專利名稱：獲得生物活性的重組人g-csf的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高活性和純度形式的粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、特別是重組人G-CSF (rhG-CSF)的生產(chǎn)過程。其通過在環(huán)境溫度下在適當(dāng)?shù)难趸€原系統(tǒng)中將溶解的包含體中包含的G-CSF重折疊并在純化過程中使用至少一個(gè)反相(RP)色譜步驟而實(shí)現(xiàn)。
背景技術(shù)：
G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)是一種主要由單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞釋放的造血細(xì)胞因子，它刺激顆粒細(xì)胞譜系的前體細(xì)胞的增殖和分化，并激活功能成熟的中性粒細(xì)胞。由于所述特性，G-CSF已經(jīng)用于不同的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，像例如在化療或放療之后重建正常血細(xì)胞種群或刺激針對(duì)感染性病原體的免疫應(yīng)答。因此在臨床中，G-CSF主要用于抗腫瘤治療，特別是治療由于化療造成的中性粒細(xì)胞減少，并還用于骨髓移植和治療感染性疾病。 市場(chǎng)上可買到的第一種基于重組G-CSF的G-CSF制備物是Amgen生產(chǎn)和經(jīng)銷的商品名為N eupogen 的產(chǎn)品。天然存在形式的人G-CSF是分子量約20，000道爾頓并具有五個(gè)半胱氨酸殘基的糖蛋白。這些殘基中的四個(gè)形成兩個(gè)分子內(nèi)二硫橋，所述二硫橋?qū)τ诘鞍踪|(zhì)的活性具有必不可少的重要性。重組形式的G-CSF主要用于生產(chǎn)藥品，其可以例如借助于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO(中華倉鼠卵巢)細(xì)胞中或原核細(xì)胞如大腸桿菌(E. coli)中表達(dá)而獲得。當(dāng)重組蛋白質(zhì)在原核生物中表達(dá)時(shí)，所述蛋白質(zhì)往往以至少部分無活性的、不溶的聚集體(折射體，包含體IB)形式在寄主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。在這樣的蛋白質(zhì)能被使用之前，它們必須轉(zhuǎn)變成它們的活性形式。所述包含體的形成造成了在通過中速離心分離包含體之后，有必要借助合適的方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行增溶和復(fù)性以保持其活性構(gòu)型。由包含體獲得的重組蛋白質(zhì)的復(fù)性過程通常是已知的并記載于例如EP 0114506、WO 84/03711、US 4，530，787和EP 0241022中。另外，關(guān)于變性蛋白的增溶和復(fù)性的一般技術(shù)已經(jīng)記載于EP 0512097, EP 0364926, EP 0219874和WO 01/87925中并還可以獲自蛋白質(zhì)化學(xué)的科學(xué)文獻(xiàn)和權(quán)威著作。EP 0500108描述了使用還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)氧化還原系統(tǒng)激活來自包含體的無活性形式的人重組G-CSF并分析G-CSF在一定條件下的再活化動(dòng)力學(xué)的方法。然而沒有公開下游的純化過程。在EP 0719860中，將含有G-CSF的包含體用N-月桂酰肌氨酸(十二烷基肌氨酸鈉)增溶，隨后利用硫酸銅通過空氣-氧化來實(shí)現(xiàn)重折疊。這種方法的缺點(diǎn)是副反應(yīng)，例如，在氨基酸側(cè)鏈上形成超氧化物自由基。此外，所述重折疊過程是耗時(shí)的并且難以得到標(biāo)準(zhǔn)化的重折疊參數(shù)。最后，除去變性劑包含色譜步驟，這導(dǎo)致約20%的總蛋白收率損失。得到的G-CSF隨后通過陰離子交換色譜和陽離子交換色譜純化。EP 1630173和EP 1837346描述了使用還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)氧化還原系統(tǒng)從包含體獲得人重組G-CSF的方法，其中重折疊步驟在低溫下執(zhí)行半天以上。因此，在工業(yè)規(guī)模下，由于要冷卻大量的蛋白質(zhì)溶液達(dá)許多小時(shí)，這種過程是耗能因此也是耗成本的。由此產(chǎn)生的G-CSF隨后通過陽離子交換色譜純化。在W02007/009950中，將EP 1630173中所教示的G-CSF純化方法在色譜步驟方面進(jìn)行了進(jìn)一步的詳細(xì)說明，即陽離子交換色譜和疏水作用層析順序執(zhí)行，兩者之間沒有任何居間步驟。具體是，色譜純化步驟分別在疏水作用層析之前和之后，包含兩個(gè)陽離子交換色譜步驟的序列。然而，雖然提供治療級(jí)的純化G-CSF的手段和方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，但迄今為止從包含體獲得G-CSF的過程，特別是在商業(yè)規(guī)模下，通常是耗時(shí)、耗力和耗成本的。這種技術(shù)問題通過在權(quán)利要求書中作為特征的和下文描述的實(shí)施方式得以解決。另外，如下文所述，這些實(shí)施方式提供了 G-CSF構(gòu)象亞型的分離，因此提供了高度均質(zhì)的G-CSF制備物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了從產(chǎn)生G-CSF的重組細(xì)胞回收和純化粒細(xì)胞集落刺激因子 (rhG-CSF)的方法。所述方法包括對(duì)來自包含體的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行增溶，通過在適度溫度、優(yōu)選>10° C的重折疊緩沖液內(nèi)簡單稀釋所述增溶物而重折疊所述G-CSF分子，并通過色譜純化重折疊的G-CSF，其中至少一個(gè)色譜步驟包含反相(RP)色譜。這種方法通常的特征在于(a)用含有變性劑和還原劑的增溶緩沖液來增溶包含體中所含的G-CSF，(b)通過用含有還原型和氧化型谷胱甘肽的重折疊緩沖液在>10° C的溫度下稀釋增溶物來重折疊G-CSF ;和(C)通過至少一個(gè)優(yōu)選包含反相(RP)色譜的色譜步驟來純化重折疊的G-CSF。具體地說，在一方面，本發(fā)明基于在合適的氧化還原系統(tǒng)中在超過10° C的溫度下在小于半天內(nèi)進(jìn)行的重折疊過程，并且有利地是在室溫、即在20±2° C下在3至4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行的重折疊過程。在這些條件下除了可以實(shí)現(xiàn)G-CSF分子的有效和準(zhǔn)確的復(fù)性這一事實(shí)之外，還可以避免上文提到的現(xiàn)有技術(shù)中描述的現(xiàn)有方法的缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明的方法容易執(zhí)行、耗時(shí)較少并且不包括耗能的冷卻系統(tǒng)。此外，本發(fā)明的方法是基于意料之外的觀察結(jié)果在生產(chǎn)和回收G-CSF的過程中，形成了至少一種只有在60° C通過應(yīng)用分析型反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)才變得可見的G-CSF亞型；參見圖3，表明疏水性稍低于主要形式。這種另外的錯(cuò)誤折疊的G-CSF亞型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如下面所述被詳細(xì)研究和進(jìn)一步表征。這種另外的G-CSF亞型在整體制備物中的最大含量可以高達(dá)總G-CSF蛋白質(zhì)收率的7%。利用CD光譜學(xué)的詳細(xì)分析揭示，所述G-CSF亞型與主題G-CSF參照的不同之處在于α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量更高(所述亞型為66%，G-CSF參照為52%)。這種另外的亞型的一種特征性質(zhì)在于它與G-CSF參照標(biāo)準(zhǔn)和本發(fā)明的G-CSF制備物的主要部分相比疏水性較低，因此它可以被分離并進(jìn)而幾乎完全從所述制備物中排除出去。結(jié)果，在本發(fā)明方法內(nèi)加入RP色譜步驟、特別是RP-HPLC作為工藝步驟，產(chǎn)生了改善的、即高度純化的G-CSF制備物，其基本上不含這種亞型和其他產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)，即疏水性較低的G-CSF亞型含量保持在總G-CSF蛋白質(zhì)的低于1%。在這種情況下，RP色譜法有別于不是本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式的疏水作用層析(HIC)。因此，對(duì)于G-CSF的純化而言，RP和RP-HPLC迄今分別只用于分析目的；參見，例如，W02007/009950。所提到的色譜原理在行家當(dāng)中也是有明確區(qū)別的(參見，例如，Bioanalytik, F. Lottspeich, H.Zorbas (編著)，Heidelberg, Berlin, Germany, Spektrum Akad. Verlagl998)。例如，雖然HIC典型是水洗脫的，但RP是溶劑洗脫的，其中洗脫以向著溶劑例如乙腈或乙醇的更高濃度的梯度來完成。優(yōu)選，所述色譜步驟包括在適當(dāng)條件下的RP-高壓液相色譜(HPLC)，應(yīng)用在陽離子交換(CEX)色譜之后。在這種情況下，可以審慎地假定，在從包含體獲得G-CSF的現(xiàn)有技術(shù)的方法中，也形成了 G-CSF的亞型，但是迄今尚沒有檢出，因?yàn)樵诂F(xiàn)有技術(shù)中使用的分析型RP-HPLC的條件下，所述亞型不明顯。此外， 因?yàn)椴⒉恢来嬖谶@樣的G-CSF亞型，所以沒有尋找的理由。因此，對(duì)于G-CSF、尤其是在合適的例如上文參考的文件中描述的那些氧化還原系統(tǒng)中增溶/復(fù)性之后從包含體得到的G-CSF，在其純化過程中可以執(zhí)行本發(fā)明的方法，尤其分別是制備型RP色譜步驟和RP-HPLC步驟。此外，與在先的陽離子交換(CEX)色譜步驟相結(jié)合，這兩個(gè)色譜步驟足以將人重組G-CSF純化到足以用所生成的G-CSF作為藥物的等級(jí)。因此，雖然本發(fā)明的方法可以優(yōu)選如圖I中所概括的和實(shí)施例中所說明的那樣執(zhí)行，但是所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將認(rèn)識(shí)到，為了達(dá)到治療等級(jí)的G-CSFjAR CEX色譜和后續(xù)的RP-HPLC就足矣，而任何其他純化步驟可以被改變或全然省略?？傊?，提供了獲得生物活性的純的人重組G-CSF的方法，所述方法可以用最少的留有技術(shù)復(fù)雜性的制造過程步驟以及低水平的能源成本來實(shí)施，并且其中所生成的G-CSF制備物基本上類似于市場(chǎng)上可買到的參照產(chǎn)品并且沒有另外的G-CSF亞型。因此，與依照不應(yīng)用RP-HPLC色譜的現(xiàn)有技術(shù)方法得到的G-CSF制備物比較，依照本發(fā)明方法得到的G-CSF制備物在純度方面、即在它的G-CSF蛋白質(zhì)分子更均質(zhì)方面是有優(yōu)勢(shì)的。此外，由于本發(fā)明的G-CSF制備物的均質(zhì)性，可以審慎地預(yù)期本發(fā)明的G-CSF制備物的體內(nèi)活性即便沒有提高，也至少和迄今市場(chǎng)上可買到的重組G-CSF產(chǎn)品的類似。這也意味著除此以外的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)將和市場(chǎng)產(chǎn)品的類似。因此，依照本發(fā)明方法得到的G-CSF特別適合用于人類醫(yī)藥。另外，本發(fā)明的G-CSF制備物特別適于進(jìn)一步衍生化，因?yàn)檫@樣化學(xué)改性的產(chǎn)品保持了所述G-CSF制備物的高純度和均質(zhì)性。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括將依照所述方法得到的G-CSF進(jìn)行化學(xué)改性，例如將水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)與所述G-CSF共價(jià)連接。此外，鑒于以上考慮，本發(fā)明涉及重組G-CSF或其衍生物與可藥用添加劑例如緩沖液、鹽和穩(wěn)定劑的藥物組合物的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括在此公開并特別是在實(shí)施例中公開的獲得G-CSF的方法。優(yōu)選，將純化的生物活性的G-CSF或其衍生物、例如聚乙二醇化G-CSF，在pH 4. O的IOmM乙酸、O. 0025%聚山梨醇酯80和50g/l山梨糖醇中進(jìn)行配制。這樣得到的藥物組合物也是本發(fā)明的主題。


圖I :示出了本發(fā)明方法對(duì)G-CSF的分離和純化步驟的流程圖示意圖。如所示，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，從包含體純化和獲得生物活性的人G-CSF的過程包括以下步驟(a)發(fā)酵和收獲a.培養(yǎng)生產(chǎn)rhG-CSF的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞過表達(dá)rhG_CSF，而所述rhG-CSF以高密度蓄積在包含體中；b.分離包含體；c.通過使用變性緩沖液中的還原劑來增溶包含體，然后過濾；d.在單步驟稀釋過程中，通過提供重折疊緩沖液并將增溶混合物轉(zhuǎn)移到所述重折疊緩沖液中而實(shí)現(xiàn)重折疊，其中在不銹鋼罐中的弱堿性精氨酸-鹽酸鹽緩沖液中使用基于氧化型和還原型谷胱甘肽(GSH/GSSH)的氧化還原系統(tǒng)，并在超過10° C的溫度下溫育至少三小時(shí)以產(chǎn)生生物活性的可溶性rhG-CSF，然后過濾；(b)可溶性rhG-CSF的純化a.超濾和滲濾步驟以更換緩沖液、降低變性劑濃度和濃縮重折疊的G-CSF，其優(yōu)選通過使用MWCO IOkDa的孔徑進(jìn)行,然后過濾；
b.陽離子交換色譜以除去聚集的物質(zhì)以及宿主蛋白質(zhì)和DNA、更換緩沖液、和通過減少體積而濃縮G-CSF級(jí)分；c.微量過濾步驟以除去不溶性雜質(zhì)；d.在適宜條件和環(huán)境溫度下通過例如Jupiter C4執(zhí)行的RP-HPLC純化步驟，以除去疏水性較小的G-CSF亞型，其在G-CSF的主要級(jí)分之前洗脫；和除去G-CSF的氧化和還原衍生物；e.超濾和滲濾步驟(例如切向流過濾)以濃縮純化的G-CSF并將G-CSF調(diào)節(jié)成所需的制備物，優(yōu)選通過使用MWCO 5kDa的孔徑進(jìn)行，并然后過濾f.將純化的G-CSF儲(chǔ)存在優(yōu)選2-8° C下在說明書和實(shí)施例中對(duì)各個(gè)過程和純化步驟作進(jìn)一步解釋。圖2 :從包含體分離的純化rhG-CSF的Western印跡分析。純化的G-CSF蛋白質(zhì)通過4-20%Tris-甘氨酸SDS-PAGE分離并顯示印跡。Western印跡用一級(jí)抗G-CSF抗體溫育并使用二級(jí)報(bào)告抗體顯影。每加樣孔各加載O. Iyg蛋白質(zhì)。3、7、9和13是空白道；2、8和14是分子量標(biāo)記(Magic Mark XP) ;4_6是通過實(shí)施例中說明的方法得到的G-CSF ;10_12是作為參照的Neupogen 。如4-6道與10-12道相比所示，Newpogen 和G-CSF跑到大約ISkDa0結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明方法得到的G-CSF明顯沒有附加譜帶并可與Neupogeii 相比。圖3:在本發(fā)明方法的RP-HPLC制備型純化步驟之前或之后，分析型RP-HPLC對(duì)rhG-CSF制備物的分析。在重折疊并通過CEX色譜純化之后，在RP-HPLC制備型色譜純化步驟之前(A)或之后(B)獲取G-CSF樣品，并對(duì)其在60° C進(jìn)行分析型RP-HPLC分析以確定樣品的組成。G-CSF ★表示疏水性較小的G-CSF亞型，而G-CSF指示主要級(jí)分。注意，在(A)中，用在RP-HPLC純化步驟之前獲取的樣品，看得見在主要級(jí)分峰之前的附加峰(箭頭)。在(B)中，用在RP-HPLC純化步驟之后獲取的樣品，看得見主峰，而幾乎完全找不到對(duì)應(yīng)于(A)中由箭頭突出顯示的疏水性較小的G-CSF亞型的第二峰。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一般涉及與參照G-CSF相比具有最小量的疏水性較小的G-CSF亞型的，高度純化和均質(zhì)的G-CSF制備物的大規(guī)模的生產(chǎn)方法。更具體地，本發(fā)明涉及從生產(chǎn)G-CSF的重組細(xì)胞例如大腸桿菌獲得G-CSF的方法，所述方法包括對(duì)來自包含體的重組G-CSF蛋白質(zhì)進(jìn)行增溶，通過在環(huán)境溫度、優(yōu)選>10° C的重折疊緩沖液內(nèi)稀釋所述增溶物來重折疊所述G-CSF分子，和通過色譜純化所述重折疊的G-CSF，其中至少一個(gè)色譜步驟包括反相(RP)色譜。換言之，本發(fā)明的方法涉及從包含體獲得生物活性的人G-CSF的方法，所述方法包含以下步驟(a)用含有變性劑和還原劑的增溶緩沖液來增溶包含體中所含的G-CSF ；(b)通過用含有還原型和氧化型谷胱甘肽的重折疊緩沖液在>10° C的溫度下稀釋增溶物來重折疊G-CSF ;和(c)通過包含反相(RP)色譜的至少一個(gè)色譜步驟來純化重折疊的G-CSF。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“生物活性的人G-CSF”應(yīng)理解為表示一種G-CSF制備物，其已經(jīng)通過本發(fā)明的方法純化并能夠增強(qiáng)造血祖細(xì)胞的分化和增殖以及能夠激活造血系統(tǒng)的某些成熟細(xì)胞。因此，依靠本發(fā)明方法得到的G-CSF適合治療施用G-CSF有利的適應(yīng)癥。要理解，術(shù)語“生物活性的人G-CSF”還包括G-CSF的突變體和修飾體，它們的氨基酸序列與野 生型序列相比較發(fā)生了改變，但具有與野生型G-CSF類似的生物活性。這也適用于G-CSF結(jié)合物。典型地，所述G-CSF是人重組G-CSF。優(yōu)選，待純化的G-CSF是在大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生的人甲二磺?；?Met)G-CSF。術(shù)語“疏水性較小的亞型”在本文中使用時(shí)是指通過例如Edman降解法和等電聚焦(IEF)凝膠或通過質(zhì)譜所揭示的具有相同的質(zhì)量、等電點(diǎn)和包含二硫橋的同樣的肽圖的一種G-CSF制備物/級(jí)分。此外，通過質(zhì)譜均沒有檢出脂質(zhì)加合物或異天冬氨酸。疏水性較小的G-CSF亞型的特征在于，在⑶-光譜中，它與G-CSF參照相比，在近UV范圍(0D260-320nm)有差異，表明α -螺旋結(jié)構(gòu)的含量更高(所述亞型為66%，所述G-CSF參照為52%)。另外，主題G-CSF與其亞型的疏水性差異可以通過60° C時(shí)的分析型RP-HPLC證明。這些差異是在60° C施行的RP-HPLC色譜中，疏水性較小的亞型與G-CSF參照相比在較早的級(jí)分中被洗脫的原因所在。因此，本發(fā)明的G-CSF亞型可以依據(jù)它疏水性較小并且在60° C施行的RP-HPLC中在不同的級(jí)分中被洗脫的相異性質(zhì)來定義，其中所述G-CSF亞型在主題G-CSF的主峰之前被洗脫；參見圖3。表征樣品的技術(shù)包括SDS-PAGE、IEF、UVXD、熒光光譜學(xué)和NMR ;也參見上文和實(shí)施例。將所有信息合在一起，疏水性較小的G-CSF亞型可以被最好地解釋為三維結(jié)構(gòu)稍有改變的折疊變體，這種三維結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是一種錯(cuò)誤折疊的形式。除去它應(yīng)該使得藥品更有效和安全。如所提到的，本發(fā)明的G-CSF制備物基本不含疏水性較小的G-CSF亞型。術(shù)語“基本不含”疏水性較小的G-CSF亞型或“具有最小量”的疏水性較小的G-CSF亞型是指本發(fā)明的G-CSF制備物典型地含有小于5%的所述疏水性較小的G-CSF亞型，優(yōu)選小于1%、有利地是小于O. 2%的所述疏水性較小的G-CSF亞型。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“包含體”是指細(xì)胞內(nèi)來自不正確折疊或部分正確折疊的重組表達(dá)蛋白質(zhì)的不溶且緊湊的聚集體，其可以通過細(xì)胞裂解液的離心作為顆粒級(jí)分被分離。術(shù)語“增溶”在本文中使用時(shí)，是指形成包含體的G-CSF通過用變性劑、例如離液劑和還原劑處理，破壞天然蛋白質(zhì)中不存在的分子間和分子內(nèi)相互作用從而產(chǎn)生重組G-CSF的單體分散體后，變得溶解。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“變性劑”是指一種試劑，其能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)去折疊，由此導(dǎo)致天然蛋白質(zhì)構(gòu)象的減少或損失。用于增溶緩沖溶液的合適的離液劑或變性劑是尿素、鹽酸胍、精氨酸、硫氰酸鈉、PH極端物質(zhì)(稀釋的酸或堿)、去污劑(例如SDS、Sacr0Syl)、鹽(氯化物、硝酸鹽、硫氰酸鹽、三氯乙酸鹽)、化學(xué)衍生化(亞硫酸鹽解(sulfitolyse)，堿性條件下和朽1康酐(Citraconanhydrid)的反應(yīng))、溶劑(2-氨基-2-甲基-I-丙醇或醇類、DMSO、DMS)或強(qiáng)陰離子交換樹脂例如Q-Sepharose。尿素的適當(dāng)濃度是l_9mol/l，優(yōu)選5_9mol/l。鹽酸胍的適當(dāng)濃度是l_8mol/l，優(yōu)選4-8mol/l。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，變性劑是鹽酸胍，優(yōu)選其中鹽酸胍的濃度是
6.Omol/1 ;也參見實(shí)施例。典型地，本發(fā)明方法中的增溶緩沖液除了變性劑之外還含有還原劑。合適的還原劑是還原型谷胱甘肽(GSH)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、半胱氨酸、β -巰基乙醇。優(yōu)選，本發(fā)明方法中的還原劑是DTT。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，增溶緩沖液中的還原劑濃度是lmmol/1至100mmol/l,優(yōu)選lmmol/1至10mmol/l,并可以按照實(shí)施例進(jìn)行調(diào)整。根據(jù)本發(fā)明，增溶緩沖液的合適的緩沖組分可以是三(羥甲基)_氨基甲烷或磷酸鹽， 其應(yīng)該表現(xiàn)出堿性pH值，以允許二硫橋的還原。為了確保有效和完全的增溶，需要包含體與增溶緩沖液的適當(dāng)比率。根據(jù)本發(fā)明，使用每克包含體IOml至IOOml增溶緩沖液，優(yōu)選每克包含體Iml至80ml增溶緩沖液、最優(yōu)選Iml至40ml增溶緩沖液，更優(yōu)選>20ml/g且典型>30ml/g。此外，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，螯合劑例如乙二胺四乙酸鹽(EDTA)或二甲基氨基乙醇(DMAE)被加到所述增溶和/或重折疊緩沖液中，以絡(luò)合水溶液中的金屬離子。一旦與EDTA結(jié)合，這些金屬離子就傾向于不干擾去污劑的作用或不具有氧化還原劑的能力。另外，所述螯合劑抑制金屬依賴性蛋白酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，增溶緩沖液和/或重折疊緩沖液含有EDTA 二鈉，優(yōu)選以O(shè). 5至IOmM之間的濃度。根據(jù)本發(fā)明，為了確保有效和完全的增溶，本發(fā)明方法中的增溶時(shí)間是I至10小時(shí)、優(yōu)選4至8小時(shí)、最優(yōu)選6± I小時(shí)或5. 5至6. 5小時(shí)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，增溶過程在超過10° C、優(yōu)選15-30° C之間、最優(yōu)選20±2° C的環(huán)境溫度下執(zhí)行，即在與重折疊過程相同或相似的溫度下；參見上文和實(shí)施例。根據(jù)本發(fā)明，宿主細(xì)胞碎片應(yīng)該從增溶的G-CSF中消除，以確保沒有干擾物質(zhì)妨礙重折疊過程。因此，所述增溶物在用重折疊緩沖液稀釋之前優(yōu)選經(jīng)歷過濾。例如，通過I. 5 μ m濾器過濾，增溶的G-CSF蛋白與宿主細(xì)胞碎片、聚集的未折疊蛋白、G-CSF的二聚體、多聚體和/或未折疊蛋白分離。G-CSF蛋白中的分子內(nèi)二硫鍵通過添加包含氧化還原對(duì)的重折疊緩沖液促進(jìn)其形成。“氧化還原對(duì)”是指還原型和氧化型硫醇試劑的混合物，包括例如還原型和氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱胺、DTT/GSSG、和DTE/GSSG、以及任何一個(gè)所提到的氧化還原對(duì)組分的混合物；參見，例如，Clark, Cur.Op. Biotech. 12(2001)，202-207。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，氧化還原對(duì)是GSH/GSSG，其中還原型和氧化型谷胱甘肽的濃度各自為O. lmmol/1至20mmol/l,優(yōu)選O. 5mmol/l至10mmol/l,最優(yōu)選 O. 2mmol/l 至 10mmol/l ;參見實(shí)施例。為了獲得生物活性的G-CSF的重折疊可以在中性或堿性pH的緩沖溶液中執(zhí)行。優(yōu)選，重折疊過程在約8的pH值下執(zhí)行。重折疊緩沖液可以包括其他添加劑以提高重折疊，例如，L-精氨酸或鹽酸精氨酸(O. 4-lmol/L)、PEG、低濃度變性劑例如尿素(l-2mol/L)和鹽酸胍(O. 5-1. 5mol/L)、和去污劑(例如，Chaps, SDS’ CTAB，月桂基麥芽糖苷，聚山梨醇酯HOi I ween 80",和Triton X-100)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，重折疊緩沖液還含有精氨酸-HCl。在已知的重折疊策略當(dāng)中，稀釋仍然是最簡單的方法。在工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用中，稀釋通常被用于包含體中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的重折疊。典型地，通過使用達(dá)到最佳稀釋水平所必需的量的含有增溶劑的稀釋劑來混合/稀釋含有溶解的蛋白質(zhì)的溶液，一步完成稀釋。當(dāng)增溶劑濃度低于某個(gè)閾值水平時(shí)，所述蛋白質(zhì)開始恢復(fù)它的生物活性的三維構(gòu)象。取決于具體的蛋白質(zhì)和所選擇的折疊條件，重折疊在毫秒至秒內(nèi)開始。在這個(gè)初始的突發(fā)階段，蛋白質(zhì)對(duì)聚集高度易感。為了使聚集最小化，蛋白質(zhì)濃度必須保持得相當(dāng)?shù)?，?yōu)選低于2mg/ml。在此初始重折疊階段之后，蛋白質(zhì)形成更致密的結(jié)構(gòu)，最后形成對(duì)聚集的易感度降低的天然蛋白質(zhì)構(gòu)象。完全重折疊，包括形成二硫鍵，對(duì)于G-CSF可以在幾小時(shí)內(nèi)完成。為了確保有效和完全的復(fù)性，需要增溶物與重折疊緩沖液的適當(dāng)比率。根據(jù)本發(fā)明，將所述增溶物用重折疊緩沖液以I比100、優(yōu)選I比40、最優(yōu)選I比20的比率稀釋；也參見實(shí)施例。術(shù)語“用重折疊緩沖液稀釋”用于本發(fā)明的方法時(shí)，原則上包括將增溶物在預(yù)定量的重折疊緩沖液中稀釋和將重折疊緩沖液倒入增溶物樣品中。優(yōu)選，所述增溶物在攪拌下 被加到重折疊緩沖液中。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，稀釋過程持續(xù)約一小時(shí)。如上所述，在本發(fā)明的方法中，在合適的氧化還原系統(tǒng)中的重折疊過程可以在小于半天以內(nèi)，在環(huán)境溫度、即通常超過10° C下實(shí)施，并有利地在3至4小時(shí)內(nèi)，在室溫下、即20±2° C下實(shí)施。環(huán)境溫度可以在10° C和30° C之間、并優(yōu)選在15° C和25° C之間、更優(yōu)選在17° C和23° C之間、特別優(yōu)選在19° C和21° C之間變化。重折疊時(shí)間可以適應(yīng)于實(shí)施例中說明的條件。因此，當(dāng)重折疊過程在大約20±2° C下持續(xù)約3至4小時(shí)，可以使用相同的時(shí)間范圍，或者取決于重折疊過程是在低于18° C或超過22° C下執(zhí)行可以增加或減少一個(gè)或兩個(gè)小時(shí)。任何情況下，重折疊過程的持續(xù)時(shí)間小于12小時(shí)。使用本發(fā)明的方法，來自包含體的總G-CSF蛋白質(zhì)含量中的70%可以重折疊為生物活性的G-CSF。重折疊過程可以通過將重折疊緩沖液的pH降低到酸性pH而終止。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用乙酸將PH降低到3. O至6. 5，優(yōu)選降低到3. 5至5. 5，最優(yōu)選降低到 4. O?！〨-CSF蛋白質(zhì)已經(jīng)重折疊,貝U可以向蛋白質(zhì)樣品添加表面活性劑(tenside)或表面活性劑。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，非離子型去污劑、優(yōu)選聚山梨醇酯20或80、最優(yōu)選聚山梨醇酯80(Tween 80 )，取決于G-CSF的進(jìn)一步用途，以O(shè). 001至1%、優(yōu)選O. 05至O. 1%、最優(yōu)選O. 05至O. 06%或O. 01%的終濃度被加到重折疊G-CSF蛋白質(zhì)的樣品中。在許多情況下，重折疊體系在進(jìn)一步處理之前進(jìn)行過濾以除去高分子顆粒將是有利的，所述高分子顆粒往往是折疊期間形成的蛋白質(zhì)聚集體。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，將重折疊蛋白質(zhì)溶液通過濾器級(jí)聯(lián)過濾，優(yōu)選通過10個(gè)I. 2 μ m的濾器級(jí)聯(lián)。繼過濾之后，在保存步驟中儲(chǔ)存溶液，在該步驟中優(yōu)選環(huán)境溫度如22±2° C ;也參見圖I和本發(fā)明所附實(shí)施例6中的表I。為了在重折疊之后獲得G-CSF制備物的更高產(chǎn)品濃度，可以對(duì)G-CSF蛋白進(jìn)行滲析或滲濾以除去氧化還原對(duì)和/或其他不需要的緩沖液成分。因此，在此設(shè)置過濾過程以除去細(xì)胞碎片、不溶性污染蛋白和核酸的沉淀物。該步驟提供了經(jīng)濟(jì)地除去細(xì)胞碎片、污染性蛋白和沉淀物的方便的手段。在選擇濾器或過濾方案中，必須確保在發(fā)生上游改變或變化的情況下有穩(wěn)固的性能。保持良好凈化性能和步驟收率之間的平衡，需要用各種過濾介質(zhì)研究大量過濾方式。合適的濾器類型可以利用纖維素濾器、再生纖維素纖維、纖維素纖維結(jié)合無機(jī)助濾劑(例如硅藻土，珍珠巖，煅制二氧化硅)、纖維素纖維結(jié)合無機(jī)助濾劑和有機(jī)樹脂、或其任何組合和聚合物過濾器(例子包括但是不限于尼龍、聚丙烯、聚醚砜)來獲得有效清除。在一種實(shí)施方式中，使用5-10kDa UF膜和約8x緩沖液更換來實(shí)施過濾、例如超濾和滲濾步驟，其中緩沖液被乙酸鈉和非離子型去污劑、例如PH 4的聚山梨醇酯80更換。滲濾是將較小的分子清洗透過膜、將較大的目的分子留在保留物中的分級(jí)過程。對(duì)于去除或更換鹽、去除去污劑、將游離分子與結(jié)合分子分離、去除低分子量物質(zhì)、或快速改變離子或PH環(huán)境而言，這是一種方便有效的技術(shù)。所述過程典型使用微量過濾膜以從漿體取出目的產(chǎn)物，同時(shí)保持漿體濃度不變。
如上面描述的，本發(fā)明方法中必要的色譜純化步驟包括反相(RP)色譜，特別是工業(yè)規(guī)模下的反相高壓液相色譜(RP-HPLC)步驟。通過60° C的分析型RP-HPLC，可以看到在重折疊過程之后獲得的G-GSF樣品中疏水性較小的G-CSF亞型污染物，其特征為66%的α -螺旋含量和圖3顯示的洗脫曲線。如現(xiàn)有技術(shù)中所提到的，已經(jīng)執(zhí)行過不同的離子交換或疏水層析來純化G-CSF，但尚未設(shè)想過在工業(yè)規(guī)模下使用RP-HPLC作為純化步驟。執(zhí)行反相(RP)色譜的手段和方法對(duì)所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是公知的。優(yōu)選，反相(RP)色譜步驟是反相高壓液相色譜(RP-HPLC)。典型地用包含甲基、丁基、苯基、丙基和/或辛基基團(tuán)作為官能團(tuán)的樹脂并使用含有有機(jī)溶劑的流動(dòng)相體系來執(zhí)行RP-HPLC。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，用市場(chǎng)上可買到的C4反相色譜材料執(zhí)行RP-HPLCo 示例性的反相材料是Vydac 214TPB1015，C4，可得自 Grace Davison ；DaisopakSP-300-15-C4-BI0，可得自 DAISO Fine Chem. GmbH ；YMCGeI Butyl Sphiii isoll C4,15 μ ,300A,可得自 YMC Europe GmbH ；Jupiterl5 μ , C4, ,300A,可得自 Phenomenex。在本發(fā)明方法的特別優(yōu)選實(shí)施方式中，將Jupiter C4色譜樹脂用于RP-HPLC中，Source 15RPC或Source 30RPC色譜樹脂(供應(yīng)商GE Healthcare)用于反相色譜中。Jupiter C4由娃膠顆粒構(gòu)成,娃膠顆粒表面攜帶C4-燒基鏈。根據(jù)本發(fā)明，最優(yōu)選使用Jupiter C4色譜的樹脂；也參見實(shí)施例。根據(jù)疏水性相互作用的強(qiáng)度差異，將G-CSF與蛋白質(zhì)雜質(zhì)分離開。用極性比水小的溶劑，例如水中的梯度乙腈、乙醇或甲醇，來執(zhí)行洗脫，優(yōu)選使用存在稀釋的三氟乙酸的乙腈。藉此，疏水性較小的G-CSF亞型可以通過在不同的級(jí)分內(nèi)洗脫而與G-CSF分離。通常，總G-CSF制備物中疏水性較小的亞型在比G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品早的級(jí)分中被洗脫。G-CSF和疏水性較小的G-CSF亞型可以用線性梯度的有機(jī)溶劑洗脫，例如用含O至90%乙腈的水、即注射用水(WFI)并含有約O. 1%TFA。優(yōu)選，如實(shí)施例所述執(zhí)行RP-HPLC。洗脫物優(yōu)選被收集在預(yù)裝有含聚山梨醇酯80的緩沖液的小瓶中；也參見上文和實(shí)施例。如上文解釋和實(shí)施例中說明，在本發(fā)明的方法中，反相色譜步驟之前典型是離子交換色譜。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，使用單一的離子交換色譜純化G-CSF，以除去所有污染物如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，特別是內(nèi)毒素和宿主細(xì)胞DNA。原則上，可以使用陽離子交換色譜或陰離子交換色譜。
在本發(fā)明方法的特別優(yōu)選實(shí)施方式中，在重折疊的G-CSF被超濾和滲濾之后執(zhí)行陽離子交換色譜(CEX)。如實(shí)施例中說明，用選擇的材料(CMSephiImsceiFF)執(zhí)行CEX色譜可以有特別高的流速和良好的產(chǎn)物回收。由于在酸性環(huán)境中帶正電荷的事實(shí)，G-CSF是一種強(qiáng)結(jié)合物，可以用線性氯化鈉梯度在酸化的PH下以高濃度洗脫到小體積的所需緩沖液中。因此，根據(jù)本發(fā)明，在RP色譜之前、特別是RP-HPLC之前使用CEX步驟，用以更換緩沖液、濃縮G-CSF和除去G-CSF聚集體。執(zhí)行陽離子交換色譜的手段和方法是所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員公知的；也參見背景部分、上文或供應(yīng)商GE Healthcare敘述的現(xiàn)有技術(shù)。例如，可以使用市場(chǎng)上可買到的常規(guī)基質(zhì)。在此，G-CSF在特定pH范圍內(nèi)由于它的正性總電荷與陽離子交換基質(zhì)結(jié)合，而大部分污染物質(zhì)如來源于宿主細(xì)胞的核酸、脂多糖和蛋白質(zhì)以及G-CSF離子型亞型和具有不同pH值的G-CSF的改變形式不能和陽離子交換基質(zhì)結(jié)合就會(huì)出現(xiàn)在通流中或可借助于洗滌除去。合適的陽離子交換基質(zhì)包括但是不限于，羧甲基(CM)纖維素、AG 50ff> Bio-Rex 70、羧甲基(CM) Sephadex、橫丙基(SP) Sephadex、竣甲基(CM)SepharoseCL-6B> CMSepharose HP、Hyper D-S 陶瓷(Biosepra)和橫酸鹽(S) Sepharose、SPSepharoseFF, SPSepharoseSP 5PW.TSK凝膠 SP-5PW-HR、Toyopearl SP-650M、Toyopearl SP-650S> ToyopearI SP-650C> ToyopearlCM-650M、Toyopear 1CM-650S 等。橫丙基基質(zhì)、特別是產(chǎn)品 SP Sepharose XL和 SPSepharose FF (Fast Flow)和 S-Sepharose FF,可得自德國 Freiburg 的 Amersham Biosciences (現(xiàn)在的GE Healthcare)。在一種實(shí)施方式中，陽離子交換材料是磺丙基陽離子交換材料。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，離子交換色譜是陽離子交換色譜(CEX)并用CM-SepharoseFF執(zhí)行；也參見實(shí)施例6和7。陽離子交換色譜的合適緩沖液包括馬來酸鹽、丙二酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、乙酸、乙酸鹽、磷酸鹽、REPES, Bistris和Bicin緩沖液。在優(yōu)選實(shí)施方式中，使用乙酸作為緩沖液成分。優(yōu)選，緩沖液的濃度在IOmM和IOOmM之間，優(yōu)選在20mM和50mM之間。根據(jù)本發(fā)明，緩沖液中還包含表面活性劑，優(yōu)選使用聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，最優(yōu)選聚山梨醇酯80 ;也參見上文。通過利用pH值不高于6. O、優(yōu)選不高于5. 5的緩沖液，對(duì)G-CSF制備物進(jìn)行純化。通常用五個(gè)柱體積(CV)的由乙酸、聚山梨醇酯80組成的pH 5. 5的平衡緩沖液對(duì)結(jié)合了 G-CSF的柱子進(jìn)行后續(xù)洗滌。在陽離子交換色譜的情況下，可以通過增加pH值或增加離子強(qiáng)度來改變緩沖液，將G-CSF從柱上洗脫。優(yōu)選，通過增加離子強(qiáng)度，優(yōu)選通過使用線性氯化鈉梯度，來完成洗脫。陽離子交換色譜的適宜條件可以取自相關(guān)的文獻(xiàn)，例如2002年德國Freiburg的Amersham Biosciences (現(xiàn)在的GE Healthcare)的“離子交換色譜-原理和方法(IonExchange Chromatography-Principles and Methods)，，和實(shí)施例 7。在本發(fā)明方法特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，純化過程包括(i)超濾/滲濾步驟；(ii)陽離子交換(CEX)色譜步驟；(iii)微量過濾步驟；(iv)反相(RP)色譜步驟；和(V)超濾/滲濾步驟。這種實(shí)施方式也在圖I中顯示并在實(shí)施例中說明。在第一(i)步超濾/滲濾中，緩沖液被酸性pH的乙酸鈉、聚山梨醇酯80更換。最后，溶液通過10個(gè)I. 2 μ m的濾器級(jí)聯(lián)過濾。繼過濾之后，溶液可以儲(chǔ)存在22+2° C下(保存步驟)。色譜純化步驟被設(shè)計(jì)用來除去細(xì)胞培養(yǎng)物組分、細(xì)菌細(xì)胞雜質(zhì)和與方法與產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)，并用來確保用于進(jìn)一步處理的G-CSF的含量穩(wěn)定。本發(fā)明高度純化的G-CSF在后續(xù)的過濾和色譜步驟中得到富集；也參見圖I。在本發(fā)明方法的另一種實(shí)施方式中，使從步驟(ii)陽離子交換色譜(CEX)得到的G-CSF制備物經(jīng)歷微量過濾步驟(iii)，其中從細(xì)胞勻漿液中除去可溶雜質(zhì)。為了獲得沒有疏水性較小的亞型的純G-CSF制備物，進(jìn)一步執(zhí)行步驟(iv) RP-HPLC。隨后，最后的超濾/滲濾步驟被用作最終精整步驟，將G-CSF配制到它需要的緩沖液中。這適應(yīng)了得到小的最終容積的制備物的需要，即RP-HPLC合并物中G-CSF的濃度必須強(qiáng)烈提高，以及適應(yīng)了將RP-HPLC合并物配制在合適的緩沖液中以進(jìn)一步穩(wěn)定純化的G-CSF的需要。在已經(jīng)實(shí)施本發(fā)明的不同純化步驟之后，G-CSF純度高，通過RP-HPLC和SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定分別達(dá)到了至少超過總蛋白的98%或甚至99%的純度；也參見圖2。此外，本發(fā)明的純化的G-CSF制備物的二聚體/多聚體含量典型為〈2%，優(yōu)選〈1%，而宿主細(xì)胞DNA或蛋白質(zhì)的剩余污染物分別是〈lOOppm或<200ppm。另外，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，內(nèi)毒素的污染<5EU/mg，總生物負(fù)載〈1CFU/I0ml。此外，三氟乙酸(TFA)和乙腈的最終剩余含量分·別 <30ppm 和 <410ppm。由于依照本發(fā)明方法得到的G-CSF制備物的高純度和均質(zhì)性，本發(fā)明的G-CSF制備物特別適于進(jìn)一步衍生化。因此，在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括將依照所述方法得到的G-CSF進(jìn)行化學(xué)改性，例如將水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)共價(jià)連接至所述G-CSF。使聚乙二醇(PEG)和蛋白質(zhì)結(jié)合是產(chǎn)生在人體內(nèi)的時(shí)限延長的分子的重要技術(shù)。給G-CSF連接上10-至30-kDa的PEG部分能夠(I)通過使得蛋白質(zhì)更可溶而防止蛋白沉淀，和(2)相比G-CSF聚集速率降低，這是由于PEG-G-CSF的溶解性是由PEG基團(tuán)周圍的水分子的有利溶劑化作用所介導(dǎo)。術(shù)語“水溶性”是指在水中具有一定可檢測(cè)溶解度的部分。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖類、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等等。水溶性聚合物的聚合物主鏈可以是聚(乙二醇)(即PEG)。 術(shù)語“水溶性聚合物”共價(jià)連接至G-CSF是指G-CSF多肽與至少一種聚合物之間的結(jié)合物，其中所述結(jié)合物通過所述聚合物的官能團(tuán)與所述多肽的官能團(tuán)之間的共價(jià)鍵連接形成。所述結(jié)合物可以包含一個(gè)或多個(gè)聚合物部分。幾種合適的聚合物部分或聚合物包括聚(烷二醇)例如PEG和PPG，羥烷基淀粉例如羥乙基淀粉(HES)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。這樣的聚乙二醇化的G-CSF包括單聚乙二醇化G-CSF和用兩個(gè)或兩個(gè)以上PEG分子改性的G-CSF。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述共價(jià)連接的聚合物大約10至30kDa，優(yōu)選20kDa。G-CSF的化學(xué)改性方法，特別是聚乙二醇化，對(duì)所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員是公知的并描述在例如W02008/124406中。本發(fā)明還涉及通過以上限定的本發(fā)明方法得到的G-CSF制備物。因此，本發(fā)明的G-CSF制備物特別適于治療應(yīng)用。在本文中，本發(fā)明還涉及制造藥物組合物的方法，所述方法包括如上所述制備和分離G-CSF，并提供這樣制備和分離的G-CSF與可藥用載體的混合物。優(yōu)選實(shí)施方式是生產(chǎn)重組G-CSF與可藥用添加劑例如緩沖液、鹽和穩(wěn)定劑的藥物組合物的方法，其中所述方法包括如上面所述獲得本發(fā)明的G-CSF的方法。根據(jù)本發(fā)明得到的G-CSF可以(i)直接使用或(ii)進(jìn)一步處理，例如如上所述的聚乙二醇化或參見WO2008/124406，然后以凍干物的形式或液體形式儲(chǔ)存。G-CSF作為藥物組合物的活性成分可以通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)鼻、吸入、局部、直腸、經(jīng)口、眼內(nèi)或皮下途徑，用典型的方法給藥。給藥方法沒有特別的限制，但是優(yōu)選非口服給藥，更優(yōu)選皮下或靜脈內(nèi)給藥。重組表達(dá)的G-CSF的制劑中合適的佐劑是例如穩(wěn)定劑如糖和糖醇、氨基酸和表面活性劑例如聚山梨醇酯20/80以及合適的緩沖物質(zhì)。本發(fā)明G-CSF制劑的其它實(shí)施方式，參見例如WO 2009/027437和W0/2008/124406，它們的公開內(nèi)容在此引為參考。制劑的例子也參見"ROTE LISTE 2004〃中的商品Neupogen 和Granocyte。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，將純化的生物活性的G-CSF在pH 4.0的IOmM乙酸、O. 0025%聚山梨醇酯80和50g/l山梨糖醇中進(jìn)行配制。 根據(jù)本發(fā)明方法得到的G-CSF的活性可以通過生物測(cè)定法測(cè)定，并與市場(chǎng)上可買到的G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品的活性相比較。為此，在RPMI 1640培養(yǎng)基(Bachern，Heidelberg，德國)中培養(yǎng)對(duì)G-CSF起響應(yīng)的小鼠細(xì)胞系NFS-60，所述培養(yǎng)基含有I. 5g/l碳酸鈉、4. 5g/l葡萄糖、IOmM Ifepes和I. OmM丙酮酸鈉，并補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺、10%FCS、0. 05mM 2-巰基乙醇和60ng/ml G-CSF。對(duì)于活性試驗(yàn)而言，將所述細(xì)胞用沒有G-CSF的培養(yǎng)基洗滌兩次，以每孔2x IO4個(gè)細(xì)胞的濃度放入96-孔板并在37° C和4. 5%C02下分別與不同濃度的純化G-CSF和標(biāo)準(zhǔn)品一起溫育三天。隨后，細(xì)胞用XTT試劑染色，并在微量滴定板讀數(shù)器中測(cè)量450nm時(shí)的吸收。根據(jù)本發(fā)明，可以表明用根據(jù)本發(fā)明純化的G-CSF處理的細(xì)胞的生長與用標(biāo)準(zhǔn)品處理的細(xì)胞相同或更好。特別是，數(shù)據(jù)顯示，根據(jù)本發(fā)明方法得到的純化的G-CSF特征為，在NFS-60增殖試驗(yàn)中，其生物活性為WHO參照標(biāo)準(zhǔn)的80-125%。本發(fā)明的藥物組合物的特征為無菌并且無熱原。在本文中使用時(shí)，“藥物組合物”包括供人用和獸用的制劑。本發(fā)明的藥物組合物的制備方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)，例如，如以下文獻(xiàn)所述《雷明頓藥物科學(xué)》，第17版(Remington’s PharmaceuticalScience, 17th ed. ) , Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)和更新版本《雷明頓藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy) (2000),University of Sciences, Philadelphia, ISBN 0-683-306472，兩個(gè)文件的整個(gè)公開內(nèi)容在此引為參考。這些還有其他實(shí)施方式由本發(fā)明的說明書和實(shí)施例公開和包涵。涉及本發(fā)明中使用的材料、方法、應(yīng)用和化合物中任一項(xiàng)的其它文獻(xiàn)，可以使用例如電子設(shè)備從公共圖書館和資料庫檢索到。例如，可以利用公眾數(shù)據(jù)庫“Medline”，其由國立衛(wèi)生研究院(theNational Institutes of Health)的國家生物技術(shù)信息中心(the National Centerfor Biotechnology Information)和 / 或國立醫(yī)學(xué)圖書館(the National Library ofMedicine)主辦。其它數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)頁地址，例如那些屬于歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)的歐洲生物信息研究所(EBI)的，是所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員知道的，并還可以使用因特網(wǎng)搜索引擎得到。生物技術(shù)方面專利信息的綜述以及用于追溯檢索和新近資料通告的相關(guān)專利信息源的縱覽在Berks, TIBTECH 12 (1994)，352-364中提供。
以上公開內(nèi)容一般性描述了本發(fā)明。除非另有說明，術(shù)語在本文中使用時(shí)給出的定義與《生物化學(xué)和分子生物學(xué)牛津詞典》(Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology), Oxford University Press, 1997, 2000 年修訂和 2003 年再版,ISBN0198506732中所提供的一樣。在本說明書的整個(gè)文本中引用了若干文獻(xiàn)。所有引用的參考(包括本申請(qǐng)中引用的文獻(xiàn)參考、已授權(quán)的專利、公布的專利申請(qǐng)以及制造商的說明書、指導(dǎo)等等)中的內(nèi)容，在此明確地引為參考；然而，并非承認(rèn)引用的任何文獻(xiàn)對(duì)于本發(fā)明構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。通過參考以下具體實(shí)施例，可以獲到更完全的了解，在此提供的實(shí)施例只為了例證說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍。特別是，所述實(shí)施例涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
具體實(shí)施例方式除非另有限定，所有在此使用的技術(shù)和科學(xué)的術(shù)語的含義與本技術(shù)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員通常理解的相同(例如，分子遺傳學(xué)，核酸化學(xué)，雜交技術(shù)，蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化 學(xué))。對(duì)化學(xué)方法以及分子、遺傳和生化方法使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(后者通常參考，Samtoook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.和 Ausubel 等,《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Short Protocols in Molecular Biology) (1999)第 4 版，JohnWiley&Sons, Inc.-和題為《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in MolecularBiology)的完整版,它們?cè)诖艘秊閰⒖?。實(shí)施例I :起始材料G-CSF在源自于pBR322的表達(dá)載體03_221C-pHIP中表達(dá)。用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌株BNN93進(jìn)行生產(chǎn)。BNN93是大腸桿菌K12衍生株。通過λ啟動(dòng)子調(diào)節(jié)G-CSF合成，從30° C到42° C的溫度變化可以誘導(dǎo)該啟動(dòng)子，導(dǎo)致在包含體中過表達(dá)一級(jí)不溶性 G-CSF。實(shí)施例2 :發(fā)酵一小瓶工作細(xì)胞庫(WCB)內(nèi)含物用1，OOOmL不含卡那霉素的復(fù)合培養(yǎng)基稀釋后被用來產(chǎn)生“稀釋的工作細(xì)胞庫”供預(yù)發(fā)酵。在B級(jí)潔凈室中的A級(jí)層流罩(LAF)中進(jìn)行稀釋。預(yù)培養(yǎng)物直接無菌轉(zhuǎn)移到20L預(yù)發(fā)酵罐中。培養(yǎng)在30±1° C和250rpm的攪動(dòng)下開始，為時(shí)6至12小時(shí)，直到0D_達(dá)到0. 3至0. 6。完全發(fā)酵液被轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有不含卡那霉素的復(fù)合培養(yǎng)基的1，000L的發(fā)酵罐中。培養(yǎng)物在30±1° C和彡200rpm的攪動(dòng)下溫育，以確保PO2彡30%和pH 7. 0±0.2達(dá)9至11小時(shí)，直到OD6tltl達(dá)到5至7。實(shí)施例3 :包含體中的G-CSF表達(dá)通過把溫度提高到42° C來誘導(dǎo)G-CSF表達(dá)，并在彡200rpm攪動(dòng)以確保p02> 30%下進(jìn)一步溫育6. 75至7. 25小時(shí)。在室溫下通過盤式分離機(jī)以150L/h收獲細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生100L左右的濃縮細(xì)胞懸液。實(shí)施例4 :包含體的分離將濃縮的細(xì)胞懸液在pH 8. O的20mM磷酸鈉中稀釋到200L，并使用高壓均質(zhì)器以300L/h連續(xù)三次通過而勻漿。隨后通過在17，OOOrpm以50L/h管式轉(zhuǎn)筒離心，釋放包含體。在pH 8. O的18禮磷酸鈉、2%&八)1'1^011 X_100、5mM EDTA中重懸浮10分鐘后，將包含體再次在17，OOOrpm下以50L/h離心。用pH 8. O的18mM磷酸鈉洗漆所得的沉淀團(tuán)10分鐘，接著再次在17，OOOrpm下以50L/h離心。沉淀團(tuán)被重懸浮在注射用水(WFI)中并分成三等份。然后將包含體儲(chǔ)存在〈-15° C(保存步驟)。實(shí)施例5 :包含體的增溶和G-CSF的重折疊將由1000升發(fā)酵液獲得 的總包含體量的三分之一解凍之后，通過在攪拌下在pH
8.O的25mM Tris、6M GuHClUmM EDTA中溫育5. 5到6. 5小時(shí)，進(jìn)行包含體的增溶，然后用
I.5μπι濾器進(jìn)行過濾，例如深層過濾(澄清過濾)。然后在20+2° C下，通過在pH 8.0的25mM Tris、ImM谷胱甘肽(還原型)lmM谷胱甘肽(氧化型)、IOmM EDTA中稀釋，對(duì)G-CSF進(jìn)行重折疊。然后添加聚山梨醇酯80至最終濃度0.01%(w/v)并用乙酸調(diào)節(jié)pH值到4. O。重折疊之后，實(shí)施超濾和滲濾步驟(MWCO IOkDa, 8. 4m2,大約8x緩沖液更換)，其中所述緩沖液被pH 4. O的IOmM乙酸鈉、O. 01%(w/v)聚山梨醇酯80更換。最后，溶液通過10個(gè)I. 2 μ m的濾器級(jí)聯(lián)過濾。過濾之后，溶液被儲(chǔ)存在22±2° C(保存步驟)。實(shí)施例6:G-CSF純化色譜純化步驟被設(shè)計(jì)用來除去細(xì)胞培養(yǎng)物化合物、細(xì)菌細(xì)胞雜質(zhì)、方法和產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)，并用來確保用于藥物制劑的制備或后續(xù)的聚乙二醇化的G-CSF的含量穩(wěn)定；參見以下實(shí)施例。本發(fā)明的方法概要在圖I中給出并在下表I中描述。開展陽離子交換和RP-HPLC色譜的更詳細(xì)說明由表2和3中的實(shí)施例7提供。表I :所指出的工藝步驟中使用的緩沖液組合物
權(quán)利要求
1.從包含體獲得生物活性的人G-CSF的方法，所述方法包含以下步驟 (a)用含有變性劑和還原劑的增溶緩沖液來增溶包含體中所含的G-CSF； (b)通過用含有還原型和氧化型谷胱甘肽的重折疊緩沖液在>10°C的溫度下稀釋增溶物來重折疊G-CSF ;和 (c)通過包含反相(RP)色譜的至少一個(gè)色譜步驟來純化重折疊的G-CSF。
2.權(quán)利要求I的方法，其中變性劑是鹽酸胍，優(yōu)選其中鹽酸胍的濃度是4.Omol/1到8. Omol/1ο
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中還原劑是DTT。
4.權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)的方法，其中增溶緩沖液中還原劑的濃度是lmmol/1至100mmol/l,優(yōu)選 lmmol/1 至 10mmol/ I。
5.權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)的方法，其中使用每克包含體IOml至IOOml增溶緩沖液。
6.權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)的方法，其中增溶緩沖液和/或重折疊緩沖液還含有螯合劑，優(yōu)選EDTA 二鈉。
7.權(quán)利要求I至6任一項(xiàng)的方法，其中增溶時(shí)間是I至10小時(shí)、優(yōu)選4至8小時(shí)、最優(yōu)選6±0· 5小時(shí)。
8.權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)的方法，其中重折疊緩沖液還含有精氨酸-HCl。
9.權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)的方法，其中還原型和氧化型谷胱甘肽的濃度各自是O.2mmo1/I 至 10mmol/I η
10.權(quán)利要求I至9任一項(xiàng)的方法，其中增溶物用重折疊緩沖液以I比20的比率稀釋。
11.權(quán)利要求I至10任一項(xiàng)的方法，其中重折疊在20±2°C進(jìn)行至少3小時(shí)。
12.權(quán)利要求I至11任一項(xiàng)的方法，其中增溶物在用重折疊緩沖液稀釋之前經(jīng)歷過濾。
13.權(quán)利要求I至12任一項(xiàng)的方法，其中反相(RP)色譜步驟是RP高壓液相色譜(RP-HPLC)。
14.權(quán)利要求I至13任一項(xiàng)的方法，其中使用JupiterC4、Source 15RPC或Source30RPC色譜樹脂。
15.權(quán)利要求14的方法，其中JupiterC4色譜樹脂被用在反相高壓液相色譜(RP-HPLC)中。
16.權(quán)利要求I至15任一項(xiàng)的方法，其中RP色譜步驟之前是離子交換色譜。
17.權(quán)利要求16的方法，其中離子交換色譜是陽離子交換(CEX)色譜。
18.權(quán)利要求I至17任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)包括 (i)超濾/滲濾步驟； (ii)CEX色譜步驟； (iii)微量過濾步驟； (iV) RP色譜步驟；和 (ν)超濾/滲濾步驟。
19.權(quán)利要求I至18任一項(xiàng)的方法，其還包括將水溶性聚合物共價(jià)連接至G-CSF。
20.權(quán)利要求19的方法，其中水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述聚合物的分子量為約IOkDa至30kDa，優(yōu)選20kDa。
22.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)中表征的制備型RP色譜步驟在獲得生物活性的G-CSF中的應(yīng)用。
23.通過權(quán)利要求I至21任一項(xiàng)的方法或權(quán)利要求22的應(yīng)用得到的G-CSF制備物。
24.生產(chǎn)重組G-CSF和可藥用添加劑例如緩沖液、鹽和穩(wěn)定劑的藥物組合物的方法，其中所述方法包括權(quán)利要求I至21任一項(xiàng)用于獲得G-CSF的方法或權(quán)利要求22的應(yīng)用。
25.權(quán)利要求24的方法，其中將純化的生物活性的G-CSF在pH4.0的IOmM乙酸、O. 0025%聚山梨醇酯80和50g/l山梨糖醇中進(jìn)行配制。
26.藥物組合物，其包含權(quán)利要求23的G-CSF制備物或通過權(quán)利要求24或25的方法得到的G-CSF制備物。
全文摘要
本發(fā)明提供了從包含體獲得生物活性的重組人G-CSF的方法，其中增溶和重折疊過程可以在環(huán)境溫度下執(zhí)行，并且純化步驟包括反相色譜(RP)，特別是RP-HPLC。如此獲得的G-CSF制備物的特征為高純度和均質(zhì)性。
文檔編號(hào)C07K14/535GK102892780SQ201180014299
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者瓦爾特·因德雷爾, 克里斯蒂安·舍克爾曼 申請(qǐng)人:百奧杰諾瑞克斯有限公司