專利名稱：脈絡(luò)寧注射劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥注射液“脈絡(luò)寧”注射劑及其制備方法，屬于中藥制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
“脈絡(luò)寧”是根據(jù)中醫(yī)清熱養(yǎng)陰、活血化淤的理論，采用名貴中藥經(jīng)提取精制而成的中藥復方制劑，用于治療腦血栓后遺癥、心血管疾病、靜脈血栓、大動脈血栓、脈管炎等周圍血管疾病，在中成藥中具有重要的地位。
脈絡(luò)寧處方中四味中藥為牛膝、玄參、石斛和金銀花，其中牛膝主要化學成份三萜皂甙，水解后生成齊墩果酸，并含有脫皮甾酮和牛膝甾酮。此外，尚含有寡聚糖、多糖等。其中主要成分之一為蛻皮甾酮，蛻皮甾酮易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯。藥理實驗表明對動物有降低血糖和膽固醇的作用。
玄參主要化學成份為環(huán)烯醚萜、苯丙素苷、三萜皂苷和有機芳酸四種類型。其中主要有效成份為桂皮酸，溶于醇，易溶于乙酸乙酯。桂皮酸臨床中發(fā)現(xiàn)有升高白細胞作用，近年動物實驗證實確有升白作用，動物實驗還發(fā)現(xiàn)能提高外周白細胞及血小板數(shù)等。
石斛為鐵皮石斛、羅河石斛、廣東石斛、細徑石斛等的加工品。主要含石斛堿、石斛次堿、6-羥基石斛堿。據(jù)報道，尚分離得五種季銨生物堿。還分離得阿牙品、濱蒿內(nèi)酯等。生物堿易溶于乙醇、甲醇；濱蒿內(nèi)酯易溶于甲醇、乙醇、氯仿等。其中石斛堿有止痛作用，對血壓和呼吸有抑制作用等；濱蒿內(nèi)酯有降血壓作用。0.4-10mg/kg靜注或十二指腸給藥，對全麻或局麻大鼠、貓與兔均有顯著降壓效果。此作用不被六烴季胺和阿托品阻斷，不被芐胺唑啉所加強，也不能對抗腎上腺素的升壓作用。以1/50-1/10靜注射量作椎動脈注射時，降血壓強度和全量靜注大致相等，提示其降壓作用可能為中樞性的。濱蒿內(nèi)酯對在位兔心和貓心的收縮力有增強作用。濱蒿內(nèi)酯還可使離體兔心冠脈流量增加。
金銀花中主要含木犀草素、綠原酸、異綠原酸、木犀草素-7-葡萄糖甙(木犀草甙)、5-羥基-3′，4′，7-三甲氧基黃酮等。以上成份綠原酸，在熱水中溶解度較大，易溶于乙醇，極微溶于乙酸乙酯，具有較廣泛抗菌作用，有止血、增高白血球及抗病毒作用；木犀草素溶于乙醇和堿性溶液；木犀草甙微溶于水、甲醇、乙醇，可溶于熱水、熱甲醇及乙醇。對心血管的作用木犀草素、本犀草甙有降低兔實驗型動物粥樣硬化中膽甾醇的作用，皮下注射有增強毛細血管的作用，其中木犀草素可使動脈壓增加而降低靜脈壓，增加冠狀動脈血流量。
傳統(tǒng)的“脈絡(luò)寧”注射液制備工藝復雜，采用水煮醇沉的方法提取有效成分，然后使用乙酸乙酯萃取提純；例如，中國專利CN92107848.X公開了一種“脈絡(luò)寧靜脈注射液的工藝方法”，該方法將金銀花、牛膝、玄參、石斛按照一定的重量比配伍，充分混合后放置于反應(yīng)釜內(nèi)加水浸煮，兩次水煎后合并煎液，使用乙醇沉淀，最終含醇量為70-75％，將醇液濃縮，去除余醇，用醋酸乙酯萃取7-10次，得到藥物的有效成分。該方法制備的脈絡(luò)寧注射液用于血栓閉塞性脈管炎157例，治愈率48.4％，顯效率45.85％，總有效率97.5％；用于腦血栓形成及后遺癥52例，基本治愈率20.5％，顯效率38.5％，好轉(zhuǎn)率30.8％，總有效率84.74％。
作為血栓性疾病的理想藥品，上述制備方法得到的脈絡(luò)寧產(chǎn)品，依然存在鞣質(zhì)等雜質(zhì)去除不徹底，以乙酸乙酯萃取，仍有鞣質(zhì)可以被萃取到乙酸乙酯中，有效成分含量不均衡的問題，影響藥物的總體質(zhì)量，如果對藥物有效成分的提取做進一步的改善，提高藥物的純度，對有效成分做更為具體的控制，則會明顯的提高藥品質(zhì)量，增強藥效。有待于做進一步的改進或研制新的工藝方法。
與此同時，傳統(tǒng)的脈絡(luò)寧為靜脈注射液，本身不可避免的存在穩(wěn)定性差，遇光易出現(xiàn)有效成分下降，不易長期儲存的弊端，如果將其制備為粉針劑，則會有助于上述問題解決。粉針劑為注射用無菌粉末的簡稱，凡對熱不穩(wěn)定或在水溶液中易分解的藥物，如某些抗生素、酶制劑及生化制品，由于不能制成一般的水溶性注射液或不適宜加熱滅菌，長期儲存，均需制成注射用無菌粉末，即粉針劑。由于注射液的穩(wěn)定性較其他劑型相比不甚理想，近年來，為提高中藥注射劑的穩(wěn)定性，已有部分中藥注射液研制成粉針劑使用。
粉針劑的生產(chǎn)必須在無菌室內(nèi)進行，按藥物的性質(zhì)不同，可以將原料藥精制成無菌粉末，在無菌條件下直接分裝于潔凈滅菌小瓶或安瓿中密封制成；或是將將藥物制成無菌水溶液，以無菌操作灌裝，經(jīng)冷凍干燥后，在無菌條件下密封而成。習慣上，前者稱無菌粉末直接分裝法，制成品為無菌分裝產(chǎn)品；后者稱無菌水溶液冷凍干燥法，制成品為冷凍干燥制品。目前，中藥粉針劑以凍干制品為多。
粉針劑質(zhì)量要求與注射用水溶液一致，應(yīng)符合《中國藥典》中關(guān)于注射用藥物的各項規(guī)定及注射用無菌粉末的各項檢查標準。
冷凍干燥法是將藥液先經(jīng)無菌分裝后冷凍成固體，然后在低溫及高真空的條件下，使藥液中的水分升華而除去，在無菌條件下，加蓋橡皮塞、鋁蓋密封制成。應(yīng)用此法能避免藥品因高熱而分解變質(zhì)，所得制品質(zhì)地舒松，加水后迅速溶解，含水量低，一般在1-3％范圍內(nèi)，有利于藥品貯存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種中藥“脈絡(luò)寧”注射劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種中藥“脈絡(luò)寧”注射劑的制備方法。
傳統(tǒng)的中藥制劑“脈絡(luò)寧”注射液為中藥復方，由牛膝、玄參、石斛和金銀花4味中藥組配；通過水煮醇沉提取其有效成分，后經(jīng)乙酸乙酯萃取得到提純產(chǎn)物，配制而成。其有效成分的提取中，去除鞣質(zhì)等雜質(zhì)不徹底，影響注射液的質(zhì)量。
本發(fā)明所述的脈絡(luò)寧注射劑，含有如下重量份的原料組分牛膝100-1000 玄參100-1000石斛100-1000 金銀花100-1000上述牛膝、玄參、石斛與金銀花經(jīng)兩級醇提得到藥物有效成分，再經(jīng)乙酸乙酯萃取分離，得到藥物有效成分。
其中，一級醇沉使用的醇溶液為含醇量0％-99.5％的乙醇水溶液，二級醇沉時的上清液的含醇量為75-85％。
上述的乙酸乙酯萃取分離步驟也可以大孔樹脂提純步驟代替，同樣實現(xiàn)本發(fā)明目的。
上述本發(fā)明方法也可以在一級醇提和一次醇沉之間增加一明膠沉淀步驟，更加有利于藥物有效成分的提取，在此情況下，依然可以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
本發(fā)明方法還可以是將上述牛膝、玄參、石斛與金銀花經(jīng)醇提得到有效成分，再經(jīng)明膠水溶液或ZTC澄清劑進行處理，最后使用大孔樹脂提純，得到藥物有效成分。
本發(fā)明方法進一步可以是將上述牛膝、玄參、石斛與金銀花經(jīng)水提得到有效成分，再經(jīng)ZTC澄清劑處理，上清液醇沉后使用大孔樹脂提純，得到藥物有效成分。
上述脈絡(luò)寧注射劑中，濱蒿內(nèi)酯含量按照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈—水(1∶4)為流動相；檢測波長343nm，理論板數(shù)按濱蒿內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于2000。
對照品溶液的制備精密稱取濱蒿內(nèi)酯對照品適量，加甲醇制成每1ml中含5μg的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本發(fā)明產(chǎn)品50ml，加氯化鈉5g，用氯仿提取3次，每次30ml，合并氯仿液，置水浴上蒸干，殘渣加60％甲醇使溶解，并轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加60％甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。
測定法分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
本發(fā)明產(chǎn)品每1ml含石斛以濱蒿內(nèi)酯(C11H10O4)計，濱蒿內(nèi)酯含量為2.0-5.5μg/mL。
上述脈絡(luò)寧注射劑中，總黃酮含量測定如下對照品溶液的制備精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品10mg，置100ml量瓶中，加50％甲醇適量，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml中含蘆丁0.1mg)。
標準曲線的制備精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分別置10ml量瓶中，各加50％甲醇至5ml，加5％亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6分鐘，加10％硝酸鋁溶液0.6ml，搖勻，放置6分鐘，加8.6％氫氧化鈉溶液3ml，再加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白。照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V B)，在510nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
測定法精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取3ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為空白對照；另精密量取3ml，置10ml量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法立即測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中相當于蘆丁的重量，計算，即得。
本發(fā)明產(chǎn)品每1ml含總黃酮以蘆丁(C27H30O16)計，總黃酮含量為2.0-3.5mg/mL。
本發(fā)明所述的脈絡(luò)寧注射劑，按照高效液相色譜法(中國藥典2000版一部附錄VID)測定，流動相為甲醇-水-冰醋酸(45∶55∶0.2)，檢測波長243nm，理論板數(shù)按肉桂酸峰計算≥1000；流動相為甲醇-水-冰醋酸(15∶85∶1)，檢測波長330nm，理論板數(shù)按綠原酸峰計算≥1000。具體如下(1)取本發(fā)明產(chǎn)品10ml，加氨試液調(diào)節(jié)pH值至中性，用氯仿提取2次，每次15ml，合并氯仿液，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取濱蒿內(nèi)酯對照品，加甲醇制成每1m中含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VI B)試驗，量取上述兩種溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷—氯仿—醋酸乙酯(10∶15∶15)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(2)取樣品作為供試品溶液。另取肉桂酸對照品適量，加甲醇制成每1ml中含50μl的溶液，作為對照品溶液。照高效液相色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VI D)測定，流動相為甲醇-水-冰醋酸(45∶55∶0.2)，檢測波長243nm，理論板數(shù)按肉桂酸峰計算應(yīng)不低于1000。供試品色譜圖中有與對照品的保留時間相一致的色譜峰。
(3)取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1ml中含50μg的溶液，作為對照品溶液。照高效液相色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VI D)，取對照品溶液和鑒別(2)項下的供試品溶液測定，流動相為甲醇-水-冰醋酸(15∶85∶1)，檢測波長330nm，理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于1000，供試品色譜圖中有與對照品的保留時間相一致的色譜峰。
本發(fā)明所述的脈絡(luò)寧注射劑中肉桂酸含量為40-51μg/mL，綠原酸含量為140-205μg/mL，蛻皮甾酮含量為45-50μg/mL。
根據(jù)權(quán)利要求2所述的脈絡(luò)寧注射劑，其特征在于，所述的脈絡(luò)寧注射劑中間體中，重金屬含量≤10ppm，砷鹽≤1ppm，熾灼殘渣≤1.5％(g/mL)，總固體13.5-25.5mg/mL。
根據(jù)權(quán)利要求3所述的脈絡(luò)寧注射劑，其特征在于，所述的脈絡(luò)寧注射劑中間體的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、草酸鹽、鉀離子符合中國藥典2000版一部注射劑項下的有關(guān)規(guī)定。
在提取有效成分后，本發(fā)明制得的注射劑可以是注射液或粉針劑。
在制備粉針劑時，可以根據(jù)需要，加入各種支架劑，例如葡萄糖、甘露醇、氯化鈉、右旋糖苷、蔗糖、乳糖、明膠等，劑量控制在溶液重量的1-50％。
本發(fā)明提供的制備方法中，采用醇提的方法得到藥物有效成分，加入明膠水溶液或ZTC澄清劑處理后，進行醇沉過濾，提純處理得到最終產(chǎn)物。該方法工藝簡單，所用制劑易于得到，鞣質(zhì)等雜質(zhì)去除徹底，得到的產(chǎn)品產(chǎn)率和純度較高。
本發(fā)明所述的“脈絡(luò)寧”粉針劑含有如下重量份的原料組分
牛膝100-1000 玄參100-1000石斛100-1000 金銀花100-1000所述的重量份可以是g、kg、兩、斤等常用計量單位。
本發(fā)明方法可通過如下步驟實現(xiàn)1)將上述組分中的牛膝、玄參、石斛沖洗干凈，切成片或段或粉，與金銀花一并投入提取罐內(nèi)，加1-10倍量的0％-99.5％乙醇水溶液浸泡1小時后，40-85℃下加熱回流提取1-5次，每次提取1-2小時，濾過，濾液備用；合并濾液，濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；2)加入95％乙醇，攪拌，使上清液乙醇含量在75-85％，0-10℃靜置12-24小時，濾取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；3)加入1-3倍濃縮液體積的乙酸乙酯，萃取3-7次，每次萃取30-60分鐘，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，濃縮至稠膏(80℃)，為藥物有效成分。
如制備凍干粉針劑，則向稠膏加入1-10倍量注射用水，攪拌，冷藏12-24小時，過濾，濾液加入0.1-0.6％的泊洛沙姆，攪拌溶解，加入0.8-0.9％的氯化鈉，攪拌溶解，用10-40％NaOH溶液調(diào)PH為7-9之間，補充注射用水，加入溶液重量1-50％的支架劑，使用0.22-0.45um微孔濾膜精濾，得到的濾液在無菌條件下灌裝于西林瓶或安瓿中冷卻至0℃，然后放入凍干箱內(nèi)，使凍干箱溫度迅速降至-40～-60℃，使藥液冷卻，維持1-5小時，使其完全凍結(jié)；藥液完全凍結(jié)后，將凍干箱內(nèi)壓力降至1.33～13.33Pa，同時維持凍干箱內(nèi)溫度為-60～-40℃，滿足水的升華條件，使藥液中的水分變?yōu)樗魵?；連通冷凝器，使其冷凝管降溫，最低可至-60℃以下，使水蒸氣在冷凝管上結(jié)霜，保持1-10小時，其間凍干箱擱板緩慢加熱到20-40℃；即得干燥制品，然后將制品取出封口。
如制備注射液，則加入附加劑，按照現(xiàn)有技術(shù)方法，進行制備。
上述步驟3)也可以是使用大孔樹脂進行純化。
上述方法也可以在步驟1)和2)之間增加一步驟為向濃縮液中加入1/10體積的濃度為0.5％-10％明膠水溶液，攪拌，0-10℃放置12-24小時，離心，得上清液。
本發(fā)明方法也可以是1)將上述組分中的牛膝、玄參、石斛沖洗干凈，切成片或段或粉，與金銀花一并投入提取罐內(nèi)，加1-10倍量的0％-99.5％乙醇水溶液浸泡1小時后，40-85℃下加熱回流提取1-5次，每次提取1-2小時，濾過，濾液備用；合并濾液，濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；2)向濃縮液中加入1/10體積的濃度為0.5％-10％明膠水溶液，攪拌，0-10℃放置12-24小時，離心，得上清液；3)將上清液通過大孔樹脂進行純化，得到藥物有效成分，配以輔料制備粉針劑或注射液。
本發(fā)明方法也可以是1)將上述組分中的牛膝、玄參、石斛沖洗干凈，切成片或段或粉，與金銀花一并投入提取罐內(nèi)，加1-10倍量的水浸泡1小時后，40-85℃下加熱回流提取1-5次，每次提取1-2小時，濾過，濾液備用；合并濾液，濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；2)向濃縮液中加入ZTC預處理劑A組分，煮沸15-20分鐘后，靜置4-5小時，離心分離得上層清液；再加入ZTC預處理劑A組分，煮沸15-20分鐘后，靜置3小時，過濾，濾液中加入ZTC澄清劑B組分，加熱至沸，放置4-6小時，離心后過濾，濾液經(jīng)多層濾紙板框壓濾后，濃縮至比重1.10-1.20(80℃)；3)加入95％乙醇，攪拌，使上清液乙醇含量在75-85％，0-10℃靜置12-24小時，濾取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；4)通過大孔樹脂進行純化，得到藥物有效成分，配以輔料制備粉針劑或注射液。
與中國專利CN92107848.X相比，本發(fā)明方法有助于有效成分的完全提取，采用的除雜方法利于水溶性雜質(zhì)去除完全，使得脈絡(luò)寧藥效明顯提升，使用本發(fā)明方法得到的中藥制劑較傳統(tǒng)方法得到的產(chǎn)品在純度上有了很大的提高，有效的去除了鞣質(zhì)；而且，采用粉針劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液態(tài)針劑，有效的延長了藥物的有效期，使其具有很好的穩(wěn)定性，藥效可達3年以上。
具體實施例方式實施例1-1將石斛、玄參、牛膝各500g洗凈切片，與金銀花500g一起投入提取罐，加6倍量的30％乙醇水溶液浸泡1小時后，50℃下加熱回流提取3次，每次提取1小時，濾過，濾液備用；合并濾液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.15(80℃)；向濃縮液中加入1/10體積的濃度為5％明膠溶液，攪拌，4℃放置12小時，離心，得上清液；向上清液中加入95％乙醇，攪拌，使上清液乙醇含量在85％，4℃靜置12小時，濾取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.15(80℃)；加入1倍濃縮液體積的乙酸乙酯，萃取3次，每次萃取15分鐘，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，濃縮至稠膏(80℃)。
加入3倍量注射用水，攪拌，冷藏12小時，過濾，濾液加入0.1％的泊洛沙姆，攪拌溶解，加入0.8％的氯化鈉，攪拌溶解，用20％NaOH溶液調(diào)PH為8.5，補充注射用水，加入1％的甘露醇，混合均勻后，使用0.45um微孔濾膜精濾，濾液滅菌，灌裝于西林瓶中；將西林瓶冷卻至0℃，然后放入凍干箱內(nèi)，使凍干箱溫度迅速降至-40℃，使藥液冷卻，維持5小時，使藥液完全凍結(jié)；然后將凍干箱內(nèi)壓力降至10Pa，同時維持凍干箱內(nèi)溫度為-40℃，使藥液中的水分變?yōu)樗魵猓贿B通冷凝器，使其冷凝管降溫至-60℃，使水蒸氣在冷凝管上結(jié)霜，凍干箱擱板緩慢加熱到21℃，保持10小時，即得干燥制品，然后將制品取出封口。
實施例1-2將石斛100g、玄參300g、牛膝700g洗凈切片，與金銀花1000g一并投入提取罐，加1倍量的0.5％乙醇水溶液浸泡1小時后，40℃下加熱回流提取2次，每次提取2小時，濾過，濾液備用；合并濾液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10(50℃)；向濃縮液中加入1/10體積的濃度為0.5％明膠溶液，攪拌，4℃放置12小時，離心，得上清液；向上清液中加入95％乙醇，攪拌，使上清液乙醇含量在85％，4℃靜置12小時，濾取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10(80℃)；加入1倍濃縮液體積的乙酸乙酯，萃取3次，每次萃取60分鐘，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，濃縮至稠膏(80℃)。
加入3倍量注射用水，攪拌，冷藏12小時，過濾，濾液加入0.3％的泊洛沙姆，攪拌溶解，加入0.8％的氯化鈉，攪拌溶解，用30％NaOH溶液調(diào)PH為8.5，補充注射用水，加入20％的乳糖，混合均勻，使用0.22um微孔濾膜精濾，濾液滅菌，灌裝于西林瓶中；將西林瓶冷卻至0℃，然后放入凍干箱內(nèi)，使凍干箱溫度迅速降至-40℃，使藥液冷卻，維持4.5小時，使藥液完全凍結(jié)；然后將凍干箱內(nèi)壓力降至7Pa，同時維持凍干箱內(nèi)溫度為-40℃，使藥液中的水分變?yōu)樗魵?；連通冷凝器，使其冷凝管降溫至-65℃，使水蒸氣在冷凝管上結(jié)霜，凍干箱擱板緩慢加熱到30℃，保持3小時，即得干燥制品，然后將制品取出封口。
實施例1-3將石斛1000g、玄參100g、牛膝300g洗凈切片，與金銀花700g一并投入提取罐，加10倍量的60％乙醇水溶液浸泡1小時后，85℃下加熱回流提取3次，每次提取1小時，濾過，濾液備用；合并濾液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.20(50℃)；向濃縮液中加入1/10體積的濃度為2％明膠溶液，攪拌，4℃放置20小時，離心，得上清液；向上清液中加入95％乙醇，攪拌，使上清液乙醇含量在80％，0℃靜置20小時，濾取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.20(80℃)；加入1倍濃縮液體積的乙酸乙酯，萃取5次，每次萃取10分鐘，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，濃縮至稠膏(80℃)。
加入10倍量注射用水，攪拌，4℃冷藏18小時，過濾，濾液加入0.4％的泊洛沙姆，攪拌溶解，加入0.8％的氯化鈉，攪拌溶解，用40％NaOH溶液調(diào)PH為8.0，補充注射用水，加入10％明膠，使用0.45um微孔濾膜精濾，濾液滅菌，灌裝于西林瓶中；將西林瓶冷卻至0℃，然后放入凍干箱內(nèi)，使凍干箱溫度迅速降至-58℃，使藥液冷卻，維持1.5小時，使藥液完全凍結(jié)；然后將凍干箱內(nèi)壓力降至2Pa，同時維持凍干箱內(nèi)溫度為-58℃，使藥液中的水分變?yōu)樗魵?；連通冷凝器，使其冷凝管降溫至-65℃，使水蒸氣在冷凝管上結(jié)霜，凍干箱擱板緩慢加熱到25℃，保持7小時，即得干燥制品，然后將制品取出封口。
實施例1-4將石斛300g、玄參700g、牛膝1000g洗凈切片，與金銀花100g一并投入提取罐，加3倍量的99.5％乙醇水溶液浸泡1小時后，70℃下加熱回流提取3次，每次提取1小時，濾過，濾液備用；合并濾液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10(50℃)；向濃縮液中加入1/10體積的濃度為10％明膠溶液，攪拌，8℃放置12小時，離心，得上清液；向上清液中加入95％乙醇，攪拌，使上清液乙醇含量在75％，8℃靜置12小時，濾取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10(80℃)；加入1倍濃縮液體積的乙酸乙酯，萃取7次，每次萃取5分鐘，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，濃縮至稠膏(80℃)。
加入6倍量注射用水，攪拌，冷藏24小時，過濾，濾液加入0.5％的泊洛沙姆，攪拌溶解，加入0.9％的氯化鈉，攪拌溶解，用20％NaOH溶液調(diào)PH為8.5，補充注射用水，加入15％的葡萄糖，使用0.22um微孔濾膜精濾，濾液滅菌，灌裝于西林瓶中；將西林瓶冷卻至0℃，然后放入凍干箱內(nèi)，使凍干箱溫度迅速降至-40℃，使藥液冷卻，維持3.5小時，使藥液完全凍結(jié)；然后將凍干箱內(nèi)壓力降至5Pa，同時維持凍干箱內(nèi)溫度為-40℃，使藥液中的水分變?yōu)樗魵?；連通冷凝器，使其冷凝管降溫至-50℃，使水蒸氣在冷凝管上結(jié)霜，凍干箱擱板緩慢加熱到30℃，保持5小時，即得干燥制品，然后將制品取出封口。
實施例2-1將石斛、玄參、牛膝各500g洗凈切片，與金銀花500g一并投入提取罐，加入12kg30％乙醇間接加熱，提取3次，每次1小時，3次提取液過濾后合并，減壓濃縮至1/5濃縮前體積，加入濃縮液重量1％的明膠水溶液，攪勻，4℃放置12小時，離心，濾過，濾液減壓濃縮1/2體積；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例2-2將石斛100g、玄參300g、牛膝700g洗凈切片，與金銀花1000g一并投入提取罐，加入18.9kg 50％乙醇間接加熱，提取3小時，提取液過濾，濾液減壓濃縮至1/4濃縮前體積，加入濃縮液重量5％的明膠水溶液，攪勻，10℃放置24小時，離心，濾過，濾液減壓濃縮1/3體積；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例2-3將石斛1000g、玄參100g、牛膝300g洗凈切片，與金銀花700g一并投入提取罐，加入6.3kg 40％乙醇間接加熱，提取2次，第一次提取2小時，第二次提取1小時，提取液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/5濃縮前體積，加入濃縮液重量3％的明膠水溶液，攪勻，8℃放置20小時，離心，濾過，濾液減壓濃縮1/4體積；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例2-4將石斛700g、玄參1000g、牛膝100g洗凈切片，與金銀花300g一并投入提取罐，加入10.5kg 40％乙醇間接加熱，提取2次，每次提取2小時，提取液合并后過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，加入濃縮液重量1％的ZTC澄清劑，攪勻，5℃放置24小時，離心，濾過，濾液減壓濃縮1/2體積；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例2-5將石斛300g、玄參700g、牛膝1000g洗凈切片，與金銀花100g一并投入提取罐，加入16.8kg 30％乙醇間接加熱，提取3次，第一次提取2小時，第二次提取1小時，第三次提取1小時，三次提取液合并后過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，加入濃縮液重量1％的ZTC澄清劑，攪勻，10℃放置12小時，離心，濾過，濾液減壓濃縮1/3體積；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例2-6將石斛、玄參、牛膝各500g洗凈切片，與金銀花500g一并投入提取罐，加入12kg 50％乙醇間接加熱，提取3次，每次1小時，3次提取液過濾后合并，減壓濃縮至無醇味，加入濃縮液重量1％的ZTC澄清劑，攪勻，8℃放置22小時，離心，濾過，濾液減壓濃縮1/4體積；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例3-1將石斛、玄參、牛膝各500g洗凈切片，與金銀花500g投入煎煮鍋，加入12kg水，加熱至沸騰，煎煮3次，每次1小時，3次煎煮液過濾后合并，減壓濃縮至1/2濃縮前體積，加入濃縮液體積5％的明膠水溶液，攪拌均勻，10℃下放置24小時，離心后濾紙過濾，濾液減壓濃縮至1/4濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在5℃下放置12小時，濾紙過濾，濾液用濃度為20％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.0，放置12小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；以1倍體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓回收至無味，按常法配制得到注射液。
實施例3-2將石斛100g、玄參300g、牛膝700g洗凈切片，與金銀花1000g投入煎煮鍋，加入18.9kg水，加熱至沸騰，煎煮3小時，煎煮液過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，加入濃縮液體積1％的明膠水溶液，攪拌均勻，5℃下放置12小時，離心后濾紙過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在10℃下放置24小時，濾紙過濾，濾液用濃度為10％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.5，放置24小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；以3倍體積的乙酸乙酯萃取1次，減壓回收至無味，按常法配制得到注射液。
實施例3-3將石斛1000g、玄參100g、牛膝300g洗凈切片，與金銀花700g投入煎煮鍋，加入6.3kg水，加熱至沸騰，煎煮2次，第一次煎煮2小時，第二次煎煮1小時，煎煮液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/2濃縮前體積，加入濃縮液體積5％的明膠水溶液，攪拌均勻，8℃下放置15小時，離心后濾紙過濾，濾液減壓濃縮至1/4濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在8℃下放置20小時，濾紙過濾，濾液用濃度為30％的NaOH溶液調(diào)PH＝7.5，放置18小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；以2倍體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓回收至無味，按常法配制得到注射液。
實施例3-4將石斛700g、玄參1000g、牛膝100g洗凈切片，與金銀花300g投入煎煮鍋，加入10.5kg水，加熱至沸騰，煎煮2次，每次煎煮2小時，煎煮液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，加入濃縮液體積1％的明膠水溶液，攪拌均勻，7℃下放置20小時，離心后濾紙過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在10℃下放置24小時，濾紙過濾，濾液用濃度為20％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.5，放置12小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；以2倍體積的乙酸乙酯萃取2次，減壓回收至無味，按常法配制得到注射液。
實施例3-5將石斛300g、玄參700g、牛膝1000g洗凈切片，與金銀花100g投入煎煮鍋，加入16.8kg水，加熱至沸騰，煎煮3次，第一次煎煮2小時，第二次煎煮1小時，第三次煎煮1小時，三次煎煮液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/2濃縮前體積，加入濃縮液體積3％的明膠水溶液，攪拌均勻，5℃下放置12小時，離心后濾紙過濾，濾液減壓濃縮至1/4濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在5℃下放置12小時，濾紙過濾，濾液用濃度為20％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.0，放置24小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；以3倍體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓回收至無味，按常法配制得到注射液。
實施例3-6將石斛、玄參、牛膝各500g洗凈切片，與金銀花500g投入煎煮鍋，加入12kg水，加熱至沸騰，煎煮3次，每次1小時，3次煎煮液過濾后合并，減壓濃縮至1/2濃縮前體積，加入濃縮液體積5％的明膠水溶液，攪拌均勻，10℃下放置24小時，離心后濾紙過濾，濾液減壓濃縮至1/4濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在5℃下放置12小時，濾紙過濾，濾液用濃度為20％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.0，放置12小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；以3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，減壓回收至無味，按常法配制得到注射液。
實施例4-1將石斛、玄參、牛膝各500g洗凈切片，與金銀花500g投入煎煮鍋，加入12kg水，加熱至沸騰，煎煮3次，每次1小時，3次煎煮液過濾后合并，減壓濃縮至1/2濃縮前體積，在60℃下，加入濃縮液重量1％的ZTC澄清劑，在5℃下放置12小時，離心，過濾，濾液減壓濃縮至1/4濃縮前體積，然后加入95％的乙醇至含醇量為80％，10℃放置24小時，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例4-2將石斛100g、玄參300g、牛膝700g洗凈切片，與金銀花1000g投入煎煮鍋，加入18.9kg水，加熱至沸騰，煎煮3小時，煎煮液過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，在55℃下，加入濃縮液重量5％的ZTC澄清劑，在10℃下放置、24小時，離心，過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，然后加入95％的乙醇至含醇量為80％，5℃放置12小時，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例4-3將石斛1000g、玄參100g、牛膝300g洗凈切片，與金銀花700g投入煎煮鍋，加入6.3kg水，加熱至沸騰，煎煮2次，第一次煎煮2小時，第二次煎煮1小時，煎煮液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/2濃縮前體積，在65℃下，加入濃縮液重量3％的ZTC澄清劑，在8℃下放置20小時，離心，過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，然后加入95％的乙醇至含醇量為80％，10℃放置18小時，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例5-1將石斛700g、玄參1000g、牛膝100g洗凈切片，與金銀花300g投入煎煮鍋，加入10.5kg水，加熱至沸騰，煎煮2次，每次煎煮2小時，煎煮液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，加入濃縮液重量5％的明膠水溶液，攪拌均勻，在5℃下放置15小時，離心，過濾，濾液減壓濃縮至1/4濃縮前體積，然后加入95％的乙醇至含醇量為80％，8℃放置24小時，過濾，濾液以20％的NaOH溶液調(diào)PH值為8.0后，減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例5-2將石斛300g、玄參700g、牛膝1000g洗凈切片，與金銀花100g投入煎煮鍋，加入16.8kg水，加熱至沸騰，煎煮3次，第一次煎煮2小時，第二次煎煮1小時，第三次煎煮1小時，三次煎煮液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/2濃縮前體積，加入濃縮液重量1％的明膠水溶液，攪拌均勻，在10℃下放置12小時，離心，過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，然后加入95％的乙醇至含醇量為80％，10℃放置12小時，過濾，濾液以20％的NaOH溶液調(diào)PH值為8.5后放置12小時，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例5-3將石斛、玄參、牛膝各500g洗凈切片，與金銀花500g投入煎煮鍋，加入12kg水，加熱至沸騰，煎煮3次，每次1小時，3次煎煮液過濾后合并，減壓濃縮至1/2濃縮前體積，加入濃縮液重量3％的明膠水溶液，攪拌均勻，在8℃下放置12小時，離心，過濾，濾液減壓濃縮至1/4濃縮前體積，然后加入95％的乙醇至含醇量為80％，10℃放置22小時，過濾，濾液以20％的NaOH溶液調(diào)PH值為8.5后，放置12小時，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例6-1——6-3除煎煮液減壓濃縮后，不加入明膠水溶液，直接進行加入95％的乙醇至含醇量為80％的步驟以外，其余步驟同實施例5-1、5-2、5-3。
實施例7-1將石斛、玄參、牛膝各500g洗凈切片，與金銀花500g投入煎煮鍋，加入12kg的30％乙醇，加熱至沸騰，煎煮3次，每次1小時，3次煎煮液過濾后合并，減壓濃縮至1/2濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在5℃下放置12小時，濾紙過濾，濾液用濃度為20％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.0，放置12小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例7-2將石斛100g、玄參300g、牛膝700g洗凈切片，與金銀花1000g投入煎煮鍋，加入18.9kg的40％乙醇，加熱至沸騰，煎煮3小時，煎煮液過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在10℃下放置24小時，濾紙過濾，濾液用濃度為10％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.5，放置24小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例7-3將石斛1000g、玄參100g、牛膝300g洗凈切片，與金銀花700g投入煎煮鍋，加入6.3kg的50％乙醇，加熱至沸騰，煎煮2次，第一次煎煮2小時，第二次煎煮1小時，煎煮液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/4濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在8℃下放置20小時，濾紙過濾，濾液用濃度為30％的NaOH溶液調(diào)PH＝7.5，放置18小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例7-4將石斛700g、玄參1000g、牛膝100g洗凈切片，與金銀花300g投入提取罐，加入10.5kg 30％乙醇，間接加熱至沸騰，提取2次，每次提取2小時，提取液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/3濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在10℃下放置24小時，濾紙過濾，濾液用濃度為20％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.5，放置12小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例7-5將石斛300g、玄參700g、牛膝1000g洗凈切片，與金銀花100g投入提取罐，加入16.8kg 40％乙醇，間接加熱至沸騰，提取3次，第一次提取2小時，第二次提取1小時，第三次提取1小時，三次提取液合并后過濾，濾液減壓濃縮至1/2濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在5℃下放置12小時，濾紙過濾，濾液用濃度為20％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.0，放置24小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
實施例7-6將石斛、玄參、牛膝各500g洗凈切片，與金銀花500g投入煎煮鍋，加入12kg 50％乙醇，間接加熱至沸騰，提取3次，每次1小時，3次提取液過濾后合并，減壓濃縮至1/2濃縮前體積，加入95％的乙醇至含醇量為80％，在5℃下放置12小時，濾紙過濾，濾液用濃度為20％的NaOH溶液調(diào)PH＝8.0，放置12小時，濾紙過濾，濾液減壓濃縮至無醇味；上D101大孔樹脂柱以去離子水洗脫，至流出液呈無色，然后以85％乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，按常法配制得到注射液。
比較例1本例為脈絡(luò)寧注射液中石斛的含量測定1.儀器及試劑Waters 2695高效液相色譜儀；Waters 2996二極管陣列檢測器；Empower數(shù)據(jù)處理軟件；試劑乙腈(色譜純)Fisher Scientific公司，批號020109水重蒸餾水；濱蒿內(nèi)酯對照品中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號1511-200001。
2.色譜條件色譜柱Kromasil C18(Φ4.6×200mm，5μm)柱溫30℃流動相乙腈-水(1∶4)，流速0.8ml/min進樣量10μl波長343nm3.樣品制備對照品溶液的制備精密稱取濱蒿內(nèi)酯對照品適量，加甲醇制成每1ml中含5μg的溶液，即得。
供試品溶液取本發(fā)明產(chǎn)品，加注射用水，制成50ml脈絡(luò)寧注射液，加氯化鈉5g，用氯仿提取3次，每次30ml，合并氯仿液，置水浴上蒸干，殘渣加60％甲醇使溶解，并轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加60％甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。
缺石斛的陰性對照樣品稱取玄參、牛膝、金銀花各50g，按照實施例1-1的操作，制得缺石斛的脈絡(luò)寧注射液，按照上述供試品溶液的制備方法制成缺石斛的陰性對照溶液。
4.陰性對照試驗在前述色譜條件下，精密吸取上述對照品溶液及缺石斛的陰性對照溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄HPLC圖，結(jié)果表明陰性樣品在濱蒿內(nèi)酯峰保留時間處(約21.4分鐘)無色譜峰出現(xiàn)，說明陰性樣品對樣品中濱蒿內(nèi)酯的測定無干擾。
5.色譜分離效果取供試品溶液10μl在上述色譜條件下進樣測定，所得色譜圖中，濱蒿內(nèi)酯峰的理論板數(shù)為5922，且與相鄰色譜峰分離良好，分離度為3.5。
6.成品含量測定與結(jié)果按前述方法對五批成品進行了測定，測定結(jié)果見下表

按照中國專利CN92107848.X描述的工藝生產(chǎn)的脈絡(luò)寧注射液樣品的濱蒿內(nèi)酯測定結(jié)果見下表

7.結(jié)論五批按新工藝生產(chǎn)的樣品濱蒿內(nèi)酯含量平均值為3.86μg/ml。
按照中國專利CN92107848.X描述的工藝生產(chǎn)的脈絡(luò)寧注射液樣品的濱蒿內(nèi)酯含量平均值為2.44μg/ml。
因此本發(fā)明方法生產(chǎn)的產(chǎn)品與中國專利CN92107848.X描述的工藝相比，所生產(chǎn)產(chǎn)品的濱蒿內(nèi)酯含量顯著提高。
比較例3
本例為本發(fā)明方法與中國專利CN92107848.X工藝制得的產(chǎn)品的質(zhì)量對比。
兩工藝產(chǎn)品質(zhì)量對比表

結(jié)論本發(fā)明工藝方法能夠?qū)⒅袊鴮＠鸆N92107848.X提取到的成分全部提取出來，所生產(chǎn)的產(chǎn)品的各項指標優(yōu)于中國專利CN92107848.X生產(chǎn)的樣品。
比較例4本例為本發(fā)明產(chǎn)品的動物實驗數(shù)據(jù)比較。
試驗材料1受試物名稱脈絡(luò)寧提取物注射液規(guī)格每瓶100mL(每mL含脈絡(luò)寧提取物相當原藥材量20g)提供單位哈爾濱天工科學院批號0302112試驗動物2.1小白鼠昆明種，雄性，體重18-22g，28-32g.
2.2大白鼠SD，雄性，體重300-350g.
2.3家兔新西蘭種白兔雄性，體重2.0-3.0kg.以上動物均由沈陽藥科大學實驗動物中心提供，合格證號SYXK(遼)2003-0083對照藥3.1脈絡(luò)寧注射液金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批號20030305.
3.2二磷酸腺苷二鈉鹽中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，批號200304073.3凝血酶上海第一生化藥業(yè)公司上海生物化學制藥廠，批號021015.
3.4膠原按文獻方法自制.
3.5高分子右旋糖苷(Dextron 400)分子量為40萬，沈陽第一制藥廠生產(chǎn).
3.6泊洛沙姆188型號(F68)聚合物，BASF有限公司上海分公司精細化工品部.
4.主要儀器4.1 LG-KOALA血小板聚集測試儀北京世帝科學儀器公司4.2自動平衡微型離心機LDZ4-0.8北京醫(yī)用離心機廠4.3 N5A-型普利生血液粘度計4.4 S501-A型恒溫水浴遼陽博大科學儀器有限公司4.5微量血液離心機SH-120，上海手術(shù)器械廠4.6離心沉淀器80-2，上海手術(shù)器械廠試驗方法與結(jié)果1.脈絡(luò)寧提取物注射液對大鼠血小板聚集性的影響1.1對二磷酸腺苷誘導的大鼠血小板聚集性的影響將受試動物按體重均衡分為6組，分別為溶劑對照組、脈絡(luò)寧靜脈給藥3個劑量組，劑量分別為40g/kg、20g/kg、10g/kg，另設(shè)脈絡(luò)寧灌胃給藥組，劑量為20g/kg及市售脈絡(luò)寧靜脈給藥組，劑量為20g/kg。對照組靜脈給予1％泊洛沙姆生理鹽水，給藥容積為5mL/kg，每天給藥1次，連續(xù)7天，于末次給藥后30min眶靜脈取血2mL，用3.8％枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，常規(guī)制備PRP和PPP，加10uL 1.06uM二磷酸腺苷，在LG-KOALA血小板聚集測試儀上測定各組血小板聚集率，并求出聚集抑制率。
聚集抑制率％＝(對照組聚集％-給藥組聚集％)/對照組聚集％×100％以聚集率為指標進行組間比較，顯著性檢驗。
試驗結(jié)果如下表所示，脈絡(luò)寧注射液10、20、40g/kg對ADP誘導的大鼠血小板聚集有非常顯著的抑制作用，且其作用明顯強于口服給藥組，好于等劑量市售脈絡(luò)寧組。
脈絡(luò)寧靜脈注射給藥對ADP誘導的大鼠血小板聚集性的影響(n＝10，x±s)見下表

與對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01，與口服脈絡(luò)寧組比較++p＜0.011.2對膠原誘導的大鼠血小板聚集性的影響受試大鼠分組、給藥及取血測量方法同“1.1”，聚集劑改為20uL膠原(按徐叔云藥理實驗方法學第2版方法自制)，聚集時間改為10min，數(shù)據(jù)統(tǒng)計同“1.1”，試驗結(jié)果見下表所示，脈絡(luò)寧注射液10、20、40g/kg對膠原誘導的大鼠血小板聚集有非常顯著的抑制作用，且其作用明顯強于口服給藥組，好于等劑量市售脈絡(luò)寧組。
脈絡(luò)寧靜脈注射給藥對膠原誘導的大鼠血小板聚集性的影響(n＝10，x±s)見下表

與對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01，與口服脈絡(luò)寧組比較++p＜0.011.3對凝血酶誘導的大鼠血小板聚集性的影響受試大鼠分組、給藥及取血測量方法同“1.1”，聚集劑改為10uL 2u/mL的凝血酶，數(shù)據(jù)統(tǒng)計同“1.1”，試驗結(jié)果見下表所示，脈絡(luò)寧注射液10、20、40g/kg對凝血酶誘導的大鼠血小板聚集有非常顯著的抑制作用，且其作用明顯強于口服給藥組。
表3.脈絡(luò)寧靜脈注射給藥對凝血酶誘導的大鼠血小板聚集性的影響(n＝10，x±s)

與對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01，與口服脈絡(luò)寧組比較++p＜0.012.脈絡(luò)寧提取物注射液對血小板依賴性血栓形成的影響2.1對家兔頸總動脈血栓形成的影響受試動物分6組，分別為對照組、脈絡(luò)寧靜脈給藥3個劑量組分別為20g/kg、10g/kg、5g/kg，另設(shè)脈絡(luò)寧灌胃給藥組，劑量為10g/kg及市售脈絡(luò)寧靜脈給藥組，劑量為10g/kg。對照組靜脈給與1％泊洛沙姆生理鹽水，給藥容積為5mL/kg，每天給藥一次，連續(xù)7天，于末次給藥后用戊巴比妥鈉(約30mg/kg)靜脈麻醉，背位固定，游離一側(cè)頸總動脈，在相距4cm處將動脈兩端用動脈夾夾住，用12號細縫衣針將長約3cm 4號縫合絲線縫入頸總動脈內(nèi)，打開動脈夾，恢復血流(上述工作于末次給藥后0.5h完成)，2h后將頸總動脈剪下，剪開血管，用濾紙吸去余血并抽出絲線，稱每組每只兔血栓濕重，并計算血栓形成抑制率(血栓形成抑制率＝(對照組血栓濕重-給藥組血栓濕重)/對照組血栓濕重×100％試驗結(jié)果如下表所示，在此選擇劑量范圍內(nèi)，脈絡(luò)寧注射液對血小板血栓形成有非常顯著抑制作用，脈絡(luò)寧注射液優(yōu)于等劑量市售對照藥和灌胃給藥組。脈絡(luò)寧靜脈注射給藥對家兔頸總動脈血栓形成的影響(X±SD)見下表

各給藥組與對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01.
2.2對小鼠肺栓塞的保護作用取小鼠(雄性)120只，按2.1分組，每組20只，給藥組劑量分別為15g/kg、30g/kg、60g/kg(iv)另設(shè)ig給藥組，劑量為30g/kg及市售脈絡(luò)寧注射液30g/kg組，給藥容積為0.2mL/10g，給藥速度為0.05mL/s，連續(xù)給藥7天，于末次給藥后0.5小時小鼠尾靜脈注入膠原(Sigma公司生產(chǎn)，c-8886，lot108e8015)和腎上腺素強復合誘導劑5.0mL/kg(膠原2.5mg/kg+腎上腺素2mg/kg)，注射速度為0.1mL/5s，觀察3min內(nèi)小鼠死亡情況，以每組死亡動物數(shù)及保護率為觀察指標，試驗結(jié)果如下表所示，經(jīng)x2檢驗，表明在所選擇劑量范圍內(nèi)脈絡(luò)寧注射液高劑量組對膠原和腎上腺素誘導小鼠肺血栓致死有顯著保護作用。受試物效果好于市售脈絡(luò)寧，好于相同劑量灌胃給藥組。脈絡(luò)寧注射液對膠原+腎上腺素復合物誘發(fā)小鼠肺血栓保護作用見下表

2.3對阻斷大腦中動脈致局灶性腦缺血的影響將70只雄性大鼠隨機分成7組，每組10只，分別為偽手術(shù)組、模型對照組、脈絡(luò)寧注射液3個劑量組劑量分別為10g/kg、20g/kg、40g/kg；脈絡(luò)寧注射液灌胃給藥組劑量為20g/kg，市售脈絡(luò)寧20g/kg靜脈注射給藥組，偽手術(shù)組和模型對照組靜脈注射1％泊洛沙姆生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天，給藥容積為0.5mL/100g，給藥速度為2mL/min，臨用前配制，各組給藥容積相同。于末次給藥后30min用10％水合氯醛以350mg/kg腹腔注射麻醉，受試大鼠背位固定，頸前部手術(shù)，分離右側(cè)頸總動脈至翼腭動脈并結(jié)扎之，將直徑為0.24mm進口魚線于頸總動脈與頸內(nèi)動脈分支處切口穿入，穿入長度約18mm，然后逐層縫合，術(shù)后24小時觀察按腦功能障礙指標評分標準(見附表)逐一檢查評分，做為腦功能障礙評價指標，試驗結(jié)果如下表，與模型對照組比較，脈絡(luò)寧注射液各組對腦功能障礙有顯著改善作用。
評分結(jié)束后，斷頭處死大鼠，取大腦用冷生理鹽水沖洗，放入-20℃冰箱冷凍5min后取出，去嗅球、小腦及低位腦干，沿冠狀面切成5片，將腦片放入5mLTTC中染色(4％TTC1.5mL、1mol/LK2HPO40.1mL和3.4mL蒸餾水)，37℃避光30min，正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)因未著色呈白色，分別稱量梗死區(qū)及前腦重量，以梗死區(qū)占前腦重量的百分比為觀察指標進行組間比較，顯著性測定結(jié)果如下表，在所選擇劑量范圍內(nèi)脈絡(luò)寧注射液顯著減少堵塞大腦中動脈所致大鼠腦梗死部位的重量及梗死部位重量占前腦重量的百分比。試驗結(jié)果表明受試物優(yōu)于市售脈絡(luò)寧，優(yōu)于相同劑量灌胃給藥組。
脈絡(luò)寧注射液對MCAO大鼠神經(jīng)癥狀的改善作用(X±SD)見下表

各給藥組與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01.
脈絡(luò)寧注射液對MCAO大鼠腦梗死的保護作用(X±SD)見下表

給藥組與對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01.
附表腦功能障礙指標

2.4對大鼠下腔靜脈血栓形成的影響將60只大鼠按體重均衡分組，每組10只，分組及給藥方式、劑量同“2.3”試驗，以戊巴比妥鈉350mg/kg腹腔注射麻醉后背位固定，做腹正中切口，深入腹腔，分離下腔靜脈，于左腎靜脈下方用4號絲線結(jié)扎下腔靜脈后關(guān)腹，2小時后重新開腹，在結(jié)扎線下2cm處夾閉血管并剖開管腔，取出血栓，沾除附上表面血液稱濕重，計算血栓濕重及血栓形成抑制率。試驗結(jié)果如表8所示，在選擇劑量范圍內(nèi)，脈絡(luò)寧注射液對靜脈血栓形成有顯著抑制作用，靜脈給藥組好于灌胃組和市售相同劑量組。
脈絡(luò)寧注射液對大鼠下腔靜脈血栓形成的影響(X±SD)見下表

給藥組與對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01.
3.脈絡(luò)寧提取物注射液對小鼠耳廓微循環(huán)的影響將60只受試小鼠按體重、性別均衡分為6組分別為溶劑對照組(1％泊洛沙姆生理鹽水)、脈絡(luò)寧提取物注射液低、中、高劑量組(15、30、60g/kg)、脈絡(luò)寧中劑量口服給藥組(30g/kg)、市售脈絡(luò)寧組(30g/kg)，除第5組外均靜脈注射，給藥容積為0.2mL/10g，連續(xù)給藥7天，每天1次。末次給藥后用20％烏拉坦0.7mL/100g給小鼠肌注麻醉，用橡皮膏輕輕拉去小鼠耳廓毛，腹位固定在觀察臺上，耳廓平展，用10×10倍鏡觀察小鼠微循環(huán)，上述操作在30min內(nèi)完成。記數(shù)耳廓毛細血管開放量，用顯微測微尺側(cè)耳廓動脈(A)、靜脈(V)口徑。脈絡(luò)寧提取物注射液30、60g/kg對小鼠耳廓微循環(huán)有非常顯著地改善作用，且其作用優(yōu)于口服給藥組和市售脈絡(luò)寧組。
脈絡(luò)寧提取物注射液對小鼠耳廓微循環(huán)的影響(X±SD)見下表

給藥組與對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.014.脈絡(luò)寧提取物注射液對血淤癥大鼠血液流變學的影響將70只雄性大鼠按體重均衡分組，每組10只。分別為正常對照組、血淤模型組、脈絡(luò)寧提取物注射液10、20、40g/kg三個劑量組、脈絡(luò)寧灌胃給藥組，劑量為20g/kg及市售脈絡(luò)寧注射液20g/kg組。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天，正常對照組和模型對照組給相當容積的1％泊洛沙姆生理鹽水，給藥容積為0.5mL/100g，給藥速度為2.0mL/min，第6天給藥后禁食不禁水，末次給藥后水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，尾靜脈快速推注10％高分子右旋糖酐1.0mL/100g。1hr后開胸，心臟取血4mL，肝素0.1mL抗凝。測血液流變學各項指標。結(jié)論脈絡(luò)寧提取物注射液能顯著改善血淤癥大鼠不同切變率下的全血粘度和全血還原粘度。
脈絡(luò)寧提取物注射液對血淤癥血液流變學的影響(X±SD，n＝10)見下表

給藥組與對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01脈絡(luò)寧提取物注射液對血淤癥血液流變學的影響(X±SD)見下表

給藥組與對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01試驗結(jié)論1、脈絡(luò)寧提取物注射液(10、20、40g/kg)連續(xù)7天靜脈注射給藥能顯著抑制ADP、膠原、凝血酶誘導的大鼠血小板聚集。
2、脈絡(luò)寧提取物注射液(10、20、40g/kg)連續(xù)7天靜脈注射給藥能顯著改善MCAO大鼠的神經(jīng)癥狀，對其腦梗死有顯著保護作用。
3、脈絡(luò)寧提取物注射液(10、20、40g/kg)連續(xù)7天靜脈注射給藥能顯著抑制大鼠下腔靜脈血栓形成。
4、脈絡(luò)寧提取物注射液(10、20、40g/kg)連續(xù)7天靜脈注射給藥能高分子右旋糖酐致大鼠血淤癥的血液流變學各項指標。
5、脈絡(luò)寧提取物注射液(5、10、20g/kg)連續(xù)7天靜脈注射給藥顯著抑制家兔頸總動脈血栓形成。
6、脈絡(luò)寧提取物注射液(15、30、60g/kg)連續(xù)7天靜脈注射給藥對膠原-腎上腺素誘發(fā)的小鼠肺血栓死亡有顯著保護作用。
7、脈絡(luò)寧提取物注射液(15、30、60g/kg)連續(xù)7天靜脈注射給藥顯著改善小鼠耳廓微循環(huán)。
脈絡(luò)寧提取物注射液(10、20、40g/kg)連續(xù)7天靜脈注射給藥能顯著抑制ADP、膠原、凝血酶誘導的大鼠血小板聚集；顯著改善MCAO大鼠的神經(jīng)癥狀，對其腦梗死有顯著保護作用；顯著抑制大鼠下腔靜脈血栓形成；顯著改善腎上腺素致大鼠腸系膜微循環(huán)障礙及高分子右旋糖酐致大鼠血淤癥的血液流變學各項指標；5、10、20g/kg連續(xù)7天給藥顯著抑制家兔頸總動脈血栓形成；15、30、60g/kg連續(xù)7天給藥對膠原-腎上腺素誘發(fā)的小鼠肺血栓死亡有顯著保護作用，顯著改善小鼠耳廓微循環(huán)。綜上所述，脈絡(luò)寧提取物注射液在所選劑量范圍內(nèi)，能顯著抑制血小板聚集和動、靜脈血栓形成，對MCAO大鼠腦梗死有顯著保護作用，對微循環(huán)障礙有顯著改善作用和改善血淤模型大鼠全血粘度等各項指標。
實驗例1本實驗例說明了本發(fā)明脈絡(luò)寧粉針劑治療血瘀癥臨床試驗的效果。
一、觀察指標1)主要療效指標(1)脈絡(luò)瘀血；(2)皮下瘀斑；(3)脈澀、無脈或沉弦、弦遲。
2)次要療效指標(1)肢體麻木或偏癱；(2)中醫(yī)證候3)安全性指標(1)血、尿、便常規(guī)、心、肝、腎功能；(2)血壓。
二、試驗總設(shè)計本實驗例是考察脈絡(luò)寧注射液治療心力衰竭的臨床療效和安全性，按照《技術(shù)要求》，將受試例數(shù)定為240例，治療組120例，對照組120例。療程設(shè)定為28天。
三、受試者的選擇和退出1、閉塞性脈管炎、靜脈血栓形成及動脈硬化閉塞癥西醫(yī)診斷標準(1)肢端發(fā)涼，怕冷，麻木，足及小腿脹痛和抽搐；(2)營養(yǎng)障礙，包括皮膚干燥、脫屑、皺裂、汗毛脫落、趾甲增厚、變形、停止生長、肌肉松馳或萎縮；(3)游走性血栓性靜脈炎；(4)動脈搏動減弱或消失；(5)皮色改變；(6)壞疽和潰瘍。
2、血栓及后遺癥西醫(yī)診斷標準A、下列一項以上神經(jīng)癥狀或體征，且至少持續(xù)24小時。
(1)意識障礙。
(2)視力、視野障礙。
(3)輕癱或偏癱，或兩側(cè)癱瘓(尤其于腦干損害時)。
(4)偏側(cè)感覺障礙。
(5)言語障礙。
(6)吞咽困難。
(7)運動失調(diào)。
B、腦脊液無色、透明C、可見以下一項以上輔助檢查的陽性改變(1)CT掃描可見提示腦水腫、腦缺血病變的低密度區(qū)域，而無出血性改變。
(2)腦血管造影發(fā)現(xiàn)一支或一支以上主干動脈高度狹窄或閉塞改變。
(3)腦掃描提示腦梗塞而除外腦腫瘤。
D、診斷判斷(1)確定診斷完全具備A和B。
(2)高度可能具備A至B、及C中(3)項。
四、脈絡(luò)血瘀證中醫(yī)辨證相當于第一、二期合并血栓性淺靜脈炎者或第三期輕度壞疽、潰瘍繼發(fā)感染者。表現(xiàn)為刺痛、痛有定處，拒按；脈絡(luò)瘀血；皮下瘀斑；舌質(zhì)紫暗，舌體瘀斑、瘀點；澀脈或無脈；肌膚甲錯；肢體麻木或偏癱；善忘。
五、療效判定與結(jié)果1.臨床近期痊愈血瘀的臨床癥狀、體征消失或基本消失，為95％。
2.顯效血瘀的臨床癥狀、體征明顯改善，為70％。
3.有效血瘀的臨床癥狀、體征均有好轉(zhuǎn)，為30％。
4.無效血瘀的臨床癥狀、體征均無明顯變化，甚至加重，為30％。注計算公式(尼莫地平法)[(治療前積分-治療后積分)/治療前積分]×100％。
六、結(jié)論本發(fā)明產(chǎn)品具有清熱養(yǎng)陰，活血化瘀的功效。用于血栓閉塞性脈管炎，靜脈血栓形成，動脈硬化性閉塞癥，腦血栓形成及后遺癥等。主要藥效學試驗表明，本發(fā)明產(chǎn)品具有清熱養(yǎng)陰，活血化瘀，改善血液循環(huán)和血液流變性作用。
實驗例2本實驗例說明本發(fā)明粉針劑長期毒性試驗結(jié)果1.劑量按照最大劑量100g生藥/Kg/天給藥。相當于人用藥量的30倍。
2.給藥時間2個月。
3.動物數(shù)根據(jù)新藥審評要求，犬的實驗動物數(shù)為4只或6只，選用4只犬。
4.結(jié)果表1犬長毒各組給藥前后血清尿素氮(BUN)值(mmol/L) √犬的正常值1.78～8.53mmol/L(5～25mg/dl)(藥理實驗方法學1221頁)√人的正常值2.9～6.4mmol/L(中國百科全書簡介11頁)表2犬長毒各組給藥前后血清肌酐(Cr)值(μmol/L) √Cr升高表示Cr清除減少是腎功能損傷指標√犬正常值70～180μmol/L√人正常值53～159μmol/L5.結(jié)論從所進行過的4只犬和大鼠長毒實驗結(jié)果都可以看出所有血液生化指標(給藥前后)均在正常范圍內(nèi)，說明動物健康。
實驗例3
下表3說明本發(fā)明粉針劑及其制備方法與現(xiàn)有市售產(chǎn)品在工藝穩(wěn)定性及產(chǎn)品質(zhì)量上的對比效果。
將本發(fā)明產(chǎn)品粉針劑和市售品同時按臨床用法加入到葡萄糖或氯化鈉溶液中進行比較。
表3 以上各項主要技術(shù)指標說明本發(fā)明的制備方法工藝穩(wěn)定，產(chǎn)品達到“中藥新藥制備工藝研究的技術(shù)要求”的有關(guān)規(guī)定，與現(xiàn)有方法制備的產(chǎn)品在質(zhì)量上無差別。
實驗例4本實驗例說明本發(fā)明粉針劑的穩(wěn)定性。
根據(jù)《藥品注冊管理辦法》及《中藥注射劑研究的技術(shù)要求》，采取室溫留樣觀察法，在臨床用用包裝條件下(玻瓶)按質(zhì)量標準要求進行六個月的初步觀察，分別于樣品生產(chǎn)后的0，1，2，3，6月各檢測一次，共檢測了五次，結(jié)果表明本發(fā)明粉針劑穩(wěn)定性很好。整個穩(wěn)定性考察還在繼續(xù)進行當中。初步穩(wěn)定性考察結(jié)果如下；結(jié)果見表4、5、6。
表4室溫考察樣品實施例1制備日期2003年3月13日 表5室溫考察樣品實施例2制備日期2003年3月14日 表6室溫考察樣品實施例3制備日期2003年3月15日
實驗例5本例為脈絡(luò)寧注射液中總黃酮的含量測定(一)方法的確定金銀花中含木犀草素等黃酮類成分，玄參也含有少量黃酮類成分。且根據(jù)工藝黃酮類成分在制備中能較完全地被提取。據(jù)文獻報道，木犀草素等黃酮類成分具有使動脈壓增加而降低靜脈壓的作用，可增加冠狀動脈血流量，與成品的功能主治相符，是成品中的有效成分，因此以總黃酮為含量測定的指標。
關(guān)于總黃酮的含量測定，文獻報道有TLCS、紫外分光光度法、比色法等，其中以比色法居多，且多為以蘆丁為對照品。原申報資料中已經(jīng)進行了總黃酮的含量測定方法的研究，現(xiàn)針對按新工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品重新進行方法學研究如下1.方法(1)樣品制備對照品溶液精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品10mg，置100ml量瓶中，加50％甲醇適量，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml中含蘆丁0.10mg)。
供試品溶液精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
缺金銀花的陰性對照溶液稱取牛膝、石斛、玄參各100g，照實施例1-1方法，制成缺金銀花的脈絡(luò)寧注射液陰性樣品，照前述供試品溶液的制備方法制成缺金銀花的陰性對照溶液。
缺金銀花、玄參的雙陰性對照溶液稱取牛膝、石斛各100g，照工藝制成缺金銀花、玄參的脈絡(luò)寧注射液，照前述供試品溶液的制備方法制成缺金銀花、玄參的雙陰性對照溶液(2)測定標準曲線的制備精密量取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分別置10ml量瓶中，精密加入5％的亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6分鐘，加10％硝酸鋁溶液0.6ml，搖勻，放置6分鐘，加8.6％氫氧化鈉溶液3ml，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白。照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V B)，在510nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
供試品溶液的測定精密量取供試品溶液3ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為空白對照；另精密量取供試品溶液3ml，置10ml量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中相當于蘆丁的重量，計算，即得。
(二)總黃酮的含量測定方法學考察1.試劑與儀器試劑硝酸鋁分析純，天津市化學試劑三廠，批號20011127；亞硝酸鈉分析純，天津市化學試劑一廠，批號900815氫氧化鈉分析純，北京化工廠，批號931016蘆丁對照品中國藥品生物制品檢定所提供，0080-9705儀器日本島津UV-2210紫外-可見分光光度儀2.顯色條件的選擇原來的方法學研究中已對①5％的亞硝酸鈉溶液；②10％的硝酸鋁溶液；③8.6％的氫氧化鈉試液三種試液的用量采用L(9)(34)正交試驗法對三種試液的加入量進行了優(yōu)選，證明分別加入5％的亞硝酸鈉溶液0.3ml、10％的硝酸鋁溶液0.6ml、8.6％的氫氧化鈉試液3ml時顯色效果最為理想，故仍采用此條件顯色。
3顯色穩(wěn)定性考察取供試品溶液(批號030212)2ml，照前面的顯色方法操作，在加入氫氧化鈉試液6ml以后立刻在510nm處以時間掃描方式在0～25分鐘內(nèi)測定吸收度。測定結(jié)果表明，在顯色后15分鐘內(nèi)吸收度最大且較穩(wěn)定，之后吸收度開始下降。與原申報資料中的研究結(jié)果一致。參照《中國藥典》2000年版一部排石顆粒質(zhì)量標準中的含量測定方法及其它有關(guān)總黃酮含量測定的參考文獻，選擇在顯色后立即測定吸收度4測定波長的選擇精密吸取0.1141mg/ml的蘆丁對照品溶液3ml，成品030315批樣品溶液，照前述顯色方法操作，在400～600nm的波長范圍內(nèi)掃描，測得蘆丁對照品溶液在506nm處有最大吸收，峰形較平，為一饅頭峰，在±5nm波長范圍內(nèi)吸收度變化小于1.3％；樣品溶液顯色后最大吸收在515nm，吸收峰同樣為一饅頭峰，±5nm波長范圍內(nèi)吸收度變化小于1.0％。另據(jù)文獻報道，總黃酮的比色法含量測定多選擇在510nm處測定吸收度，故本品總黃酮的含量測定亦選擇510nm為測定波長。
5標準曲線的制備精密稱取于120℃干燥至恒重的蘆丁對照品11.41mg于100ml量瓶中，加50％的甲醇溶解并稀釋至刻度(0.1141mg/ml)。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10ml量瓶中，精密加入5％的亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6分鐘，精密加入10％的硝酸鋁溶液0.6ml，搖勻，放置6分鐘，加8.6％的氫氧化鈉溶液3ml，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白。照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V B)，在510nm的波長處測定吸收度，以吸收度(A)為縱坐標，濃度(B)為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果見下表

由上述測定結(jié)果算得標準曲線為A＝12.006B+0.028，r＝0.9999。詳見

圖1。
6穩(wěn)定性試驗精密吸取樣品溶液(批號030314)2ml置25ml量瓶中，加入50％的甲醇至刻度，搖勻。分別在0、4、8、22、25、30小時精密吸取2ml，照前述方法顯色，以相應(yīng)濃度的供試品溶液(2ml→10ml，50％的甲醇溶液稀釋至刻度)為空白對照，在510nm波長處測定吸收度，代入標準曲線，計算，測定結(jié)果見下表

結(jié)論六個時間點的總黃酮含量的平均值為1.541mg/ml，RSD＝0.72％。結(jié)果表明，供試品溶液在30小時內(nèi)總黃酮的含量穩(wěn)定。
7精密度試驗精密吸取樣品溶液(批號030313)2ml置25ml量瓶中，加入50％的甲醇至刻度，搖勻。精密吸取3ml共5份，照前述方法顯色，在510nm的波長處測定吸收度，代入標準曲線，計算，測定結(jié)果見下表

結(jié)論6次測定的平均值為1.511mg/ml，RSD＝2.51％。結(jié)果表明，本方法精密度良好。
8重復性試驗取實施例2-1至2-6產(chǎn)品溶液2ml，共6份，分別置25ml量瓶中，加50％的甲醇至刻度，搖勻。精密量取2ml于10ml量瓶中，加50％的甲醇至5ml，加入5％的亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6分鐘，精密加入10％的硝酸鋁溶液0.6ml，搖勻，放置6分鐘，加8.6％的氫氧化鈉溶液3ml，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V B)，在510nm的波長處測定吸收度，代入標準曲線，計算，測定結(jié)果見下表

結(jié)論該批樣品的總黃酮含量6次重復測定的平均值為1.522mg/ml，RSD＝1.30％。結(jié)果表明，本方法的重復性良好。
9回收率試驗蘆丁對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁對照品17.35mg于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(0.694mg/ml)。
供試品溶液的制備精密量取樣品溶液(批號030312)1.0、1.5、2.0ml各2份，置25ml量瓶中，各精密加入上述蘆丁對照品溶液2.0、2.0、3.0、3.0、3.5、3.5ml，各加50％的甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定精密量取上述供試品溶液2ml，照前述擬定的方法顯色，在510nm的波長處測定吸收度，代入標準曲線，以下式計算回收率，結(jié)果列于表20，結(jié)果表明本方法回收率好。

表20.總黃酮回收率測定結(jié)果

10樣品中總黃酮的含量測定測定實施例2-1至2-5中總黃酮的含量，結(jié)果列于下表總黃酮含量測定結(jié)果

五批樣品總黃酮含量平均值為2.81mg/ml。
實驗例6本例為脈絡(luò)寧注射液中金銀花的含量測定采用HPLC法，以綠原酸為指標，測定金銀花的含量?，F(xiàn)對實施例1-1至實施例1-4、實施例2-1五批產(chǎn)品中綠原酸的含量進行了測定。
1、儀器與試劑Waters 2695高效液相色譜儀；Waters 2996二極管陣列檢測器；Empower數(shù)據(jù)處理軟件；甲醇(色譜純)Fisher Scientific公司，批號020215水重蒸餾水；冰醋酸(AR級)，蘇州市第二化工研究所，批號000201綠原酸對照品中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號0753-200111。
2、色譜條件色譜柱Kromasil C18(Φ4.6×250mm，5μm)柱溫25℃流動相甲醇-水-冰醋酸(15∶85∶1)，流速0.8ml/min進樣量10μl波長330nm3、樣品制備對照品溶液取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1ml中含50μg的溶液。
供試品溶液精密量取樣品溶液5ml，置25ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。
缺金銀花的陰性對照溶液稱取牛膝、石斛、玄參各10g，照工藝制成缺金銀花的脈絡(luò)寧注射液，照前述供試品溶液的制備方法制成缺金銀花的陰性對照溶液。
4、陰性對照試驗在前述色譜條件下，精密吸取上述對照品溶液和缺金銀花的陰性對照溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄HPLC圖，結(jié)果表明陰性樣品在綠原酸峰保留時間處(約16.6分鐘)有一小而寬的色譜峰，但因峰面積太小而難以將其峰面積積分出來。據(jù)《中藥新藥研究指南》，空白試驗對樣品的干擾允許在5％以下，因此可認為陰性樣品對樣品中綠原酸的測定基本無干擾，與原研究結(jié)果一致。
5、樣品測定與結(jié)果按前述方法對五批樣品進行了測定，測定結(jié)果見下表

按照中國專利CN92107848.X制得的樣品，綠原酸含量平均值為102.2μg/ml，遠遠低于本發(fā)明方法制得的產(chǎn)品。
實驗例7本例為脈絡(luò)寧注射液中玄參的含量測定1.儀器及試劑Waters 2695高效液相色譜儀；Waters 2996二極管陣列檢測器；Empower數(shù)據(jù)處理軟件；試劑甲醇(色譜純)Fisher Scientific公司，批號020215水重蒸餾水；冰醋酸(AR級)，蘇州市第二化工研究所，批號000201肉桂酸對照品中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號0786-9802.
2.色譜條件色譜柱Kromasil C18(Φ4.6×250mm，5μm)柱溫25℃流動相甲醇-水-冰醋酸(45∶55∶0.2)，流速0.8ml/min進樣量10μl波長273nm3.樣品制備對照品溶液取肉桂酸對照品適量，加甲醇制成每1ml中含50μg的溶液。
供試品溶液取樣品原液直接進樣。
缺玄參的陰性對照溶液稱取牛膝、石斛、金銀花各10g，照工藝制成缺玄參的脈絡(luò)寧注射液，即得缺玄參的陰性對照溶液。
4.陰性對照試驗在前述色譜條件下，精密吸取上述對照品溶液和缺玄參的陰性對照溶液各10μl，注入HPLC儀，記錄HPLC圖，結(jié)果表明陰性樣品在肉桂酸峰保留時間處(約18.6分鐘)無色譜峰出現(xiàn)，說明陰性樣品對樣品中肉桂酸的測定無干擾。
5.樣品測定與結(jié)果

三批按照中國專利CN92107848.X制得的樣品測定結(jié)果

6.結(jié)論陰性樣品對肉桂酸的測定無干擾。本品五批新工藝生產(chǎn)的樣品肉桂酸含量平均值為44.4μg/ml，高于中國專利CN92107848.X工藝生產(chǎn)產(chǎn)品的肉桂酸含量平均值為39.1μg/ml。
實驗例8本例為脈絡(luò)寧注射液中牛膝的含量測定1.儀器及試劑Waters 2695高效液相色譜儀；Waters 2996二極管陣列檢測器；Empower數(shù)據(jù)處理軟件；試劑乙腈(色譜純)Fisher Scientific公司，批號020109。
水重蒸餾水；蛻皮甾酮對照品由北京大學藥學院天然藥物學系提供。
2.色譜條件色譜柱Kromasil C18(Φ4.6×250mm，5μm)，柱溫30℃，流動相乙腈-水(1∶5.4)，流速1.0ml/min，進樣量10μl
波長243nm3.樣品制備對照品溶液取蛻皮甾酮對照品適量，加甲醇制成每1ml中含50μg的溶液。
供試品溶液精密量取樣品溶液25ml，置分液漏斗中，加氯化鈉2.5g，振搖使溶解，用水飽和的正丁醇提取六次，每次25ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水20ml洗滌，洗滌液用水飽和的正丁醇20ml萃取，合并正丁醇液，置水浴上蒸干，殘渣加60％甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加60％的甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。
缺牛膝的陰性對照溶液稱取玄參、石斛、金銀花各50g，照工藝制成缺牛膝的脈絡(luò)寧注射液，照供試品溶液的制備方法制得缺牛膝的陰性對照溶液。
4.陰性對照試驗在前述色譜條件下，精密吸取上述缺牛膝的陰性對照溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄HPLC色譜圖，結(jié)果表明陰性樣品在蛻皮甾酮峰保留時間處(約30.3分鐘)無色譜峰出現(xiàn)，說明陰性樣品對樣品中蛻皮甾酮的測定無干擾。
5.樣品測定與結(jié)果按前述方法對本發(fā)明的五批樣品進行了測定，測定結(jié)果見下表

按照中國專利CN92107848.X制得的樣品測定結(jié)果見下表

6.結(jié)論本發(fā)明工藝生產(chǎn)的樣品蛻皮甾酮含量平均值為47.7μg/ml，遠遠高于中國專利CN92107848.X制得樣品的蛻皮甾酮含量。
實驗例9本實驗例為本發(fā)明產(chǎn)品急性毒性試驗脈絡(luò)寧提取物注射液靜脈注射給小白鼠LD50大于1600g/kg，按體重計算，相當于成人用量的480倍；腹腔注射給小白鼠LD50大于2000g/kg，按體重計算，相當于成人用量的606倍。
試驗目的觀察受試物在一日內(nèi)給予小白鼠最大給藥量后(靜脈注射和腹腔注射)所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況，以考查其臨床用藥的安全性。
試驗材料1.受試物名稱脈絡(luò)寧提取物注射液規(guī)格與含量100mL中含提取物17g，相當于原生藥2000g。
批號030211提供單位哈爾濱天工科學院2.受試動物名稱小白鼠品系昆明種性別雌雄兼用體重18-22g每組動物數(shù)20只合格證號SCXK(遼)2003-008提供單位沈陽藥科大學實驗動物中心試驗方法與結(jié)果1、靜脈注射給藥將40只小鼠按體重、性別均衡分成2組，每組20只，雌雄各半，給藥組小鼠靜脈注射脈絡(luò)寧提取物注射液，給藥容積為0.4ml/10g，注射速度為0.06mL/s，劑量為800g/kg；對照組給等容積的1％泊洛沙姆0.9％氯化鈉注射液，8小時后分別再給藥1次。給藥后觀察一周，發(fā)現(xiàn)除小鼠活動減少、心跳加快、尿液顏色變深(接近藥物顏色)，20分鐘后恢復正常外，余未發(fā)現(xiàn)受試小鼠有明顯中毒反應(yīng)，20只小鼠全部存活。七天后對照組小鼠體重與給藥組小鼠體重無顯著性差異，尸檢肉眼下未發(fā)現(xiàn)受試小鼠主要臟器有明顯病變。小鼠體重變化如下表所示。
脈絡(luò)寧提取物注射液靜脈注射給藥對小白鼠體重的影響(X±SD)見下表

2、腹腔注射給藥小鼠分組同上。給藥組小鼠腹腔注射脈絡(luò)寧提取物注射液，給藥容積為0.5ml/10g，劑量為1000g/kg；對照組給等容積的0.9％氯化鈉注射液，8小時后分別再給藥1次。給藥后觀察一周，中毒反應(yīng)同上。20只小鼠全部存活，七天后對照組小鼠體重與給藥組小鼠體重無顯著性差異，尸檢肉眼下未發(fā)現(xiàn)受試小鼠主要臟器有明顯病變。小鼠體重變化如下表所示。
脈絡(luò)寧提取物注射液腹腔注射給藥對小白鼠體重的影響(X±SD)見下表

結(jié)論脈絡(luò)寧提取物注射液靜脈注射給小白鼠LD50大于1600g/kg，按體重計算相當于成人用量480倍；腹腔注射給小白鼠LD50大于2000g/kg，按體重計算，相當于成人用量的606倍。
權(quán)利要求
1.脈絡(luò)寧注射劑，其特征在于，所述的脈絡(luò)寧注射劑濱蒿內(nèi)酯含量為2.0-5.5μg/mL、總黃酮含量以蘆丁計2.0-3.5mg/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脈絡(luò)寧注射劑，其特征在于，所述的脈絡(luò)寧注射劑中肉桂酸含量為40-51μg/mL，綠原酸含量為140-205μg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脈絡(luò)寧注射劑，其特征在于，所述的脈絡(luò)寧注射劑中甾酮含量為45-50μg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脈絡(luò)寧注射劑，其特征在于，所述的脈絡(luò)寧注射劑中，重金屬含量≤10ppm，砷鹽≤1ppm，熾灼殘渣≤0.8％(g/mL)，總固體≥16.3mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脈絡(luò)寧注射劑，其特征在于，所述的脈絡(luò)寧注射劑的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、草酸鹽、鉀離子符合中國藥典2000版一部注射劑項下的有關(guān)規(guī)定。
6.一種脈絡(luò)寧注射劑的制備方法，其特征在于，藥物有效成分的提取通過如下步驟實現(xiàn)1)將如下重量份的原料組分牛膝 100-1000玄參 100-1000石斛 100-1000金銀花100-1000沖洗干凈，切成片或段或粉，與金銀花一并投入提取罐內(nèi)，加1-10倍量的0％-99.5％乙醇水溶液浸泡1小時后，40-85℃下加熱回流提取1-5次，每次提取1-2小時，濾過，濾液備用；合并濾液，濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；2)加入95％乙醇，攪拌，使上清液乙醇含量在75-85％，0-10℃靜置12-24小時，濾取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；3)加入1-3倍濃縮液體積的乙酸乙酯，萃取3-7次，每次萃取5-15分鐘，合并上清液，回收乙酸乙酯，并除去乙酸乙酯，濃縮至稠膏(80℃)，為藥物有效成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟3)為使用大孔樹脂進行純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟1)和2)之間增加一步驟為向濃縮液中加入1/10體積的濃度為0.5％-10％明膠水溶液，攪拌，0-10℃放置12-24小時，離心，得上清液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的有效成分的提取過程為1)將上述組分中的牛膝、玄參、石斛沖洗干凈，切成片或段或粉，與金銀花一并投入提取罐內(nèi)，加1-10倍量的0％-99.5％乙醇水溶液浸泡1小時后，40-85℃下加熱回流提取1-5次，每次提取1-2小時，濾過，濾液備用；合并濾液，濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；2)向濃縮液中加入1/10體積的濃度為0.5％-10％明膠水溶液，攪拌，0-10℃放置12-24小時，離心，得上清液；3)將上清液通過大孔樹脂進行純化，得到藥物有效成分，配以輔料制備粉針劑或注射液。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的有效成分的提取過程為1)將上述組分中的牛膝、玄參、石斛沖洗干凈，切成片或段或粉，與金銀花一并投入提取罐內(nèi)，加1-10倍量的水浸泡1小時后，40-85℃下加熱回流提取1-5次，每次提取1-2小時，濾過，濾液備用；合并濾液，濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；2)向濃縮液中加入ZTC預處理劑A組分，煮沸15-20分鐘后，靜置4-5小時，離心分離得上層清液；再加入ZTC預處理劑A組分，煮沸15-20分鐘后，靜置3小時，過濾，濾液中加入ZTC澄清劑B組分，加熱至沸，放置4-6小時，離心后過濾，濾液經(jīng)多層濾紙板框壓濾后，濃縮至比重1.10-1.20(80℃)；3)加入95％乙醇，攪拌，使上清液乙醇含量在75-85％，0-10℃靜置12-24小時，濾取上清液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10-1.20(80℃)；4)通過大孔樹脂進行純化，得到藥物有效成分，配以輔料制備粉針劑或注射液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥注射液“脈絡(luò)寧”注射劑及其制備方法，屬于中藥制劑領(lǐng)域。本發(fā)明所述的脈絡(luò)寧注射劑，由牛膝、玄參、石斛與金銀花經(jīng)一級醇提取、明膠沉淀、二級醇沉得到藥物有效成分，再經(jīng)乙酸乙酯萃取分離，通過冷凍干燥制得；其中，一級醇提取使用的溶液為0.5％－99.5％乙醇水溶液，明膠沉淀使用0.5％－10％明膠水溶液，二級醇沉時應(yīng)使上清液含醇量為75－85％；本發(fā)明產(chǎn)品在純度上有了很大的提高，有效的去除了鞣質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)等雜質(zhì)；粉針劑較之傳統(tǒng)的液態(tài)針劑，有效的延長了藥物的有效期，使其具有很好的穩(wěn)定性，方法工藝簡單，鞣質(zhì)等雜質(zhì)去除徹底，得到的產(chǎn)品產(chǎn)率和純度較高。
文檔編號A61P7/00GK1660314SQ200410102948
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者崔國強 申請人:崔國強