專利名稱：以蛋白質(zhì)a對(duì)癌癥的診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景技術(shù)對(duì)患者進(jìn)行癌癥診斷仍然是難題之一。雖然已經(jīng)存在有血液或組織中可檢測(cè)的某些診斷標(biāo)記物，例如，癌胚胎抗原(CEA)、α胎兒蛋白(AFP)、以及前列腺特異性抗原(PSA)等，但是，迄今為止，使用這些標(biāo)記物對(duì)患者身上存在癌癥的預(yù)測(cè)性檢測(cè)都還沒有達(dá)到其他臨床診斷的準(zhǔn)確程度。這些檢測(cè)的敏感性和特異性都低的令人失望。目前，可以被接受的癌癥診斷方法還是那些費(fèi)時(shí)且費(fèi)力的臨床診斷(例如，觸診、 X-線照片、乳房X-線照片、活組織檢查)。因此，就存在著對(duì)這樣一種標(biāo)記物的需要，即這種標(biāo)記物優(yōu)選存在于生物樣品中，例如，人體的血液中，并且能夠指示人體中癌的存在。特別需要的是，可以對(duì)人體早期癌癥給以指示的標(biāo)記物和檢測(cè)方法。一旦這種檢測(cè)試驗(yàn)成為可能，就可以進(jìn)行比現(xiàn)在更為旱期的治療并得到更好的結(jié)果。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供利用癌癥診斷性蛋白質(zhì)的測(cè)定對(duì)個(gè)體的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥進(jìn)行診斷的方法。提供用于對(duì)個(gè)體的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥進(jìn)行診斷的組合物也是本發(fā)明的目的之一。本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及利用對(duì)個(gè)體的生物學(xué)樣品，例如，血液樣品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果來探察癌癥的方法。在這類檢測(cè)中，使用至少一種對(duì)可能存在于生物學(xué)樣品中的癌癥診斷性蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。對(duì)在癌癥診斷性蛋白質(zhì)抗體反應(yīng)中形成的免疫學(xué)共軛物進(jìn)行檢測(cè)。非正常地高濃度存在著這些免疫共軛物就指示提供樣品的個(gè)體患有原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，癌癥診斷性蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)A，樣品與蛋白質(zhì)A的三明治式檢測(cè)物一起培養(yǎng)。與蛋白質(zhì)A起免疫反應(yīng)的抗體被連接到固體支持物上。讓樣品與所連接的抗體以及與該蛋白質(zhì)A的另一個(gè)區(qū)域(即，與連接到固體支持物上的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的區(qū)域以外的另一個(gè)區(qū)域)發(fā)生免疫反應(yīng)的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)。所得到的兩個(gè)抗體-蛋白質(zhì)A復(fù)合物就形成三明治(sandwich)檢測(cè)物。對(duì)結(jié)合的第二抗體數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。該檢測(cè)到的第二抗體數(shù)量直接與連接的蛋白質(zhì)A成比例。非正常大量的第二抗體的測(cè)定值指示在進(jìn)行該檢測(cè)的樣品中存在原發(fā)性或轉(zhuǎn)移生癌癥。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選方案是含有一種或多種用于進(jìn)行癌癥診斷性蛋白(例如，蛋白質(zhì)A)檢測(cè)的抗體的試劑盒?？贵w中的一種是與癌癥診斷性蛋白質(zhì)的一個(gè)抗原決定區(qū)域發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，如果存在第二抗體，則該第二抗體是與該癌癥診斷蛋白的抗原決定區(qū)域發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，該抗原決定區(qū)域不同于與第一抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原決定區(qū)域。在優(yōu)選的試劑盒中，有與蛋白質(zhì)A的兩個(gè)抗原決定區(qū)域發(fā)生免疫反應(yīng)的兩種抗體?？贵w之一與固體支持物連接，例如與微滴盤小井的底部和壁連接。另一個(gè)抗體連接有可被識(shí)別的標(biāo)記物。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案是與癌癥診斷性蛋白質(zhì)，既蛋白質(zhì)A發(fā)生免疫反應(yīng)的一種或多種抗體。這些抗體被用于對(duì)癌癥診斷性蛋白質(zhì)的存在進(jìn)行檢測(cè)和探察。該檢測(cè)可以使用樣品，例如血液樣品來進(jìn)行。附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1是以圖形表示對(duì)可溶性蛋白質(zhì)A的色譜分離圖1A是對(duì)經(jīng)過高壓液相色譜(HPLC)凝膠柱提純的As形式的蛋白質(zhì)A的光掃描結(jié)果；圖1B是HPLC提純后的As以DEAE-纖維素陰離子交換柱再次色譜后的光掃描，并用線形鹽梯度(虛線)確認(rèn)提純程序的有效性。
圖2是用SDS-PAGE提純的Am和As的照相圖。凝膠用銀染色。第一條是提純的Am；第二條是提純的As；第三條表示分子量的標(biāo)準(zhǔn)。
圖3是在有腺嘌呤核苷酸存在下，以溶解性和膜結(jié)合形式的蛋白質(zhì)A結(jié)合的GTP-類似物GMP-PNP的圖形。
圖4是在有GTPγS存在下，As和Am的ATP酶活性的圖示。
圖5是表示對(duì)照個(gè)體和被診斷為患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的個(gè)體的血液中蛋白質(zhì)A的濃度。本發(fā)明詳述本發(fā)明涉及對(duì)個(gè)體進(jìn)行原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥診斷的方法和組合物。原發(fā)性癌癥指的是癌細(xì)胞的生長(zhǎng)僅僅限于某一特定的身體解剖學(xué)區(qū)域內(nèi)，或由形成起始癌癥融合的細(xì)胞組成。轉(zhuǎn)移性癌癥指的是癌癥的生長(zhǎng)從其在體內(nèi)起始的原發(fā)位點(diǎn)擴(kuò)散到血液和/或淋巴系統(tǒng)，并且在離開原發(fā)腫瘤的其它位點(diǎn)生長(zhǎng)；在對(duì)原發(fā)性腫瘤進(jìn)行治療后，還會(huì)再次擴(kuò)散。
本發(fā)明的方法和組合物可以對(duì)眾多的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥進(jìn)行診斷。本發(fā)明的方法和組合物所能夠診斷的癌癥有，乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、頭頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腮腺癌、膽道癌、腎和尿道癌、頸癌、甲狀腺癌、腦癌、口癌、子宮癌、腹癌、舌癌、唇癌、肛門癌、骨盆癌、腹股溝癌、陰莖癌、胸癌、輸卵管癌、POEMS、淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑素瘤和肉瘤。這些癌癥，很可能包括其它癌癥，都可以在其發(fā)展的各個(gè)期間，包括第一和第二階段被診斷出來。使用本發(fā)明的方法和組合物可以區(qū)分患有癌癥、患有良性瘤和沒患有癌癥的個(gè)體。
本發(fā)明的方法優(yōu)選使用能夠與癌癥診斷性蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。優(yōu)選的癌癥診斷性蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)A。將一種或多種抗體與個(gè)體的生物學(xué)樣品一起培養(yǎng)后，非正常大量存在著抗體-蛋白質(zhì)A免疫共軛物就表明該個(gè)體患有原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥。
通常都使用血液作為優(yōu)選的生物學(xué)樣品。當(dāng)使用血液作為生物學(xué)樣品時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行分析的血液成分是血漿或血清，更為優(yōu)選的是血清。由于血液和其它體液是優(yōu)選的生物學(xué)樣品，所以，對(duì)免疫反應(yīng)性的癌癥診斷性蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)A的測(cè)定是在液體介質(zhì)中進(jìn)行的。當(dāng)血液為生物學(xué)樣品時(shí)，該液體介質(zhì)在體內(nèi)循環(huán)。這樣，本發(fā)明的方法就不必使用局部化的材料，例如進(jìn)行活體檢驗(yàn)，相反，可以使用于那些易于得到的生物學(xué)樣品，例如，血清和血漿。在使用血液樣品的情況下，可被檢測(cè)的癌癥的種類也是相當(dāng)廣泛的。
在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，如果某一個(gè)體的生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)A的濃度是非癌癥患者的個(gè)體的對(duì)應(yīng)樣品中的蛋白質(zhì)A的濃度的二倍以上的話，就表明該個(gè)體患有癌癥。換句話說，從沒有癌癥的個(gè)體中獲取相同量的生物學(xué)樣品，確定這些樣品的蛋白質(zhì)A的平均值，如果發(fā)現(xiàn)在某個(gè)體的相同量的生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)A的含量是沒有癌癥的個(gè)體的平均蛋白質(zhì)A的含量的二倍以上，則該個(gè)體就被認(rèn)為患有癌癥。在這些具體實(shí)施方案中，2.0(二倍)這個(gè)因子被認(rèn)為是域限值。如果某些個(gè)體的生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)A的濃度是不患有癌癥的個(gè)體的蛋白質(zhì)A平均濃度的二倍以上，則這些個(gè)體就被認(rèn)為患有癌癥，也就是說，受試者的樣品中的蛋白質(zhì)A的濃度與不患有癌癥的個(gè)體的蛋白質(zhì)A的濃度的比率大于2.0。如果受試者的樣品中的蛋白質(zhì)A的濃度與不患有癌癥的個(gè)體的蛋白質(zhì)A的濃度的比率小于2.0，則受試個(gè)體就不被認(rèn)為患有癌癥。該域限值2.0是優(yōu)選的域限值。其它用于確定癌癥的域限值也可以被建立。這些域限值的確定將取決于具體所用的癌癥診斷檢測(cè)的精確性和重復(fù)性，以及所需要的檢測(cè)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。
某個(gè)體的生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)A的濃度數(shù)值可以為診斷性數(shù)值和預(yù)后性數(shù)值。在一定時(shí)期內(nèi)連續(xù)確定某個(gè)體的蛋白質(zhì)A的數(shù)值，可以監(jiān)視癌癥的發(fā)展(蛋白質(zhì)A的數(shù)量增加)，或癌癥的消退，例如進(jìn)行了治療以后的效果(蛋白質(zhì)A的數(shù)量降低)。所測(cè)定到的蛋白質(zhì)A的數(shù)量可以是癌癥存在和癌癥迅速生長(zhǎng)的指示。監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)A的數(shù)量，可以相對(duì)于某個(gè)體的基線進(jìn)行，也可以相對(duì)于不患有癌癥的個(gè)體的蛋白質(zhì)A平均值進(jìn)行。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)A的數(shù)量超過某一個(gè)用檢測(cè)所監(jiān)視的特定數(shù)值時(shí)，則該個(gè)體就被認(rèn)為患有癌癥。蛋白質(zhì)A數(shù)量超過所建立的域限值的具體數(shù)值的大小，表示癌癥的嚴(yán)重程度，如果這個(gè)數(shù)值變小，不論是否進(jìn)行了治療，都表明癌癥嚴(yán)重程度的降低。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，每毫升血液中的蛋白質(zhì)A含量超過大約10ng，則表明存在有轉(zhuǎn)移性癌癥。在這些方法中，對(duì)轉(zhuǎn)移性癌癥的檢測(cè)也是建立在個(gè)體生物學(xué)樣品(例如，體液樣品中的血漿、血清、尿液等)中蛋白質(zhì)A含量的測(cè)定基礎(chǔ)上的。同樣，生物學(xué)樣品中蛋白質(zhì)A含量指示著提供該生物學(xué)樣品的個(gè)體是否患有轉(zhuǎn)移性癌癥。非正常大量蛋白質(zhì)A的存在表明有轉(zhuǎn)移性癌癥；正常的蛋白質(zhì)A的數(shù)量標(biāo)志該個(gè)體不患有轉(zhuǎn)移性癌癥。
這些檢測(cè)的有用性是顯而易見的，即以相對(duì)簡(jiǎn)單的檢測(cè)來指示是否有原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥的存在。
在確定生物學(xué)樣品中蛋白質(zhì)A含量的領(lǐng)域中，已經(jīng)有眾多的已知的技術(shù)。這些技術(shù)包括從樣品中分離和定量蛋白質(zhì)A，諸如使用溶解和離心程序，柱色譜或凝膠電泳分離程序，過濾，酶識(shí)別，或者使用可以特異性識(shí)別和結(jié)合蛋白質(zhì)A的分子的結(jié)合程序，例如，親和性色譜或免疫檢測(cè)。這些特異性結(jié)合的方法可以被用來在原位測(cè)定生物學(xué)樣品的蛋白質(zhì)A含量，即測(cè)定該特異性結(jié)合分子在樣品中的體積和分布區(qū)域。
優(yōu)選的測(cè)定生物學(xué)樣品中蛋白質(zhì)A含量的方法之一是用特異性結(jié)合蛋白質(zhì)A或者蛋白質(zhì)A的某一抗原決定基的抗體來進(jìn)行的免疫生物學(xué)識(shí)別。這些抗體是本發(fā)明的組合物。這些抗體選擇性地識(shí)別蛋白質(zhì)A決定物并且與其發(fā)生高親和性結(jié)合。這些抗體可以單個(gè)使用于西方印跡(Western Blot)程序或示蹤電泳圖案分析，作為親和性固定化基團(tuán)或作為示蹤結(jié)合基團(tuán)，也可以同時(shí)使用多個(gè)抗體對(duì)不同的蛋白質(zhì)A決定物或抗原決定基進(jìn)行結(jié)合，正如在三明治(sandwich)檢測(cè)中一樣。本發(fā)明的抗體可以特異性地結(jié)合蛋白質(zhì)A，所以蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)A的特異性抗原決定基就可以被特定地檢測(cè)到。
可以使用于本發(fā)明的抗體是那些與蛋白質(zhì)A發(fā)生反應(yīng)的抗體。術(shù)語“抗體”包括單克隆和多克隆抗體。該術(shù)語“抗體”還包括一種以上的與蛋白質(zhì)A反應(yīng)的抗體的混合物(例如，多種與蛋白質(zhì)A反應(yīng)的單克隆抗體的組合體)。術(shù)語“抗體”還包括完整的抗體，抗體的生物學(xué)功能性片段，具有與蛋白質(zhì)A結(jié)合特性的單鏈或單鏈的片段，以及包括從一種以上來源的部分組成的嵌合抗體，雙功能性抗體等等?？梢员皇褂玫纳飳W(xué)功能抗體片段是足以使抗體片段結(jié)合蛋白質(zhì)A的那些片段。
嵌合抗體可以包括來源于不同種起源的的部分(例如，人恒定識(shí)別區(qū)和鼠可變區(qū)或結(jié)合區(qū))。從不同起源來的部分可以被用常規(guī)的技術(shù)以化學(xué)方式連接起來，或者用遺傳工程技術(shù)融合起來。此外，編碼嵌合抗體蛋白質(zhì)的輕鏈和重鏈的DNA可以同融合蛋白質(zhì)一起進(jìn)行表達(dá)。
已經(jīng)確定的是特定的胞內(nèi)分子，即蛋白質(zhì)A，是與肌醇有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)緊密相關(guān)的。在該系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)A的功能是活化磷脂酶C(PL-C)以生成第二信使肌醇-1，4，5-三磷酯(IP3)和二?；视痛?DG)。在對(duì)膜結(jié)合受體進(jìn)行刺激之后，蛋白質(zhì)A與GTP結(jié)合以形成功能為激活PL-C的中間體。當(dāng)該中間體的GTP被水解為GDP后，PL-C的激活終止。因此，蛋白質(zhì)A是重要的G-型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，對(duì)細(xì)胞肌醇代謝途徑正常功能為關(guān)鍵性的。
這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子對(duì)生產(chǎn)用于上述本發(fā)明方法的抗體是有用的。用于生產(chǎn)抗體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子分離和純化的蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)A抗原決定基片段。
本發(fā)明的癌癥診斷蛋白質(zhì)，例如，蛋白質(zhì)A，還可以用于免疫治療。當(dāng)把這些蛋白質(zhì)引入血液或淋巴系統(tǒng)后，它們可以刺激免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，即在宿主中識(shí)別所存在的癌并對(duì)其產(chǎn)生反應(yīng)。因此，通過將外源的這些癌癥診斷蛋白質(zhì)引入到個(gè)體血液或淋巴系統(tǒng)，就可以刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫抑制活性來根除癌癥。
此外，本發(fā)明的抗體可以具有治療價(jià)值。當(dāng)把它們給予個(gè)體后，它們可以同癌癥診斷蛋白質(zhì)，例如蛋白質(zhì)A發(fā)生免疫反應(yīng)，從而引發(fā)進(jìn)一步的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，例如，通過刺激T-細(xì)胞的生產(chǎn)，來消除個(gè)體的癌細(xì)胞。
術(shù)語“蛋白質(zhì)A”最早用于描述在通過還原條件下電泳移動(dòng)力基礎(chǔ)上確定的分子量為約20千道爾頓的柱狀光受體蛋白質(zhì)。通過對(duì)其作為已知蛋白質(zhì)A基因的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)分析，得到該蛋白質(zhì)A的分子量為26千道爾頓。通過對(duì)分離形式的蛋白質(zhì)A進(jìn)行改良的萃取和分離并結(jié)合初步的序列分析數(shù)據(jù)，表明該以前稱作蛋白質(zhì)A的物體可能含有至少兩種在結(jié)構(gòu)上和功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)，一種是膜結(jié)合形式的，另一種是可溶性的。在此基礎(chǔ)上，所用的術(shù)語反映出假設(shè)的活體內(nèi)的狀態(tài)，膜結(jié)合的(20 kD)，和As，可溶性的(19 kD)，同樣，這是通過還原條件下電泳移動(dòng)力基礎(chǔ)上確定的分子量。這些蛋白質(zhì)A包括下列的對(duì)于N-端區(qū)域的氨基酸序列GNSKSGALSKEILEELQ(SEQ ID NO1)(Am)；和MGNSKSGALSKEILEELQ(SEQ ID NO2)(As)。
蛋白質(zhì)A相關(guān)分子的進(jìn)一步特征是它們包括一條具有顯著水解區(qū)域的多肽單鏈。這些分子還具有結(jié)合及水解腺嘌呤核苷酸和鳥苷三磷酸的能力，以及激活磷脂酶C，磷脂酶D的能力，還可能具有在GTP存在的條件下激活磷脂酶A2的能力。
蛋白質(zhì)A可以從哺乳動(dòng)物(牛)和兩棲類動(dòng)物(蛙)的眼睛內(nèi)光受體細(xì)胞的外桿節(jié)體(rod outer segments，ROS)通過提取，離心，色譜和其它本技術(shù)領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離出來。從脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的不同的其它組織中也分離出來了具有相似或相等的結(jié)構(gòu)或功能特征的蛋白質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)表明，蛋白質(zhì)A的結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中被保留了下來。蛋白質(zhì)A在水溶液中極不穩(wěn)定，但是，將其放入含有非離子表面活性劑的水溶液中，則就可以使其被顯著地穩(wěn)定化。蛋白質(zhì)A的分子量在19-20 kD之間，這是通過將其與在還原條件下的電泳分離的標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行比較而得到的。分離蛋白質(zhì)的優(yōu)選方法在以下給予描述。使用篩選分子量為10kD和30kD的過濾器得到了很好的純化結(jié)果。
蛋白質(zhì)A，其各種被剪切的或其突變型蛋白類似物，以及包含蛋白質(zhì)A和其它蛋白質(zhì)區(qū)域的融合蛋白可以通過多種合成以及生物合成方法來生產(chǎn)。例如，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，例如微生物，酵母，真核細(xì)胞培養(yǎng)物等，都可以通過遺傳工程來表達(dá)蛋白質(zhì)A或其一部分或其類似物。這一點(diǎn)可以通過已經(jīng)在本技術(shù)領(lǐng)域中充分建立起來的DNA重組技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。該重組程序可以包括對(duì)蛋白質(zhì)A、其一部分、其類似物進(jìn)行編碼的基因的分離及合成，以及將該基因整合到質(zhì)粒中。蛋白質(zhì)A的氨基酸序列也可以被確定。前述的氨基酸序列給出了兩種形式的蛋白質(zhì)A(Am和As)N-端氨基酸序列，即序列號(hào)1和序列號(hào)2(SEQ ID NO1，SEQ ID NO2)。從寡核苷酸進(jìn)行基因合成的技術(shù)以及已知的誘變技術(shù)提供了制備一系列類似物、剪切形式的蛋白質(zhì)A、包括蛋白質(zhì)A或抗體結(jié)合區(qū)域的融合蛋白的技術(shù)。這些材料的生產(chǎn)還可以包括對(duì)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞用載有包括對(duì)蛋白質(zhì)A、或其一部分、或其類似物進(jìn)行編碼的重組DNA的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，分離被表達(dá)的蛋白質(zhì)。鑒于根據(jù)在此所述可以制備富含蛋白質(zhì)A的樣品，重組生產(chǎn)天然型式和其各種部分或類似物都是屬于現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域范圍之內(nèi)的。
另外，通過將氨基酸按照正確順序進(jìn)行化學(xué)連接也可以制備至少該蛋白質(zhì)的一部分。
分離的蛋白質(zhì)A、其一部分或其類似物，可以被用作抗原來生產(chǎn)在個(gè)體的液體樣品中檢測(cè)蛋白質(zhì)A的抗體，從而進(jìn)行對(duì)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥的檢測(cè)。這些抗體可以是多克隆抗血清的一部分，或者是這些抗體的結(jié)合部分，對(duì)蛋白質(zhì)A進(jìn)行攻擊，并且表現(xiàn)出對(duì)蛋白質(zhì)A、或其類似物、其片段，或?qū)υ贏m或As上的某一抗原決定起反應(yīng)的。這些抗體可以是用已知的方法多克隆或單克隆抗體。對(duì)抗體的選擇最好使其不與其它的細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)?？贵w可以是根據(jù)Ouchterlony雙滲透試驗(yàn)(Ouchterlony DoubleDiffusion Test)確定的任何類別或亞類的抗體。優(yōu)選IgG類別的抗體。此外，識(shí)別蛋白質(zhì)A的抗體，可以全部或部分地被用生物合成或重組技術(shù)來合成。
另外，這些抗體可以同其它功能性分子結(jié)合，例如，毒素，熒光素或吸附性染料，酶，或放射性標(biāo)記物。在優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體是與針對(duì)抗生物素蛋白或抗鏈霉生物素蛋白(Streptavidin)具有特別強(qiáng)的抗體親抗原性的生物素分子連接的，而該生物素分子進(jìn)而同熒光素、吸附性或放射性標(biāo)記物連接。被連接的抗體可以用于從生物學(xué)樣品中檢測(cè)蛋白質(zhì)A，從而檢測(cè)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥?？贵w-標(biāo)記物復(fù)合體可以通過化學(xué)連接或重組DNA技術(shù)來制備，如果標(biāo)記物為蛋白質(zhì)性質(zhì)的物質(zhì)。
抗體還可以用在給患者服用之后就可以立即進(jìn)行對(duì)抗體的監(jiān)視和成像的試劑來標(biāo)記。該標(biāo)記可以是放射性同位素，例如125I或99mTc，這兩種標(biāo)記物都可以通過放射性檢測(cè)方式例如伽瑪射線閃爍照相來在體外成像。另外，抗體可以被MRI系統(tǒng)檢測(cè)的非放射活性的、順磁體造影劑來標(biāo)記。在該系統(tǒng)中，強(qiáng)磁場(chǎng)被用來調(diào)整患者身體的原子的核旋轉(zhuǎn)載體。然后，該磁場(chǎng)被干擾，隨著核回到原來的平衡排列而對(duì)患者成像。在本發(fā)明中，抗體可以連接到順磁材料上，例如，釓、鈷、鎳、錳或鐵的復(fù)合物，形成復(fù)合的診斷性造影劑，并可以在體外進(jìn)行MRI成像。
如果抗體沒有同功能性標(biāo)記物連接，抗體-蛋白質(zhì)A的復(fù)合體還可以使用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)技術(shù)來檢測(cè)，收復(fù)免疫沉淀物，例如通過離心來完成。
抗蛋白質(zhì)A的單克隆抗體可以從由鼠骨髓瘤細(xì)胞與鼠脾細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞系中得到，該鼠脾細(xì)胞預(yù)先被用從例如牛ROS中提純的蛋白質(zhì)A免疫過。免疫源可以是根據(jù)已知的肽合成的機(jī)械程序或手工程序體外制備的蛋白質(zhì)A的衍生物、其類似物或其一部分。另外，免疫源(蛋白質(zhì)A)可以通過本領(lǐng)域已知的使用重組DNA技術(shù)的生物合成方法來合成。選取其脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合的小鼠優(yōu)選遺傳限定的譜系，例如Balb/C。用于融合的骨髓瘤來自哺乳動(dòng)物，抗體產(chǎn)生的細(xì)胞系，但是，最優(yōu)選來自鼠細(xì)胞系，例如NS-1。單克隆抗體來自用融合產(chǎn)物注射過的小鼠的腹水。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，生產(chǎn)單克隆和多克隆抗體用的免疫源是從蛋白質(zhì)A的已知氨基酸序列中選取的含有約16個(gè)氨基酸的肽。該免疫源是長(zhǎng)度為約10-18個(gè)氨基酸的肽。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，免疫源是14個(gè)氨基酸或16個(gè)氨基酸的羧基終端的蛋白質(zhì)A，含有蛋白質(zhì)A的第60-71氨基酸的肽，含有蛋白質(zhì)A的第142-158氨基酸的肽或含有蛋白質(zhì)A的第158-170氨基酸的肽。當(dāng)該免疫源被用來生產(chǎn)用于三明治檢測(cè)中的抗體時(shí)，在大約為16個(gè)氨基酸的作為第一免疫源的肽之外，還要從蛋白質(zhì)A中選用第二免疫源。獲得與蛋白質(zhì)A的第二免疫源發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體的另一種技術(shù)是用完整的蛋白質(zhì)A對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，選擇與不是第一個(gè)免疫源的蛋白質(zhì)A的抗原決定基發(fā)生免疫反應(yīng)而是與另一個(gè)蛋白質(zhì)A的抗原決定基發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。生產(chǎn)兩套具有與不同抗原決定基發(fā)生免疫反應(yīng)性質(zhì)的抗體，保證了使用這種抗體的三明治檢測(cè)不會(huì)由于抗體對(duì)同一抗原位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)而受到損害。這一特點(diǎn)提高了對(duì)樣品中實(shí)際蛋白質(zhì)A含量進(jìn)行測(cè)定的靈敏性。
用已知的方法這樣來生產(chǎn)的單克隆和多克隆抗體是對(duì)蛋白質(zhì)A為特異性的，并且對(duì)蛋白質(zhì)A的檢測(cè)特別有用。
在本發(fā)明中，用所描述的方法可以對(duì)完整的蛋白質(zhì)A和可檢測(cè)的蛋白質(zhì)A的片段進(jìn)行檢測(cè)。完整的蛋白質(zhì)A或其可檢測(cè)的片段的重要特性是這些蛋白質(zhì)和肽的可被檢測(cè)性，即它們與固定化的或檢測(cè)用的抗體的免疫反應(yīng)性。這些蛋白質(zhì)和片段與抗體的復(fù)合物的形成和對(duì)這些復(fù)合物的檢測(cè)都是必要的。這種可被檢測(cè)的復(fù)合物可以用蛋白質(zhì)A的片段來形成。
本發(fā)明包括在生物學(xué)樣品如血漿或血清中檢測(cè)蛋白質(zhì)A數(shù)量的具體方法。在該方法中，與蛋白質(zhì)A的第一抗原決定基結(jié)合的第一抗體黏附到固體支持物上。該黏附的第一抗體與受試生物學(xué)樣品接觸?？梢栽谂c此同時(shí)或稍后將與蛋白質(zhì)A的第二抗原決定基結(jié)合的并被標(biāo)記了的第二抗體加入到第一抗體與生物學(xué)樣品的混合物中，從而生成連接在固體支持物上的第一抗體蛋白質(zhì)A第二抗體的免疫復(fù)合物。該第二抗體連接在可被檢測(cè)的標(biāo)記物上。任何沒有連接的第二抗體都被清除，然后，如果需要的話，對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，其存在和數(shù)量指示樣品中的蛋白質(zhì)A的存在和數(shù)量。用這種檢測(cè)所檢測(cè)到的非正常大量的蛋白質(zhì)A，表明提供生物學(xué)樣品的個(gè)體很可能患有原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥。換句話說，這個(gè)檢測(cè)是對(duì)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥的診斷。
測(cè)試盒也是本發(fā)明的實(shí)施例。這些測(cè)試盒含有一種或多種多克隆或單克隆抗體，用于對(duì)生物學(xué)樣品如個(gè)體的血液中可能存在的癌癥診斷性蛋白質(zhì)如蛋白質(zhì)A進(jìn)行檢測(cè)。這些測(cè)試盒還可以含有固體支持物，例如進(jìn)行檢測(cè)用的微滴盤。對(duì)蛋白質(zhì)A進(jìn)行檢測(cè)的說明書也可以包括在該測(cè)試盒中。如果需要的話，可以對(duì)測(cè)試盒的抗體附加標(biāo)簽。在優(yōu)選的測(cè)試盒中，提供的抗體可以在抗原為蛋白質(zhì)A時(shí)，進(jìn)行三明治式的檢測(cè)。在本發(fā)明的特殊優(yōu)選實(shí)施例中，三明治抗體中的一種是沒有標(biāo)簽的，并且連接到固體支持物上。另一種抗體配有標(biāo)簽以用于檢測(cè)。
以下的實(shí)施例進(jìn)一步揭示了本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明有任何限制。本發(fā)明的最佳實(shí)施例實(shí)施例1對(duì)可溶性(As)和膜結(jié)合的(Am)蛋白質(zhì)A的提純按照基本如Schmidt et al.[J. Biol.Chem.26214333-14336(1987)]所述的方法，從牛眼睛的視網(wǎng)膜中分離蛋白質(zhì)A。牛眼睛(母?；蛐∨?的眼睛在屠宰后的兩小時(shí)之內(nèi)得自于當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)。牛眼睛在暗室中至于冰上30-60分鐘。切除視網(wǎng)膜并放如緩沖液A中(130 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.0；每個(gè)小牛視網(wǎng)膜1ml，每個(gè)母牛視網(wǎng)膜2ml)。緩和地并重復(fù)地顛倒容器使大量的ROS進(jìn)入緩沖液。該混合物通過Buchler漏斗以去掉視網(wǎng)膜。過濾物放在錐底試管中在冰上靜置5分鐘，讓粗顆粒物質(zhì)從ROS的懸浮液中沉淀出來。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器顯微檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上清液中含有95％以上的ROS。用注射器反復(fù)吸取并噴射到容器壁來產(chǎn)生剪切力使ROS被打碎。
為了分離顆粒物和液體部分，將該懸浮液以10,000-12,000xg在4℃離心20分鐘。含有ROS膜的沉淀用與移出的上清液等體積的緩沖液A清洗一次。得到的沉淀重懸浮于3-6毫升緩沖液T中[(0.05％)Tween 20/80(1∶1)在重蒸蒸餾水中]，并且以15,000xg離心45分鐘。以上操作都是在暗紅色光線下進(jìn)行的。這兩種蛋白質(zhì)A的溶液(分別含有可溶性蛋白質(zhì)A的上清液，以及含有膜結(jié)合的蛋白質(zhì)A的上清液)用Centricon 30微濃縮器過濾(分子量的截取為30 kD，Amicon Corporation)，以5,000xg在冷凍的離心機(jī)上離心。超濾物以5,000xg在Centricon 10’s(分子量的截取為10kD)被濃縮和透析。
保留物中含有10kD-30kD的蛋白質(zhì)，當(dāng)把體積縮至0.5-1毫升時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)A(As)的平均濃度為100-200微克/每毫升，膜結(jié)合的蛋白質(zhì)A(Am)的平均濃度為30-100微克/每毫升。對(duì)As的提純使其含量提高了320倍，而對(duì)Am的提純使其增加了20倍。如果可溶性蛋白質(zhì)A的溶液在濃縮和使用之前需要過夜的話，則將緩沖液A和0.05％Tween 20/80(1∶1)按照1∶5的比例加入，以降低在濃縮液中的蛋白質(zhì)凝集。
按照上述進(jìn)行過超濾的蛋白質(zhì)A，在Bio-Sil SEC-125柱進(jìn)行HPLC來進(jìn)一步純化，對(duì)(As)使用緩沖液A，對(duì)(Am)使用緩沖液T，以進(jìn)行序列分析。常液洗脫。合并的各峰被濃縮，對(duì)水進(jìn)行透析，在進(jìn)行序列分析之前凍干。
為了確定在實(shí)驗(yàn)中所用的蛋白質(zhì)A的純度，將按照上述用超濾純化的As過HPLC尺寸的排阻柱(TSK-2000，Bio-Rad)，緩沖液A(圖1A)，然后用0.1M磷酸鉀緩沖液在DEAE陰離子交換柱上進(jìn)行再色譜。用0-200mM NaCl梯度洗脫蛋白質(zhì)(圖1B)。
對(duì)Am和As的分子量的估計(jì)是依據(jù)它們各自在SDS凝膠(見實(shí)施例2和圖2)和校正的凝膠過濾柱上的相對(duì)移動(dòng)來進(jìn)行的。在柱上的天然形式的和在凝膠中的變性形式的分子量的結(jié)果的吻合說明蛋白質(zhì)A在體內(nèi)是以單體存在的。
以上所描述的對(duì)As純化的結(jié)果是制備了高于95％純度的產(chǎn)物。在任何測(cè)試條件下，純化的As制劑中的蛋白質(zhì)污染物都沒有表現(xiàn)出與腺嘌呤核苷酸以及鳥嘌呤核苷酸發(fā)生相互作用。由于提取是順序進(jìn)行的，則在所述的方法中，對(duì)Am的純化得到基本均質(zhì)的產(chǎn)物并且沒有任何可檢測(cè)到的污染物，正如下述實(shí)施例2中SDS凝膠中以及圖2中第一條所顯示的那樣。
純化后，蛋白質(zhì)A在水溶液中的穩(wěn)定性有了明顯的改變。在純化狀態(tài)下，Am是亞穩(wěn)態(tài)的，并且在4℃的數(shù)天中保留了其大多數(shù)的功能性。Am還可以經(jīng)受在洗滌劑中的冰凍和融化，且所損失的原始活性不超過15-20％。相反，As在許多條件下都是不穩(wěn)定的，目前還沒有發(fā)現(xiàn)任何方法可以在4℃的48小時(shí)期間使其活性的損失不超過80％?？扇苄缘鞍踪|(zhì)A是明顯的不耐熱和不耐冷的。純化的As在室溫下迅速損失起活性(半生命期＝2小時(shí))，冷凍則損失幾乎全部活性，似乎其原因是蛋白的變性和/或凝集。純化的可溶性蛋白質(zhì)A在沒有洗滌劑存在時(shí)，很快凝集，并在該條件下于冰箱內(nèi)過夜時(shí)沉淀。
實(shí)施例2對(duì)可溶性(As)和膜結(jié)合的(Am)蛋白質(zhì)A的凝膠電泳根據(jù)對(duì)O’Farrell[J.Biol，Chem.，2504007(1995)]所描述的方法進(jìn)行修飾后的方法來進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，有0.1％SDS存在于孔梯度凝膠中(10％-20％)。樣品放入樣品緩沖液中，0.33mM DTT，7％SDS，17％甘油，0.5％M Tris-HCl，pH6.8，走平衡。樣品不用進(jìn)行熱變性，為的是不出現(xiàn)額外的由于形成穩(wěn)定的聚合物的帶。用Bio-Rad銀染色試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)染色。用Bio-Rad的預(yù)先染色的標(biāo)準(zhǔn)分子量(17-94kD)對(duì)凝膠進(jìn)行校準(zhǔn)。
如圖2所示，在還原條件下走凝膠時(shí)，“蛋白質(zhì)A”的膜結(jié)合的Am的分子量為約20kD，可溶性As的分子量為約19kD?？扇苄缘鞍踪|(zhì)解體為在凝膠上的兩個(gè)非?？拷膸?。而膜結(jié)合的形式移動(dòng)為單一帶。
實(shí)施例3鼠單克隆和多克隆抗蛋白質(zhì)A的抗體的生產(chǎn)Balb/c小鼠(6-8周；The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)用四次注射蛋白質(zhì)A進(jìn)行免疫。每次注射間隔1周，每次注射量為50微克蛋白質(zhì)A(單獨(dú)的As或Am，或兩者都用)。前三次注射采用腹膜內(nèi)注射，第四次采用靜脈內(nèi)注射。第一次注射時(shí)給蛋白質(zhì)A配以完全Freunds輔劑，第二次注射和第三次注射配以不完全輔劑，最后一次不用輔劑。最后一次注射前抽取的血清用酶聯(lián)免疫的固相微滴盤表明有與蛋白質(zhì)A的明顯結(jié)合。產(chǎn)生最好免疫反應(yīng)的小鼠在最后一次注射的三天后被殺死。從該動(dòng)物獲得的淋巴細(xì)胞通過將它們作為抗體產(chǎn)生細(xì)胞亞克隆于Cellco生物反應(yīng)器中以多克隆雜交瘤的形式保存下來。這些生產(chǎn)細(xì)胞處于液氮中低溫保藏。從這些生產(chǎn)細(xì)胞獲得的鼠多克隆抗體顯示了對(duì)蛋白質(zhì)A的特異性。
用殺死的小鼠的脾細(xì)胞與NS-1(P3NS-1/1-Ag4-1)骨髓瘤細(xì)胞(AmTerican Type Culture Collection，Rockville，MD；Accession No.TIB18)進(jìn)行融合。融合所用的方法是Nadakavukaren[Differentiation，27209-212，(1984)]的方法。對(duì)得到的克隆測(cè)定對(duì)蛋白質(zhì)A的結(jié)合。對(duì)一個(gè)克隆連續(xù)稀釋幾次進(jìn)行亞克隆。將具有最好生產(chǎn)功能的亞克隆注射到Balb/c小鼠的腹腔中，一產(chǎn)生含有多克隆抗體的腹水。對(duì)所得到的的腹水進(jìn)行離心，測(cè)定活性，然后在-70℃包藏直至使用。
對(duì)得到的18個(gè)抗蛋白質(zhì)A抗體進(jìn)行抗體同模篩選，使用Ouchterlony雙鏈滲透試驗(yàn)，在瓊脂板上對(duì)抗-IgM，抗-IgG，抗-IgG1，抗-IgG2a，抗-IgG2b，抗-IgG3等抗體(Cappell)篩選。結(jié)果列于表1。
表1mAb名稱同模 mAb名稱同模3A9A5 IgG 2a3A9F2 IgG 2a3A12D7 IgM 3A12E9 IgM4C5B4 IgM 4C5F3 IgM5E6B1 n.d. 5E6H5 n.d.7E4F9 n.d. 7E4H12 n.d.9D8F8 IgG 2a9D8G11 IgG 2a1B9B2 IgG 1 3A7G6 n.d.3B6C12 IgG 2a3B9E1 IgM，IgG(混合表達(dá))3F5H11 n.d. 4C8B2 n.d.“n.d.”---未確定實(shí)施例4檢測(cè)蛋白質(zhì)A與DTP和ATP的結(jié)合及對(duì)它們的水解；蛋白質(zhì)數(shù)量；和蛋白質(zhì)A的存在A. GTP酶和ATP酶檢測(cè)可溶性和膜結(jié)合性蛋白質(zhì)A對(duì)GTP和ATP的水解率在200微升的總體積中進(jìn)行。1.0-10.0微克As或Am，5×10-5M GTP或ATP，67-335 nM[γ-32P]GTP(2.8 Ci/mm0l)或88.8-177.5 nM[γ-32P]ATP(2.8 Ci/mmol)和20微升剝下的ROS膜(當(dāng)為Am時(shí))混合于緩沖液J(20 mM Tris-HCl，pH7.0，0.1mM EDTA)。制備被剝下的ROS膜采用的是對(duì)ROS膜用緩沖液C(100 mM MaCl，20mMTris-HCl，pH 7.0，1mM MgCl2)洗三次，并用含有0.01％聚氧乙烯23月桂醚(Brij35非離子洗滌劑，Sigma Chemical Co.)的水洗三次。在使用之前，被剝下的膜重懸浮于緩沖液D(10 MmTris-HCl，pH 7.0，0.1 mM EGTA)。
調(diào)查光對(duì)GTP或ATP的水解作用，使用的方法是雙份光暴露培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[10毫秒氙燈(Nikon)提供1.8×103μWcm-2/秒，其足以使樣品中的70％的視紫紅變白]，在暗室中的為對(duì)照。樣品在室溫下培養(yǎng)5分鐘，用200微升冰冷的淬滅緩沖液(50 nM KH2PO4，6％蘇長(zhǎng)巖A，10％TCA)淬滅。樣品置于冰上30分鐘，并在微離心機(jī)上離心5分鐘。每種上清液取等份試樣50微升，放入有5毫升閃爍液的小瓶中，檢測(cè)放射活性。在有和沒有光裂解視紫紅存在的條件下，對(duì)[γ-32P]-GTP水解進(jìn)行測(cè)定。
Am的GTP酶活性在有激活的受體存在下被增強(qiáng)。相反，對(duì)處于暗室中的培養(yǎng)物加入未光裂解的視紫紅，并沒有產(chǎn)生可以觀測(cè)到的對(duì)水解率的作用。在沒有視紫紅存在時(shí)，或存在有為白化的視紫紅時(shí)，Am只有可以忽略的GTP酶活性。
按照摩爾/摩爾計(jì)，Am對(duì)GTP的水解率(0.458 GTP/秒/Am)是可以同轉(zhuǎn)導(dǎo)(0.512 GTP/秒/Tα)相比較的，兩者都是在有光激活的視紫紅存在的條件下在亞最高速度進(jìn)行測(cè)定的。對(duì)Am的和轉(zhuǎn)導(dǎo)的GTP酶活性在兩種純化的蛋白質(zhì)以大約等摩爾濃度存在時(shí)，是催化性的。
在所有進(jìn)行的受試條件下，純化的As對(duì)GTP的水解率(GTP酶活性)相對(duì)于白化的和未白化的視紫紅為不敏感的。
對(duì)Am和As的Michaelis常數(shù)是對(duì)1千倍底物濃度測(cè)定GTP水解率而得到的。通過建立雙向交互標(biāo)繪圖和回歸分析得到Km和Vmax。數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±S.D.結(jié)果列于表2。
表2數(shù)值GTP酶 (n)ATP酶 (n)KmAs2.06±2.46×10-6M (4) 1.50+1.47×10-4M (3)KmAm2.39±1.87×10-6M (3) 1.44±0.56×10-5M(3)VmaxAsN.D.0.56(±0.09)pmol/mg蛋白質(zhì)A/分VmaxAm16.4nmol/mgAm/分 2.90(±0.16)pmol/mg蛋自質(zhì)A/分在有視紫紅存在下，對(duì)Am和As的Km值是相似的，指示對(duì)GTP的相似親和性。
未與受體結(jié)合的Am和As被發(fā)現(xiàn)具有ATP酶活性。對(duì)Am和As以及ATP酶的Km值均列于上面的表2中。比較Am的比率的常數(shù)指示其對(duì)ATP的親和性是比As的高一個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)Am和As的ATP酶和GTP酶活性的相對(duì)Km值指示GTP是水解和結(jié)合的優(yōu)選底物。
在培養(yǎng)物中加入視紫紅沒有提高任何一種蛋白質(zhì)的ATP水解率。在有激活的受體存在下，ATP酶的比率僅僅稍有降低。B. GTP結(jié)合檢測(cè)根據(jù)Northup et al.[J.Biol.Chem.，25711416-11423(1982)]的方法，對(duì)Am和As與GTP-類似物Gpp(NH)p以及GTPγS(NewEngland Nuclear)的結(jié)合進(jìn)行測(cè)定。在含有5-10微克純化蛋白質(zhì)A，15.3μm3H-Gpp(NH)p(10μCi)或1.32μM GTPγS35(1μCi)和緩沖液(100mM NaCl，0.1 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 7.0)的總體積為100μl的溶液中進(jìn)行結(jié)合。該樣品經(jīng)渦旋后在25℃培養(yǎng)30分鐘，用200微升冰冷緩沖液(0.5M NaCl，0.1 M Tris-HCl，0.1％Tween 80)淬滅，放置在冰上30分鐘。用2毫升同樣的緩沖液洗硝基纖維素過濾器，讓樣品通過該過濾器。該過濾器用2毫升冰冷的緩沖液洗5次，對(duì)放射性活性進(jìn)行檢測(cè)。
在室溫下的短暫培養(yǎng)中，Am與GTPγS和Gpp(NH)p同時(shí)結(jié)合。結(jié)果見于表3。
表3蛋白質(zhì)A的形式Gpp(NH)pGTPγS類似物/mol GTP mol蛋白質(zhì)Am 0.57±0.12 0.93As 0.29+0.08 0.47很明顯，這個(gè)方法不要求輔助因子。在所使用的試驗(yàn)條件下，Am對(duì)每種GTP類似物的結(jié)合少于化學(xué)數(shù)量。在有輔助因子存在的條件下進(jìn)行相似的培養(yǎng)，以摩爾/摩爾計(jì)，As以結(jié)合這些類似物的數(shù)量明顯地少。Am和As對(duì)GTPγS的結(jié)合比對(duì)Gpp(NH)p結(jié)合更容易。C. ATP/GTP競(jìng)爭(zhēng)腺嘌呤核苷酸對(duì)Gpp(NH)p與Am和As混合物的結(jié)合的影響被確定，根據(jù)的是蛋白質(zhì)A對(duì)ATP的結(jié)合與水解的能力。純化的Am和As被混合(2∶1)，用ATP或ADP預(yù)培養(yǎng)，在通過快速過濾進(jìn)行短暫培養(yǎng)之后，測(cè)定Gpp(NH)p的結(jié)合。如圖3所示，ATP在所有試驗(yàn)的濃度都是結(jié)合的有效抑制物。ADP在高濃度時(shí)為濃度依賴性的結(jié)合抑制物。
與腺嘌呤核苷酸對(duì)Gpp(NH)p結(jié)合的作用相反，其對(duì)蛋白質(zhì)A對(duì)GTP的水解只有可忽視的影響。然而，在微摩爾濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)GTPγS在1小時(shí)的培養(yǎng)期對(duì)ATP的水解有顯著的抑制(圖4)。GTP有類似的對(duì)ATP的水解的影響，但是小的多，指示這兩種核苷酸競(jìng)爭(zhēng)同一或近似的蛋白質(zhì)A的結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果還支持GTP對(duì)蛋白質(zhì)A的結(jié)合是比ATP更為有效的競(jìng)爭(zhēng)物。D.蛋白質(zhì)檢測(cè)根據(jù)Bradford[Anal.Biochem.，72248(1976)]的方法，使用Bio-Rad微檢測(cè)(Coomassie Brilliant Blue G-250)，對(duì)蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行確定。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。
以純化物進(jìn)行的蛋白質(zhì)檢測(cè)為基礎(chǔ)，Am相對(duì)As的補(bǔ)充為(Am/As)0.47。用高壓柱色譜(如同280nm的光密度的估計(jì)值)和slab凝膠(如同密度計(jì)的估計(jì)值)回收到的被分離的可溶物的數(shù)量比是幾乎統(tǒng)一的。這表明，如果兩種可溶性形式的是分離的基因的產(chǎn)物，則各種形式的蛋白質(zhì)A被從桿狀細(xì)胞中以相當(dāng)?shù)臄?shù)量提取出來。如果不是，則膜結(jié)合的形式就應(yīng)該是可溶性的一半濃度。E. 對(duì)蛋白質(zhì)A的檢測(cè)針對(duì)蛋白質(zhì)A產(chǎn)生的本發(fā)明的抗體被用來創(chuàng)造探察人血清中該抗原的檢測(cè)。該方法利用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)。這一檢測(cè)的一個(gè)具體形式在下面的實(shí)施例8中給出。
用于本發(fā)明的ELISA是“三明治”形式的。這個(gè)檢測(cè)需要兩種不同的對(duì)蛋白質(zhì)A為特異性的抗體，每一種抗體識(shí)別該蛋白上的不同的抗原決定基并與其結(jié)合。其中一種抗體起著“捕獲”劑的作用并且是沒有被修飾過的，用于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)96孔微滴盤小孔的底部包被。沒有被使用的那一部分的這種抗體從小孔中移出，將封閉劑[1％牛血清白蛋白(BSA)]加入到小孔中來封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。先證者的血清在準(zhǔn)備好了的小孔中培養(yǎng)1-12小時(shí)，然后移出。用洗滌劑溶液清洗小孔，將第二抗體與溶液中加入到小孔中。在該方法中使用的第二抗體物理地連接有標(biāo)記物質(zhì)如酶，例如，辣根過氧化酶(HRP)。在這個(gè)培養(yǎng)之后，移出第二抗體，再清洗小孔一次。最后的步驟包括加入適當(dāng)?shù)谋壬镔|(zhì)。
預(yù)先進(jìn)行ELISA，使用各種捕獲和共軛酶與純化的抗原(蛋白質(zhì)A)的組合來確定可能的識(shí)別位點(diǎn)的重疊，從而預(yù)測(cè)確定這些抗體對(duì)A的不同抗原決定基的特異性。
顏色發(fā)生的數(shù)量與酶聯(lián)的小孔中結(jié)合的抗體成正比，與小孔中的“捕獲”抗體結(jié)合的抗原的數(shù)量成正比。得到的結(jié)果被用分光光度計(jì)定量化，確定在預(yù)定的期間內(nèi)(一般為30-120分鐘)所產(chǎn)生的顏色量。上述的ELISA被用來試驗(yàn)正常志愿者的人血清，癌癥患者的人血清，以確定蛋白質(zhì)A抗原的存在。在該檢測(cè)中的陽性域限值用正常群體來確定。該檢測(cè)的靈敏度至少可以達(dá)到一位數(shù)的ng/mi級(jí)，這是由使用已知數(shù)量的純化的抗原建立標(biāo)準(zhǔn)靈敏度曲線而確定的。
在患者群中進(jìn)行的初步測(cè)試得到了以下的定性結(jié)果。對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果與正常人的結(jié)果進(jìn)行比較，從被診斷為肺癌、淋巴瘤、胃癌、直腸癌、腸癌、乳腺癌的患者中，得到了陽性的結(jié)果。
實(shí)施例5制備與蛋白質(zhì)A的羧基終端區(qū)起免疫反應(yīng)的兔多克隆抗體使用下述的程序制備與蛋白質(zhì)A的羧基終端區(qū)起免疫反應(yīng)的兔多克隆抗體。
在一種制備程序中，合成了已經(jīng)公開了的人蛋白質(zhì)A的羧基終端14個(gè)氨基酸的序列，QFEPQKVKEKMKNA(SEQ ID NO3)。將該合成的肽與Freunds輔劑的混合物對(duì)每個(gè)兔子在3-4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行皮下注射。每次注射的合成肽的量為50微克。兩周后，對(duì)每個(gè)已經(jīng)接種過的動(dòng)物再次于3-4個(gè)位點(diǎn)注射肽與Freunds輔劑的混合物。再過兩周后，取血樣，測(cè)定抗體在血液中對(duì)合成肽的效價(jià)。如果需要，就進(jìn)行再次注射以維持適當(dāng)?shù)难嚎贵w效價(jià)。收集具有適當(dāng)血液抗體效價(jià)的兔子的血清，以親和色譜并使用固定在固體基質(zhì)上的合成的羧基終端肽得到純化的所需抗體。將所得到的純化的抗體對(duì)水透析沉淀，以干粉的形式保藏待用。這些兔子多克隆抗體與蛋白質(zhì)A的羧基終端區(qū)域衍生出來的肽反應(yīng)，并被定名為CY2A抗體。
在另外一個(gè)程序中，合成制造了蛋白質(zhì)A羧基終端的約1 6個(gè)氨基酸的肽序列。然后，將這個(gè)肽與有力的免疫刺激物(輔劑)分子關(guān)鍵點(diǎn)缺陷血清蛋白[Keyhole Limpet Hemacyanin(KLN)]共軛。肽-KLN共軛體按照產(chǎn)生抗體的正常程序注射給兔子。隨后，取出兔子的血，測(cè)試血清，結(jié)果顯示對(duì)作為免疫源的蛋白質(zhì)A羧基終端肽為陽性。這些兔子多克隆抗體被定名為CPDD抗體。
實(shí)施例6測(cè)定液體樣品中的蛋白質(zhì)A為了測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)A，使用下述程序之一A.對(duì)含有實(shí)施例3的一種單克隆抗體(3B9E1抗體)的溶液取等份試樣，放入96孔滴定盤的每一個(gè)小井中，放置至干燥，留下的抗體附著在每一個(gè)小井的底部。向每一個(gè)小井中加入1％牛血清白蛋白溶液的等份試樣進(jìn)行封閉。取出殘余的液體。每一種受試樣品各取50-100微升，放入指定的小井，在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。棄去液體，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)清洗小井。對(duì)連有辣根過氧化物酶的實(shí)施例5的抗體(CY2A抗體)的標(biāo)準(zhǔn)溶液取等份試樣，加入到每個(gè)小井中，室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。移去液體，用PBS清洗每個(gè)小井。最后，加入辣根過氧化物酶底物和2，2’-連氮基-二-[3-乙基-苯基噻唑啉磺酸酯(6)]二銨鹽(ABTS)的等份試樣，于37℃反應(yīng)1小時(shí)。用410nm處的分光光度計(jì)定量每個(gè)小井中的顏色。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線將這些顏色結(jié)果轉(zhuǎn)換為單位。
B.在另一個(gè)程序中，使用了生物素/鏈霉抗生物素蛋白的測(cè)定系統(tǒng)。實(shí)施例5的CPDD抗體首先用化學(xué)方式與生物素共價(jià)共軛。將激活的生物素的N-羥基-琥珀酰亞胺酯與純化的抗體反應(yīng)，使生物素分子與抗體分子的伯胺共價(jià)結(jié)合。以色譜去除未反應(yīng)的生物素。然后對(duì)抗體用免疫抗原滴定，確定最佳的檢測(cè)稀釋。
總的來講，這些程序按照如下進(jìn)行生物素化的抗體首先與其目標(biāo)抗原結(jié)合。同時(shí)，固定在固體支持物(滴定盤)上的第二抗體也捕獲到同樣的抗原。清洗除掉未反應(yīng)的抗體，抗體抗原生物素化的抗體的復(fù)合物與共軛有報(bào)道分子的鏈霉抗生物素蛋白發(fā)生反應(yīng)，報(bào)道分子一般是酶，例如辣根過氧化物酶。再次進(jìn)行清洗，去除未結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白酶。對(duì)酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白為特異性的底物被允許同余下的鏈霉抗生物素蛋白酶復(fù)合物反應(yīng)。底物被水解為產(chǎn)色的產(chǎn)物的數(shù)量與樣品中抗原的數(shù)量成正比。
生物素/鏈霉抗生物素檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是抗體可以被多個(gè)生物素分子標(biāo)記，但不損失抗體活性。每一個(gè)抗體分子上有一個(gè)以上生物素分子這一事實(shí)，使得信號(hào)在通過隨后的多個(gè)鏈霉抗生物素分子的結(jié)合而被放大了。
具體講，使用生物素化的抗體的程序按照如下進(jìn)行含有實(shí)施例3的一種單克隆抗體(3B9E1抗體)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的等份試樣放入滴定盤的每一個(gè)小井中。讓抗體吸附到每個(gè)小井的底面和側(cè)壁。吸出每一個(gè)小井中的剩余溶液，含有20％蔗糖的1％牛血清白蛋白溶液的等份試樣被加入到每一個(gè)小井中進(jìn)行封閉。移出殘余液體。
隨后的試劑被升溫至室溫?；颊叩臉悠?EDTA血漿)被混合，如果發(fā)現(xiàn)有任何顆粒物質(zhì)，通過離心使液體清晰。將50微升患者血漿的等份試樣與在0.05M磷酸鹽緩沖生理鹽水pH 7.4中的帶有1 mg/mL牛血清白蛋白的生物素化的CPDD兔多克隆抗體200微升相混合，加入到每一個(gè)小井中。讓這些液體在小井中反應(yīng)2小時(shí)。然后吸出液體，清洗小井3次，每次吸出液體。
到達(dá)程序的這一點(diǎn)時(shí)，向每個(gè)小井中加入鏈霉抗生物素蛋白辣根過氧化物酶共軛體200微升，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。如上對(duì)小井清洗3次。這一步驟之后，將200微升的四甲基-聯(lián)苯胺底物用移液管加入到每個(gè)小井中，室溫下培養(yǎng)20分鐘。然后，加入100微升停止溶液(0.05N硫酸)。用雙波長(zhǎng)滴定盤分光光度計(jì)在450/630nm處讀取每個(gè)小井的光吸收。計(jì)算每個(gè)樣品的平均吸收值。(如果進(jìn)行的重復(fù)樣品試驗(yàn)的讀數(shù)的差異超過10％，重新對(duì)該樣品進(jìn)行試驗(yàn))。樣品的讀數(shù)超出測(cè)量范圍的，經(jīng)過稀釋后重新檢測(cè)。用對(duì)照的平均值除以每個(gè)樣品的平均值，得到P/N值。P/N值大于2.0的樣品被報(bào)道為陽性。
為了建立陰性對(duì)照值(N)的基線，對(duì)40個(gè)陰性樣品以雙份進(jìn)行檢測(cè)，確定最適宜的建立在陰性和陽性之間的劃界。去掉兩個(gè)最高和兩個(gè)最低的樣品數(shù)值，計(jì)算幾何平均值，對(duì)剩余的樣品重新計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)陽性的劃界點(diǎn)被人為地定在剩余樣品的平均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的地方。巧合的是，平均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的結(jié)果非常接近平均值的2倍。因此，對(duì)有些檢測(cè)的陽性劃界就定為用所謂P/N比值為2.0，即未知樣品的數(shù)值被陰性對(duì)照樣品的平均值所除的結(jié)果。
此后，建立陰性人血清群，作為檢測(cè)對(duì)照/標(biāo)準(zhǔn)。這些材料的平均吸收值基本與上述陰性樣品的幾何平均值相等。因此，將該陰性對(duì)照根據(jù)陰性血清進(jìn)行校正，作為檢測(cè)對(duì)照。對(duì)每一個(gè)檢測(cè)都進(jìn)行雙份的所述對(duì)照群檢測(cè)，以陽性劃界計(jì)算的平均吸收值為陰性對(duì)照的平均值的2倍。
實(shí)施例7探察轉(zhuǎn)移性癌癥的篩選程序收集多個(gè)個(gè)體的血樣品。在該個(gè)體組中，有被診斷為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，從對(duì)照群中選取的沒有癌癥的個(gè)體，以及曾經(jīng)被診斷為患有癌癥但是在采取血樣的時(shí)候被診斷為所患有的乳腺癌正在消退的個(gè)體。
每一個(gè)體的樣品的一部分被用來作為實(shí)施例6A的檢測(cè)樣品。對(duì)這些個(gè)體的血液樣品的檢測(cè)結(jié)果見于表4。
表4檢測(cè)結(jié)果樣 品 診 斷(ng蛋白質(zhì)A/ml血)gis 對(duì)照2.4afb 對(duì)照7.6sac 對(duì)照2.4CY 02NED(前列腺) 1.8CY 02對(duì)照1.62對(duì)照3.53對(duì)照9.76對(duì)照8.87對(duì)照2.88對(duì)照7.14NED 4.71NED 3.59NED 3.85NED 3.318 Mets；no chemo 15.749 Mets；no chemo 3.7132 Mets；no chemo 12.7423 Mets；no chemo 24.3424 Mets；no chemo 26.4515 Mets；no chemo 59.0541 Mets；no chemo 22.3在診斷中，NED指的是沒有發(fā)病的證據(jù)。這些檢測(cè)的結(jié)果還反映在圖1中。作為對(duì)照的和被診斷為癌癥正在消退的個(gè)體結(jié)果之和的平均值是4.5ng蛋白質(zhì)A/ml血液?；加修D(zhuǎn)移性癌癥的個(gè)體的檢測(cè)結(jié)果平均值為23.4ng蛋白質(zhì)A/ml血液。只有一個(gè)例外，即有一個(gè)被診斷為轉(zhuǎn)移性癌癥患者的的檢測(cè)結(jié)果在對(duì)照和NED范圍內(nèi)，所有的檢測(cè)結(jié)果都可以被清楚地劃分為兩組沒有癌癥跡象的個(gè)體組和患有轉(zhuǎn)移性癌癥的個(gè)體組。這樣的分界是不常見的。這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性為p＜0.001，t實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例8對(duì)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥測(cè)定的篩選在擴(kuò)展的篩選程序中，選用了800名患者的血漿樣品進(jìn)行實(shí)施例6B的檢測(cè)?；颊呷褐邪]有癌癥的個(gè)體(對(duì)照)，各種階段癌癥患者，轉(zhuǎn)移性癌癥患者，良性瘤患者。篩選程序是采用盲點(diǎn)方式進(jìn)行的，對(duì)蛋白質(zhì)A的檢測(cè)結(jié)果隨后對(duì)照獨(dú)立的臨床診斷結(jié)論以確認(rèn)檢測(cè)。
這個(gè)篩選的結(jié)果列于表5。給出了癌癥的種類，階段，以及患有癌癥的個(gè)體的數(shù)目，該數(shù)目用對(duì)照獨(dú)立臨床診斷結(jié)果來校正。
表5癌癥類型 檢測(cè)陽性/總樣品數(shù)乳腺癌24/35＝69％第1階段1/6第2階段3/4第4階段1/2？ 19/23原發(fā)性肝癌17/25＝68％第2階段 1/1第3階段 5/7第3b階段1/1第4階段 2/4第4a階段7/9第4b階段1/3癌癥類型 檢測(cè)陽性/總樣品數(shù)胰腺癌6/9＝67％第4階段6/8第4a階段 0/1前列腺24/41＝61％ 第D2階段 0/2？ 25/39膀胱癌11/19＝58％淋巴瘤18/32＝56％ 第？階段2/3第1階段 0/1第1a階段1/1第1b階段0/1第2a階段1/4第2B階段0/1第2bc階段 1/1第2c階段1/1第2ca階段 1/1第3b階段3/4第4階段 3/6第4a階段0/1第4B階段4/4第4b階段1/3頭頸癌9/16＝56％第3階段 1/2第4階段 4/10第？階段4/4肺癌 41/91＝45％第1階段 4/5第2階段 2/4第3a階段2/5第3b階段6/1 3第4階段 10/27第ED階段4/6第LD階段2/7第？階段11/24癌癥類型 檢測(cè)陽性/總樣品數(shù)結(jié)腸和直腸癌 17/43＝40％第2階段 0/1第4階段 1/3第BI階段2/2第B2階段1/4第C2階段2/4第D階段 3/3第？階段8/26白血病10/26＝38％多發(fā)性骨髓瘤 5/5＝100％第3a階段3/3第3b階段2/2子宮內(nèi)膜癌5/5＝100％第4階段 1/1第？階段4/4腮腺癌4/4＝100％膽道癌3/10＝30％第3階段 1/1第4階段 2/8第4a階段0/1腎癌 2/6＝33％第3階段 1/2第4階段 1/2第？階段0/2子宮頸癌 3/4＝75％第4階段 1/1第4a階段1/1第？階段1/2癌癥類型 檢測(cè)陽性/總樣品數(shù)甲狀腺癌 2/3＝67％第1階段1/1第4階段1/2腦瘤 4/6＝67％口腔癌2/3＝67％子宮癌2/7＝29％轉(zhuǎn)移性癌癥2/7＝29％(未知起源)黑素瘤2/2＝100％第4階段2/2卵巢癌0/2＝0％腹癌 1/2＝50％尿道癌0/2＝0％舌癌 1/3＝33％唇癌 1/1＝100％肛門癌1/1＝100％骨盆癌1/1＝100％腹股溝癌 1/1＝100％陰莖癌1/1＝100％胸腔癌1/1＝100％輸卵管癌 1/1＝100％癌癥類型 檢測(cè)陽性/總樣品數(shù)肉瘤2/7＝29％POEMS 1/1＝100％喉癌0/2＝0％生殖細(xì)胞癌 0/1＝0％脊椎癌 0/1＝0％睪丸癌 0/1＝0％陰門癌 0/1＝0％脾癌0/1＝0％癌癥總計(jì)262/518＝51％此外，本檢測(cè)還在正常個(gè)體(沒有癌癥)和有良性瘤的個(gè)體中進(jìn)行。結(jié)果列于表6，其中“矯正”檢測(cè)值是(正確地確定該個(gè)體沒有癌癥)當(dāng)該個(gè)體的P/N值等于或小于2.0。
表6檢測(cè)結(jié)果低抗原數(shù)量/樣品總數(shù)正常174/205＝85％良性瘤 70/108＝65％這些檢測(cè)的結(jié)果表示該檢測(cè)程序具有辨別癌癥患者和不是癌癥患者的能力。用該檢測(cè)可以探察原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥。各個(gè)階段的癌癥，包括第一階段和第二階段的癌癥都可以被檢測(cè)。特別是乳腺癌、前列腺癌、原發(fā)性肝癌、淋巴癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、多發(fā)骨髓瘤癌都可以用本檢測(cè)來探察。等價(jià)方案精通工藝的人都會(huì)承認(rèn)或者利用不多于例行試驗(yàn)次數(shù)的試驗(yàn)就能確定在此具體介紹的本發(fā)明實(shí)施方案有許多等價(jià)方案。這些等價(jià)方案已被納入權(quán)利要求范圍。序列數(shù)據(jù)(1)概況(i)申請(qǐng)人(A)名稱 Schepens Eye Research Institute(B)街道 20 Staniford Street(C)城市 波士頓(D)州/省 馬薩諸塞州(E)國(guó)家 美國(guó)(F)郵政編碼02114(G)電話617-742-3410(H)傳真617-720-1069(i)申請(qǐng)人(A)名稱CYTRA CORPORATION(B)街道 82 Beachside Avenue(C)城市 Greens Farms(D)州/省康涅狄格州(E)國(guó)家 美國(guó)(F)郵政編碼06436(G)電話203-259-6876(H)傳真203-255-23 86(i)申請(qǐng)人/發(fā)明人(A)名稱 Geoffrey J.Schmidt(B)街道73 Tiffany Road(C)城市Norwell(D)州/省 馬薩諸塞州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼02061(i)申請(qǐng)人/發(fā)明人(A)名稱 Kenneth L. Hoffman(B)街道95 Comstock Drive(C)城市Wrentham(D)州/省 馬薩諸塞州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼02093(ii)發(fā)明名稱 以蛋白質(zhì)A對(duì)癌癥的診斷(iii)序列數(shù)目3(iv)通訊地址(A)地址Hamilton，Brook，Smith&Reynolds，P.C.
(B)街道Two Militia Drive(C)城市列克星頓市(D)州 馬薩諸塞州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編02173(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)存儲(chǔ)形式軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)的信息(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/370,969(B)申請(qǐng)日1995年1月10日(viii)律師/代理人(A)姓名 Wagner，Richard W.
(B)代理號(hào)34，480(C)案卷號(hào)SERI88-01A3 PCT(ix)通訊(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列的特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列的表述 SEQ ID NO1Gly Asn Ser Lys Ser Gly Ala Leu Ser Lys Glu Ile Leu Glu Glu Leu Gln1 5 10 15(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列的特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列的表述 SEQ ID NO2Met Gly Asn Ser Lys Ser Gly Ala Leu Ser Lys Glu Ile Leu Glu Glu Leu.Gln1 5 10 15(4)SEQ ID NO3的信息(i)序列的特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列的表述 SEQ ID NO3Gln Phe Glu Pro Gln Lys Val Lys Glu Lys Met Lys Asn Ala15 10
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)個(gè)體的癌癥的方法，該方法包括a)從所述個(gè)體獲取生物學(xué)樣品；b)將所述樣品與至少一種與蛋白質(zhì)A發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體一起培養(yǎng)；c)檢測(cè)步驟b)所產(chǎn)生的免疫共軛物；以及d)將步驟c)檢測(cè)到的免疫共軛物的數(shù)量對(duì)癌癥進(jìn)行評(píng)定，當(dāng)所述的數(shù)量超過域限值就被定為患有癌癥。
2.一種檢測(cè)個(gè)體的癌癥的方法，該方法包括a)從所述個(gè)體獲取液體樣品；b)對(duì)所述液體樣品進(jìn)行三明治抗體檢測(cè)，其中的兩種抗體中的一種是與具有蛋白質(zhì)A的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，另一種抗體是與所述的具有蛋白質(zhì)A的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽以外的蛋白質(zhì)A的部分發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體；c)檢測(cè)步驟b)所產(chǎn)生的抗體-蛋白質(zhì)A三明治的數(shù)量；以及d)將該個(gè)體的所述數(shù)量對(duì)癌癥進(jìn)行評(píng)定，當(dāng)所述的數(shù)量超過域限值就被定為患有癌癥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的抗體中的至少一種為單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的與所述的具有蛋白質(zhì)A的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽以外的蛋白質(zhì)A的部分發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體是單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其中所述的與所述的具有蛋白質(zhì)A的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體是連接有檢測(cè)標(biāo)記的多克隆抗體。
6.據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述液體樣品中的液體是血液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中a)與所述的具有蛋白質(zhì)A的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽以外的蛋白質(zhì)A的部分發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體是黏附到固體表面上的單克隆抗體；以及b)與所述的具有蛋白質(zhì)A的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體是連接有檢測(cè)標(biāo)記的多克隆抗體。
8.據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的連接的檢測(cè)標(biāo)記物是生物素。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的域限值是陰性對(duì)照平均值的2.0倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的癌癥選自乳腺癌、前列腺癌、原發(fā)性肝癌、淋巴癌、胰腺癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌和多發(fā)性骨髓瘤。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)A的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列是蛋白質(zhì)A的氨基酸序列的142-158或者是蛋白質(zhì)A的羧基終端的16個(gè)氨基酸。
12.一種檢測(cè)癌癥診斷性蛋白質(zhì)的方法，其中所述的蛋白質(zhì)在個(gè)體的血液中的增高水平預(yù)示該個(gè)體患有癌癥，該方法包括a)培養(yǎng)所述個(gè)體的液體樣品、與具有所述癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體、與所述的癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽以外的癌癥診斷蛋白質(zhì)的部分發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，從而形成所述癌癥診斷蛋白質(zhì)與所述兩種蛋白質(zhì)的免疫復(fù)合物；以及b)測(cè)定步驟a)中所形成的免疫復(fù)合物的數(shù)量。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的液體樣品中的液體是血液。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的液體樣品與所述的兩種抗體一起培養(yǎng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中a)所述的與具有癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體連接有檢測(cè)標(biāo)記物的多克隆抗體；以及b)與所述的具有癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽以外的癌癥診斷蛋白質(zhì)的部分發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體是黏附到固體表面上的單克隆抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的連接的檢測(cè)標(biāo)記物是生物素。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的液體樣品與所述的兩種抗體同時(shí)培養(yǎng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的液體樣品首先與所述的與具有癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽以外的癌癥診斷蛋白質(zhì)的其它部分發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體共同培養(yǎng)，然后與所述的與具有癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體共同培養(yǎng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中a)所述的與具有癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽以外的癌癥診斷蛋白質(zhì)的其它部分發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體是連接到固體表面的單克隆抗體；并且b)所述的與具有癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體是連接了檢測(cè)標(biāo)記物的多克隆抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的癌癥診斷蛋白質(zhì)是生物素。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的免疫復(fù)合物的數(shù)量是陰性對(duì)照的平均數(shù)值的2.0倍以上就預(yù)示該個(gè)體患有癌癥。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列是癌癥診斷蛋白質(zhì)的氨基酸序列的142-158或者是所述癌癥診斷蛋白質(zhì)的羧基終端的16個(gè)氨基酸。
23.一種對(duì)個(gè)體檢測(cè)轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，該方法包括a)從所述個(gè)體獲得生物學(xué)樣品；b)將所述的生物學(xué)樣品與至少一種與蛋白質(zhì)A起免疫反應(yīng)的抗體一起培養(yǎng)；c)檢測(cè)所述步驟b)所產(chǎn)生的免疫共軛物；其中在步驟c)中檢測(cè)到非正常大量的免疫共軛物預(yù)示著該個(gè)體患有轉(zhuǎn)移性癌癥。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的生物學(xué)樣品是血液。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的癌癥是乳腺癌。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的抗體中的一種是3B9E1，另一種是抗體CY2a。
27.一種結(jié)合蛋白質(zhì)A形成免疫共軛物的抗體，其中所述的免疫共軛物的非正常大量預(yù)示著提供生物學(xué)樣品的個(gè)體患有癌癥。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的抗體，其中所述的生物學(xué)樣品是血液。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的抗體，其中所述的抗體選自抗體3B9E1、抗體CY2a和抗體CPDD。
30.一種檢測(cè)個(gè)體癌癥的測(cè)試盒，包括a)與具有癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽發(fā)生免疫反應(yīng)的第一抗體；以及b)與具有癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列的肽以外的部分發(fā)生免疫反應(yīng)的第二抗體。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的測(cè)試盒，其中所述的第一抗體或第二抗體連接有鑒定標(biāo)記物。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的測(cè)試盒，其中所述的第一抗體和第一抗體中的至少一種是單克隆抗體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的測(cè)試盒，其中所述的第一抗體是連接有鑒定標(biāo)記物的多克隆抗體并且所述的第二抗體是黏附到固體表面的單克隆抗體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的測(cè)試盒，其中所述的連接的鑒定標(biāo)記物是生物素。
35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的測(cè)試盒，其中所述的癌癥診斷蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)A。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的測(cè)試盒，其中所述的癌癥診斷蛋白質(zhì)的大約16個(gè)氨基酸的特殊序列是癌癥診斷蛋白質(zhì)的氨基酸序列的142-158或者是所述癌癥診斷蛋白質(zhì)的羧基終端的16個(gè)氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明揭示了病患者的樣品中，例如，血液樣品中存在非正常大含量的蛋白質(zhì)A是患有癌癥的診斷指標(biāo)。蛋白質(zhì)A是最容易用特異性抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)來檢測(cè)其存在的。優(yōu)選的檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)A存在的程序是使用兩種分別對(duì)蛋白質(zhì)A不同抗原決定區(qū)域具有特異性的抗體的三明治式(Sandwich)檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1168176SQ96191397
公開日1997年12月17日 申請(qǐng)日期1996年1月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月10日
發(fā)明者杰弗里·J·司克米德, 肯尼斯·L·霍夫曼 申請(qǐng)人:司科彭斯眼部研究學(xué)會(huì), 希恰公司