專利名稱：一種防治血栓性疾病的新的蛇毒類凝血酶結(jié)構(gòu)及純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種源于尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的防治血栓性疾病的蛇毒類凝血酶(TLE)的結(jié)構(gòu)及其純化方法，具體的講，其涉及一種從武夷山尖吻蝮蛇毒中提取的TLE的結(jié)構(gòu)特征及其純化方法，可用于治療腦血栓、血栓閉塞性脈管炎、急性腦梗塞等血栓性疾病。
Ouyang,C等于1967年首先發(fā)現(xiàn)尖吻蝮蛇毒中含有TLE，并于1971年分離純化出一個TLE，對理化性質(zhì)及凝血性質(zhì)進行了全面的研究，確定該酶分子量為33500，由17種氨基酸組成(Ougang C,et al,Purificationand properties of the anticoagulant principle of Agkistrodon acutus venom,Biochim.et Biophys.Acta 1972,278；155-162)。劉廣芬等對福建產(chǎn)尖吻蝮蛇毒進行層析分離及活力測定，11個組分中有2個組分具TLE活力。藤國強等對皖南尖吻蝮蛇蛇毒分離，發(fā)現(xiàn)有3個組分具有TLE活力。肖昌華等對福建、湖南、浙江的尖吻蝮蛇毒進行研究，從中分離出4個具有TLE活力的組分(肖昌華、何麗芬、唐紹宗等，尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶樣成分的研究，動物學研究1986,4月；9(11):51～58)。以上研究主要集中在理化性質(zhì)和藥理作用，并開發(fā)出系列新藥，但由于沒有分離出純TLE，無法進行結(jié)構(gòu)測定，所以有關(guān)TLE的重要結(jié)構(gòu)特征-N端氨基酸序列一直未見有進一步的報道。
國外已將TLE應(yīng)用于臨床治療血栓性疾病。Ancrod是紅口蝮蛇蛇毒TLE的商品名，首先由Ewart等人純化得到，Latallo對其臨床應(yīng)用作了大量的研究。Batroxobin是南美矛頭蝮蛇毒中的TLE,Hollemand等人對其酶學性質(zhì)及生理特征開展了詳細的研究(J.Biol.Chem.1976,251,1663-1669)，由日本及瑞典開發(fā)成臨床用藥并已廣泛應(yīng)用。這兩種蛇毒TLE的N端氨基酸序列及基因序列已公開發(fā)表，但基因工程產(chǎn)品未見報道。以上兩種蛇的TLE均是由單條多肽鏈構(gòu)成。
蛇毒TLE主要來自蝮亞科蛇毒，臨床實踐發(fā)現(xiàn)尖吻蝮蛇蛇毒的TLE有最好的療效。但是，從蛇毒中提取TLE有兩大缺點一是蛇毒資源緊缺，二是生產(chǎn)純化難度大。如能采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)，則可克服這兩大缺點。實現(xiàn)該藥基因工程化的關(guān)鍵是很難得到高純度的TLE。因為只有得到高純度的TLE，才能測定其結(jié)構(gòu)，從而為開發(fā)TLE的基因工程產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明目的在于提供防治血栓性疾病的新的尖吻蝮蛇毒TLE的N-端氨基酸序列。
本發(fā)明目的還在于提供防治血栓性疾病的新的尖吻蝮蛇毒TLE的準確的理化及藥理性質(zhì)，以利于用于制備藥物。
本發(fā)明的目的尚在于提供純化一種新的尖吻蝮蛇毒TLE的方法。
為解決上述任務(wù)，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種防治血栓性疾病的類凝血酶，其特征在于N-末端氨基酸殘基的排列順序為N-DSPSPWGWYDYDQYQ，其由兩條相同的亞基組成，分子量為30298Da，最適pH為7.0～7.5，穩(wěn)定pH為4.0～9.0。
一種防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，主要包括依次進行如下柱層析(1)DEAE柱層析；(2)Mono Q柱層析，或者SOURCE Q柱層析；(3)RESOURCE RPC柱層析。
上述防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，其特征在于蛇毒溶液經(jīng)DEAE柱層析純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH8.2～8.8的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/L NaCl的A液，流速為3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
蛇毒溶液經(jīng)DEAE柱層析純化，還可選擇的層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH7.2～7.8的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/L NaCl的A液，流速為3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
上述的防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，其特征在于DEAE柱層析純化所得組分經(jīng)Mono Q柱進行純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH7.8～8.2的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/L NaCl的A液，流速1ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
上述的防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，其特征在于DEAE柱層析純化所得組分也可經(jīng)SOURCE Q柱進行純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH7.8～8.2的Tris-HCl緩沖液，B為含0.3mol/LNaCl的A液，流速3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
經(jīng)Mono Q或SOURCE Q柱純化所得組分再經(jīng)RESOURCE RPC柱層析純化，層析條件為流動相A為含0.1％TFA的水溶液，B為含0.1％TFA的乙腈溶液，流速為3ml/min采用二元梯度洗脫，B％( )。
本發(fā)明純化的蛇毒類凝血酶，可用于制備治療血栓性疾病的藥物。
該防治血栓性疾病的酶的純化方法，在按常規(guī)進行武夷山尖吻蝮蛇毒的溶解，離心，透析，過濾后，如上所述具體有兩種純化途徑(1)依次進行DEAE柱層析，Mono Q柱層析，RESOURCE RPC柱層析；或者(2)依次進行DEAE柱層析，SOURCE Q柱層析，RESOURCE RPC柱層析。
純化后的蛇毒類凝血酶，由兩條相同的亞基組成，用質(zhì)譜測其分子量為30298Da，用PE-ABD 491A蛋白質(zhì)N-端測序儀測其N-端氨基酸殘基的排列順序為N-DSPSPWGWYDYDQYQ，最適pH為7.0～7.5，穩(wěn)定pH為4.0～9.0。N-端氨基酸殘基的排列順序的確定，為開發(fā)TLE的基因工程產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)，從而有可能克服長久以來沒有解決的蛇毒資源緊缺、生產(chǎn)純化難度大的困難。純TLE提供了準確的理化、藥理性質(zhì)數(shù)據(jù)，使制備藥品時，能夠更準確地把握藥物的性質(zhì)，更好地保證藥品質(zhì)量，為藥品制備過程中工藝選擇、質(zhì)量控制和臨床安全用藥、合理用藥提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
常規(guī)體內(nèi)藥效學實驗證明新的蛇毒類凝血酶能抑制大鼠頸動脈血栓形成，并對家兔耳緣靜脈血栓有明顯的溶栓作用。
1、新的蛇毒類凝血酶對大鼠頸動脈血栓形成的影響大鼠頸動靜脈(A-V)回路形成的血小板性動脈血栓模型(徐叔云等，藥理實驗方法學，人民衛(wèi)生出版社，1994,1:1124)。
取SD大鼠6只，分成兩組，陰性對照組ⅳ 0.9％NaCl1.0ml/kg，實驗組ⅳ蛇毒類凝血酶2U/kg，各組用藥3小時后ip戊巴比妥鈉35mg/kg麻醉，仰臥固定，氣管插管，分離出左頸動脈及右頸動脈。取一內(nèi)徑為2.0mm,長6.0mm聚乙烯管，內(nèi)套同一長度的7號絲線，并充滿肝素生理鹽水(25U/kg)以供血栓形成之用。另取一聚乙烯管插入左頸動脈，一聚乙烯管插入右頸動脈，并注入肝素25U/kg作全身抗凝，然后套上內(nèi)有絲線并充滿肝素生理鹽水的聚乙烯管，以形成A-V回路。手術(shù)完畢，開放頸動脈血流15分鐘，中斷血流，拔下管套，立即取出絲線用濾紙吸干殘血，精密稱重，即為血栓濕重。實驗結(jié)果，生理鹽水對照組血栓濕重為27.70±2.52mg，蛇毒類凝血酶組17.00±7.10mg，給藥組與對照組有明顯差異(P＜0.01)，說明蛇毒類凝血酶對血小板性動脈血栓形成具有明顯的抑制效應(yīng)。
2、新的蛇毒類凝血酶對家兔靜脈血栓的溶栓作用實驗方法取白毛家兔24只，體重1.5-2.5kg，雌雄兼用，均分為4組。取一側(cè)耳外緣靜脈量取4cm長度并作標記，然后注入牛凝血酶40u/0.2ml，同時壓緊耳根部，阻止靜脈血流10min，此時耳外緣、中及內(nèi)緣靜脈中均有血栓形成，外觀呈黑色，壓之不退，于血栓形成后30min，4組動物自另一側(cè)耳級靜脈分別注入新的TLE2u、4u/kg，陽性對照藥尿激酶3萬u/kg和陰性對照生理鹽水4ml/kg。然后，每隔30min觀察耳外緣靜脈血栓長度及寬度，直至血檢消退。
結(jié)果用牛凝血酶誘導的耳緣靜脈血栓，生理鹽水組的消退時間為8.6±1.3(小時)，新的TLE2u和4u/kg的消退時間分別為4.1±1.0(小時)及3.0±0.6(小時)，與對照組有非常顯著的差異(P＜0.01)，并呈量效關(guān)系。尿激酶組消退時間為4.5±0.5(小時)，5對照組亦有非常顯著的差異(P＜0.01)。
圖面說明

圖1新的蛇毒類凝血酶的SDS-PAGE電泳2新的蛇毒類凝血酶反相高效液相色譜3新的蛇毒類凝血酶還原與非還原電泳比較圖實施例1材料及設(shè)備(下例同)蛇毒采自武夷山尖吻腹。
HiPrep 16/10 DEAE,MonoQ 5/5 HR,SOURCE Q、RESOURCERPC均為安法瑪西亞生產(chǎn)。
層析采用AKTAexpdorer蛋白質(zhì)快速純化系統(tǒng)，安法瑪西亞生產(chǎn)。
將蛇毒5克溶解在50ml 0.01mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液中，待充分溶解后將其于7000rpm條件下離心15分鐘，取上清液于0.01mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液中透析，將透析后的溶液稀釋5倍后用0.22μm的微孔濾膜過濾。濾液經(jīng)DEAE柱層析純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/L NaCl的A液，流速為3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。DEAE柱層析純化所得組分經(jīng)Mono Q柱進行純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH8.0的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/L NaCl的A液，流速1ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。Mono Q柱層析純化所得組分經(jīng)RESOURCERPC柱層析純化，層析條件為流動相A為含0.1％TFA的水溶液，B為含0.1％TFA的乙腈溶液，流速為3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
實施例2將蛇毒5克溶解在50ml 0.01mol/L,pH8.2的Tris-HCl緩沖液中，待充分溶解后將其于7000rpm條件下離心15分鐘，取上清液于0.01mol/L,pH8.2的Tris-HCl緩沖液中透析，將透析后的溶液稀釋5倍后用0.22μm的微孔濾膜過濾。濾液經(jīng)HiPrep 16/10 DEAE柱層析純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH8.2的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/L NaCl的A液，流速為3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。DEAE柱層析純化所得組分經(jīng)SOURCE Q柱進行純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH8.0的Tris-HCl緩沖液B為金0.3mol/L NaCl的A液，流速3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。SOURCE Q柱純化所得組分經(jīng)RESOURCE RPC柱層析純化，層析條件為流動相A為含0.1％TFA的水溶液，B為含0.1％TFA的乙腈溶液，流速為3ml/min采用二元梯度洗脫，B％( )。
實施例3將蛇毒5克溶解在0.01mol/L,pH8.5的Tris-HCl緩沖液中，待充分溶解后將其于7000rpm條件下離心15分鐘，取上清液于4℃透析，透析液為0.01mol/L，pH8.5的Tris-HCl緩沖液，將透析后的溶液稀釋5倍后用0.22μm的微孔濾膜過濾。取濾液20ml經(jīng)HiPrep 16/10 DEAE柱層析純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH8.5的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/L NaCl的A液，流速為3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。HiPrep 16/10 DEAE柱層析純化所得組分經(jīng)SOURCE Q柱進行純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH8.0的Tris-HCl緩沖液，B為含0.3mol/L NaCl的A液，流速3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。SOURCE Q柱純化所得組分經(jīng)RESOURCE RPC柱層析純化，層析條件為流動相A為含0.1％TFA的水溶液，B為含0.1％TFA的乙腈溶液，流速為3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
純化后的蛇毒類凝血酶純度鑒定SDS-PAGE電泳呈現(xiàn)一條帶(圖1)；反相高效液相呈現(xiàn)一個峰(圖2)；純化后的蛇毒類凝血酶，用質(zhì)譜測其分子量為30298Da，用PE-ABD491A蛋白質(zhì)和多肽序列儀測其N-端氨基酸殘基的排列順序為N-DSPSPWGWYDYDQYQ。還原與非還原電泳比較知，新的蛇毒類凝血酶由兩條相同的亞基組成(圖3)。體內(nèi)藥效學實驗證明蛇毒類凝血酶抑制大鼠動脈血栓的形成，并對家兔耳緣靜脈血栓有明顯的溶栓作用。
權(quán)利要求
1．一種防治血栓性疾病的類凝血酶，其特征在于N-末端氨基酸殘基的排列順序為N-DSPSPWGWYDYDQYQ。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治血栓性疾病的類凝血酶，其特征在于由兩條相同的亞基組成，分子量為30298Da，最適pH為7.0～7.5，穩(wěn)定pH為4.0～9.0。
3．一種防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，主要包括依次進行如下柱層析(1)DEAE柱層析；(2)Mono Q柱層析，或者SOURCE Q柱層析；(3)RESOURCE RPC柱層析。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，其特征在于蛇毒溶液經(jīng)DEAE柱層析純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH8.2～8.8的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/LNaCl的A液，流速為3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，其特征在于蛇毒溶液經(jīng)DEAE柱層析純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH7.2～7.8的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/LNaCl的A液，流速為3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，其特征在于DEAE柱層析純化所得組分經(jīng)Mono Q柱進行純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH7.8～8.2的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol/L NaCl的A液，流速1ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
7．根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，其特征在于DEAE柱層析純化所得組分經(jīng)SOURCE Q柱進行純化，層析條件為流動相A為0.01～0.02mol/L,pH7.8～8.2的Tris-HCl緩沖液，B為含0.3mol/L NaCl的A液，流速3ml/min，采用二元梯度洗脫，B％( )。
8．根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治血栓性疾病的類凝血酶的純化方法，其特征在于經(jīng)Mono Q或SOURCE Q柱純化所得組分再經(jīng)RESOURCE RPC柱層析純化，層析條件為流動相A為含0.1％TFA的水溶液，B為含0.1％TFA的乙腈溶液，流速為3ml/min采用二元梯度洗脫，B％( )。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛇毒類凝血酶，其特征在于可用于制備防治血栓性疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種源于尖吻蝮蛇毒的防治血栓性疾病的新的類凝血酶(TLE)的N－端氨基酸序列及其純化方法,該酶由兩條相同的亞基組成,分子量為30298Da,最適pH為7.0～7.5,穩(wěn)定pH為4.0～9.0,其N－端15個氨基酸殘基序列為N－DSPSPWGWYDYDQYQ,能有效抑制大鼠動脈血栓的形成,并對家兔耳緣靜脈血栓有明顯的溶栓作用。
文檔編號C07K1/00GK1306089SQ01108029
公開日2001年8月1日 申請日期2001年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月8日
發(fā)明者吳梧桐, 孔毅, 高向東 申請人:中國藥科大學