶8陽(yáng)性CTL(MHC-I分子)或⑶4陽(yáng)性CTL (MHC-II類(lèi)分子)對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的識(shí)別和鑒定對(duì)研發(fā)腫瘤疫苗非常重要。因此，提出含有與任一類(lèi)MHC復(fù)合體結(jié)合的肽組合物是本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)?？紤]到治療癌癥相關(guān)的嚴(yán)重副作用和費(fèi)用，迫切需要更好的預(yù)后和診斷方法。因此，通常有必要確定代表癌癥生物標(biāo)志物的其他因子，尤其是胃癌。此外，通常有必要確定可用于治療癌癥的因子，尤其是胃癌。此外，還沒(méi)有確定的治療設(shè)計(jì)，可用于根治性攝護(hù)腺切除術(shù)后生化性復(fù)發(fā)的胃癌患者，復(fù)發(fā)通常是由原發(fā)部位殘留的腫瘤出現(xiàn)局部晚期腫瘤生長(zhǎng)所致。需要能夠降低發(fā)病率且療效與現(xiàn)有治療方法相當(dāng)?shù)男滦椭委煼椒ā?
本發(fā)明提出了有利于治療胃癌以及其他過(guò)量表達(dá)本發(fā)明肽的腫瘤肽。這些肽由質(zhì)譜分析法直接顯示出，而由HLA分子自然提呈于人原發(fā)性胃癌樣本中(請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例I和圖I)。衍生肽源基因在胃癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、腺癌、攝護(hù)腺癌、良性腫瘤和惡性黑色素瘤中與正常組織相比顯示出高度過(guò)量表達(dá)(請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例2和圖2)，這表明這些肽與腫瘤關(guān)聯(lián)程度高，即這些肽大量提呈于腫瘤組織，而不提呈于正常組織。HLA結(jié)合肽能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別，特別是被T淋巴細(xì)胞/T細(xì)胞識(shí)別。T細(xì)胞可破壞提呈被識(shí)別的HLA/肽復(fù)合體的細(xì)胞(如提呈衍生肽的胃癌細(xì)胞)。本發(fā)明的所有與確認(rèn)平臺(tái)兼容的肽(見(jiàn)實(shí)例3)已被證明具有刺激T細(xì)胞應(yīng)答的能力(參見(jiàn)實(shí)例3和圖3)。因此，該等肽可用于在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而能夠殺死腫瘤細(xì)胞?；颊叩拿庖邞?yīng)答能夠透過(guò)直接給予患者所述肽或前體物質(zhì)(如，加長(zhǎng)肽、蛋白或編碼這些肽的核酸)，較理想是與加強(qiáng)免疫原性的制劑相結(jié)合，而進(jìn)行誘導(dǎo)。源自該治療性疫苗的免疫應(yīng)答預(yù)期能夠高度特異性地對(duì)抗腫瘤細(xì)胞，因?yàn)楸景l(fā)明的目標(biāo)肽在正常組織上提呈的復(fù)制數(shù)目較少，防止患者發(fā)生對(duì)抗正常細(xì)胞的不良自體免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。藥物組合物包括游離形式或以一種藥用鹽形式存在的肽。此處使用的「藥用鹽」系指所公開(kāi)的肽的一種衍生物，其中該肽由制被備藥劑酸式或堿式鹽進(jìn)行改性。例如，酸式鹽采用自由基(通常其中藥物的中性形式具有一種中性-NH2基團(tuán))透過(guò)與合適酸發(fā)生反應(yīng)而制得。適合制備酸鹽的酸包括有機(jī)酸，如乙酸、丙酸、羥基酸、丙酮酸、草酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、丁二酸、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水楊酸等等、以及無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一種肽上提呈的酸性基團(tuán)的堿式鹽制劑使用藥用鹼基進(jìn)行制備，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等等。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，藥物組合物包括乙酸(醋酸鹽)或鹽酸(氯化物)形式的肽。本發(fā)明的肽除了用于治療癌癥，也可用于診斷。由于肽由胃癌細(xì)胞產(chǎn)生，并且已確定這些肽在正常組織中不存在，因此這些肽可用于診斷癌癥是否存在。組織切片中含專(zhuān)利申請(qǐng)范圍的肽，可有助于病理師診斷癌癥。用抗體、質(zhì)譜或其他本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法檢測(cè)某些肽可使病理師判斷該組織為惡性的、炎癥還是一般病變。肽基團(tuán)的存在使得能對(duì)病變組織進(jìn)行分類(lèi)或進(jìn)一步分成子類(lèi)。對(duì)病變標(biāo)本中肽的檢測(cè)使得能對(duì)免疫系統(tǒng)治療方法的利益進(jìn)行判斷，特別是如果T-淋巴細(xì)胞已知或預(yù)計(jì)與作用機(jī)制有關(guān)。MHC表達(dá)的缺失是一種機(jī)制，充分說(shuō)明了哪些受感染的惡性細(xì)胞逃避了免疫監(jiān)視。因此，肽的存在表明，分析過(guò)的細(xì)胞并沒(méi)有利用這種機(jī)制。肽可用于分析淋巴細(xì)胞對(duì)肽的反應(yīng)(如T細(xì)胞應(yīng)答)，或抗體對(duì)肽或MHC分子絡(luò)合的肽發(fā)生的反應(yīng)。這些淋巴細(xì)胞應(yīng)答可以作為預(yù)后指標(biāo)，決定是否采取進(jìn)一步的治療措施。這些反應(yīng)也可以用作免疫療法中的替代指標(biāo)，旨在以不同方式誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞應(yīng)答，如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移?；蛑委熤?，淋巴細(xì)胞對(duì)肽發(fā)生的反應(yīng)可以在副作用的評(píng)估中考慮。淋巴細(xì)胞應(yīng)答監(jiān)測(cè)也可能成為移植療法隨訪檢查中的一種有價(jià)值的工具，如，用于檢測(cè)移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
肽可用于生成和研發(fā)出針對(duì)MHC/肽復(fù)合體的特定抗體。這些抗體可用于治療，將毒素或放射性物質(zhì)靶向病變組織。這些抗體的另一用途是為了成像之目的(如PET)將放射性核素靶向病變組織。這可有助于檢測(cè)小轉(zhuǎn)移灶或確定病變組織的大小和準(zhǔn)確位置。此外，可用它們?cè)诨顧z樣本的基礎(chǔ)上驗(yàn)證病理師對(duì)癌癥的診斷。表2顯示了根據(jù)本發(fā)明的肽、它們各自的SEQ ID NO、以及可能產(chǎn)生這些肽的源蛋白。所有肽均與HLA A*024等位基因結(jié)合。表2:本發(fā)明中的肽
權(quán)利要求
1.一種肽，其包括選自SEQ ID No. I至SEQ ID No. 95群組的一個(gè)序列、或與SEQ IDNo. I至SEQ ID No. 95具有80%，優(yōu)選具有90%，更優(yōu)選具有95%的同源性的其變體、或誘導(dǎo)與該肽發(fā)生T細(xì)胞交叉反應(yīng)的一個(gè)變體，其中所述肽不是一種全長(zhǎng)多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肽，其中該肽總長(zhǎng)度為8至100個(gè)氨基酸、優(yōu)選為8至30個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為8至14個(gè)氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I至2中任一項(xiàng)所述的肽，其具有與主要組織兼容性復(fù)合體(MHC)I或II類(lèi)分子結(jié)合的能力。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的肽，其中該肽系由或基本系由根據(jù)SEQID NOI至SEQ ID NO 95所選的氨基酸序列組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的肽，其中該肽被修飾和/或包含非肽鍵。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的肽，其中該肽為融合蛋白，特別是含HLA-DR抗原相關(guān)不變鏈(Ii)的N-端氨基酸。
7.—種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的肽，如果該肽不是完全人蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸，其可能為DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA，也可能為其組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的一種能表達(dá)核酸的表達(dá)載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的一種肽、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的一種核酸、或根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種表達(dá)載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的一種宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種表達(dá)載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述為一種抗原提呈細(xì)胞的宿主細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其中抗原提呈細(xì)胞為樹(shù)突狀細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的一種制備肽的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求11所述的培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)基中分離出肽。
15.一種體外制備啟動(dòng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的方法，該方法包括將CTL與載有抗原的人I或II類(lèi)MHC分子進(jìn)行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細(xì)胞表面表達(dá)足夠的一段時(shí)間從而以抗原特異性方式啟動(dòng)CTL，其中所述抗原為根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中抗原透過(guò)與足夠量的含抗原提成細(xì)胞的抗原結(jié)合被載入表達(dá)于合適抗原提呈細(xì)胞表面的I或II類(lèi)MHC分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該抗原提呈細(xì)胞包括一個(gè)表達(dá)載體，該載體有能力表達(dá)含SEQ ID NO I至SEQ ID NO 95的肽或所述變體氨基酸序列。
18.權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的按其方法制成的啟動(dòng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，該淋巴細(xì)胞會(huì)有選擇性地識(shí)別一種細(xì)胞，該細(xì)胞異常表達(dá)含權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)給定氨基酸序列的多肽。
19.一種殺滅患者中祀向細(xì)胞的方法,其中祀向細(xì)胞異常表達(dá)一種多肽,該多肽含權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)給定的氨基酸序列；一種給藥方法，其中包括給予患者權(quán)利要求15定義的有效量細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。
20.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的一種肽的用途、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的一種核酸的用途、根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種表達(dá)載體的用途、根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)所述的一種細(xì)胞的用途、根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種作為藥劑或制造藥劑的啟動(dòng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中藥劑系指一種疫苗。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的用途，其中藥劑有抗癌活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途,其中所述癌細(xì)胞為胃癌細(xì)胞、胃腸癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞或腎癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于免疫治療方法的肽、核酸和細(xì)胞。特別是，本發(fā)明涉及癌癥的免疫療法。本發(fā)明還涉及單獨(dú)使用或與其他腫瘤相關(guān)肽(刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答疫苗復(fù)合物的活性藥物成分)聯(lián)合使用的腫瘤相關(guān)細(xì)胞毒性T輔助細(xì)胞(CTL)肽表位。本發(fā)明涉及95種新型肽序列及其變體，它們?cè)醋钥捎糜谝l(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的人腫瘤HLA-I類(lèi)分子。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102905721SQ201180014644
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者托尼·懷申克, 延斯·弗里切, 斯特芬·沃爾特, 彼得·萊維卓爾斯奇, 哈普利特·辛格 申請(qǐng)人:伊瑪提克斯生物技術(shù)有限公司