專利名稱：快速分離,純化核糖核酸(rna)的試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種快速分離，純化核糖核酸(RNA)的方法及所需試劑。
核糖核酸(RNA)是構(gòu)成生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，它以單鏈的形式廣泛地存在于生命體內(nèi)。由于它的單鏈形式，加之核糖核酸酶廣泛地存在于周圍環(huán)境中，它很容易降解。因此，核糖核酸(RNA)的抽提，純化特別困難。發(fā)明一個好的分離，純化核糖核酸(RNA)的方法，一直是科學(xué)家的努力方向。
在目前現(xiàn)存的RNA分離，純化方法過程中，科學(xué)家們普遍感到困難的有五個方面1)分離純化環(huán)境中廣泛存在著核糖核酸酶(RNase酶)，它們能迅速降解RNA；2)分離RNA需要復(fù)雜的操作技術(shù)，有的還需要很長時間離心，并且得量少；3)混在其間的脫氧核糖核酸(DNA)，蛋白質(zhì)和其它的有機物質(zhì)很難被去除；4)分離，純化所需的試劑需要保持新鮮，存放的時間很短；5)分離出來的RNA，保存時間短。
為了克服以上所存在的問題，本發(fā)明介紹一種操作簡單的混合試劑，并以此試劑來分離純化RNA的方法。試劑的制備及操作方法如下溶液的配制溶液A100mM檸檬酸鈉(Sodium citrate)，0.1％尿素，30mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1％二巰基乙醇(2-mercaptoethanol)，5M硫氰酸胍或異硫氰酸胍或氯化胍，以上成份調(diào)節(jié)PH值至6.5-7.0。*注0.1％二巰基乙醇(2-mercaptoethanol)需待使用前最后加入。溶液B80％PH值為6.5的酚，20％氯仿。溶液C100％異丙醇(isopropanol)。溶液D100mM檸檬酸鈉(Sodium citrate)，30mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5M硫氰酸胍或異硫氰酸胍或氯化胍，以上成份調(diào)節(jié)PH值至6.5-7.0。將以上成份溶入焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。
基本過程取107-108動植物細(xì)胞，或30mg組織，1-2ml血液，用生理鹽水清洗后，離心，在細(xì)胞沉淀物中加入600ul溶液A。充分混合后使細(xì)胞破裂，然后加入600ul溶液B。混合后離心14000rpm 15分鐘，此時試管內(nèi)溶液可分成三層，第一層為RNA，第二層為DNA和蛋白質(zhì)，第三層為酚和氯仿，仔細(xì)吸取第一層溶液，轉(zhuǎn)入一新試管再加入等量的溶液C，在冰上放置30分鐘后，離心15分鐘，RNA沉淀，除去上清，將沉淀物與750ul 100％乙醇，250ulDEPT水混合后，在4℃環(huán)境下，10000rpm離心10分鐘。沉淀干燥后為RNA。加入溶液D混合后，在-20℃環(huán)境下可保存三個月至五年。
該方法抽提純化的RNA可用于RT-PCR；Northern，dot與slot雜交；cDNA合成；mRNA提純，RNA differential display；RDA(RNA differential analysis)該方法有如下優(yōu)點1)分離純化的RNA純度高，得量高，很少或無雜質(zhì)混雜。且能保存較長時間；2)溶液中存在著多種核糖核酸酶抑制劑，能很快使周圍溶液中的核糖核酸酶失去活性，從而控制了核糖核酸的降解；3)實驗時間短，整個過程只需一個小時；4)試劑可保存較長時間。
此方法實施十分簡便，只需按說明書做即可。
下面是一個實例含有詳細(xì)步驟1.取107-108常規(guī)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，用1ml生理鹽水清洗；2.以5000rpm離心5分鐘，除去上清，將沉淀物轉(zhuǎn)入一個1.5ml試管；3.在沉淀物中加入溶液A600ul，充分混合；4.加入600ul溶液B，充分混合后在4℃環(huán)境下離心14000rpm 15分鐘。
5.將上清(共三層，上清為第一層)轉(zhuǎn)移至1.5ml清潔試管內(nèi)，加入等量的溶液C，在冰上放置30分鐘后，在4℃環(huán)境下離心14000rpm15分鐘，除去上清。
6.在沉淀物中加入75ul 100％乙醇和25ul DEPC水混合后在4℃環(huán)境下離心10000rpm10分鐘，除去上清，沉淀干燥后加入20-50ul溶液D。
按此方法可得50-100ug RNA*注所有試管都需經(jīng)過嚴(yán)格消毒，以確保無核糖核酸酶
權(quán)利要求
一種快速分離，純化核糖核酸(RNA)的試劑組合及其方法，其特征為1)細(xì)胞或組織在一種含有多種核糖核酸酶抑制劑(檸檬酸鈉，尿素，乙二胺四乙酸，二巰基乙醇，硫氰酸胍或異硫氰酸胍或氯化胍，焦碳酸二乙酯)的裂解液(PH值為6.5-7.0)中裂解；2)然后再加入酸性(PH值為6.5)的80％酚，20％氯仿混合液混合，離心使RNA與DNA，蛋白質(zhì)完全分離；3)RNA可存放于含有多種核糖核酸酶抑制劑(100mM檸檬酸鈉，30mM乙二胺四乙酸，5M硫氰酸胍或異硫氰酸胍或氯化胍，以上成份溶入焦碳酸二乙酯水中調(diào)節(jié)PH值至6.5-7.0)。
全文摘要
快速分離,純化核糖核酸(RNA)的試劑及方法,其主要步驟為:1)組織和細(xì)胞在多種核糖核酸酶抑制劑(檸檬酸鈉,尿素,乙二胺四乙酸,二巰基乙醇,硫氰酸胍或異硫氰酸胍或氯化胍,以上成份調(diào)節(jié)pH值至6.5－7.0)的裂解液中裂解;2)氯仿,酸性酚分離RNA;3)異丙醇沉淀RNA;4)RNA溶于含有RNA酶抑制劑的水中。
文檔編號C07H1/06GK1373136SQ0110556
公開日2002年10月9日 申請日期2001年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月6日
發(fā)明者耿東進 申請人:耿東進