針對wbgZ基因鑒定宋內(nèi)氏志賀氏菌的實時熒光PCR方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測宋內(nèi)氏志賀氏菌的方法，尤其涉及一種針對WbgZ基因鑒定 宋內(nèi)氏志賀氏菌的實時熒光PCR方法，本發(fā)明還涉及宋內(nèi)氏志賀氏菌的實時熒光PCR檢測 引物和試劑盒，屬于宋內(nèi)氏志賀氏菌的檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 志賀氏菌仍然在世界許多國家和地區(qū)引發(fā)主要的健康問題，特別在不發(fā)達國家和 發(fā)展中國家由于缺乏清潔的水源、缺少必要的衛(wèi)生醫(yī)療設(shè)備等諸多因素，導(dǎo)致志賀氏菌引 發(fā)的公共健康問題更加嚴重。世界范圍內(nèi)，志賀氏菌病在1~5歲或更大一點幼兒中發(fā)病 率和致死率最高。大多數(shù)志賀氏菌病與三種志賀氏菌息息相關(guān)，即福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志 賀氏菌和痢疾志賀氏菌。在這三種志賀氏菌中，宋內(nèi)氏志賀氏菌主要在工業(yè)化國家被發(fā)現(xiàn)， 福氏志賀氏菌主要在發(fā)展中國家被發(fā)現(xiàn)，痢疾志賀氏菌是唯一引發(fā)流行和大流行志賀氏菌 病的菌株。
[0003]目前，在發(fā)展中國家由于缺乏準確可靠的鑒定技術(shù)，大多數(shù)志賀氏菌都無法鑒定 分群，對志賀氏菌的鑒定分群主要依靠常規(guī)生化鑒定方法、免疫學(xué)方法，這些方法比較復(fù) 雜、耗時耗力、敏感性低。也有一些學(xué)者研宄建立了分子生物學(xué)檢測技術(shù)主要對志賀氏菌屬 進行鑒定，但也存在一定的局限性而導(dǎo)致錯檢和漏檢現(xiàn)象。因此，建立一種準確可靠的、快 捷的志賀氏菌鑒定分群技術(shù)顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于宋內(nèi)氏志賀氏菌的實時熒光PCR檢 測的引物對及探針；
[0005] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種鑒定宋內(nèi)氏志賀氏菌的實時熒光 PCR方法；
[0006] 本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種宋內(nèi)氏志賀氏菌的實時熒光PCR 檢測試劑盒。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明根據(jù)宋內(nèi)氏志賀氏菌的WbgZ基因設(shè)計引物和探針。本發(fā)明首先公開了針 對wbgZ基因鑒定宋內(nèi)氏志賀氏菌的實時熒光PCR的引物對及探針，其中，所述引物對由核 苷酸序列為SEQIDNo.1所示的上游引物和核苷酸序列為SEQIDNo. 2所示的下游引物組 成；所述探針的核苷酸序列為SEQIDNo. 3所示；或者，
[0009] 所述引物對由核苷酸序列為SEQIDNo. 4所示的上游引物和核苷酸序列為SEQID No. 5所示的下游引物組成；所述探針的核苷酸序列為SEQIDNo.6所示；或者，
[0010] 所述引物對由核苷酸序列為SEQIDNo.7所示的上游引物和核苷酸序列為SEQID No. 8所示的下游引物組成；所述探針的核苷酸序列為SEQIDNo.9所示。
[0011] 本發(fā)明還根據(jù)ompA基因設(shè)計3對引物和探針作為內(nèi)參照，所述內(nèi)參照引物對由核 苷酸序列為SEQIDNo. 10所示的上游引物和核苷酸序列為SEQIDNo. 11所示的下游引物 組成，所述探針的核苷酸序列為SEQIDNo. 12所示；或者，所述內(nèi)參照引物對由核苷酸序列 為SEQIDNo. 13所示的上游引物和核苷酸序列為SEQIDNo. 14所示的下游引物組成，所 述探針的核苷酸序列為SEQIDNo. 15所示；或者，所述內(nèi)參照引物對由核苷酸序列為SEQ IDNo. 16所示的上游引物和核苷酸序列為SEQIDNo. 17所示的下游引物組成，所述探針的 核苷酸序列為SEQIDNo. 18所示。
[0012] 本發(fā)明用17株志賀氏菌和19株非志賀氏菌對宋內(nèi)氏志賀氏菌的實時熒光PCR 方法所用的引物和探針進行了特異性實驗，結(jié)果表明，引物對和探針Sonl-F/Sonl-R/ Sonl-P(即由SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2組成的引物對；探針的核苷酸序列為SEQID No. 3所示）特異性好，僅在宋內(nèi)氏志賀氏菌出現(xiàn)擴增曲線，在一些其它志賀氏菌（如福氏志 賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌）和非志賀氏菌均未出現(xiàn)擴增曲線。內(nèi)參照引物和探 針Ctrl-F/Ctrl-R/Ctrl-P(即由SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 11組成的引物對；探針的核 苷酸序列為SEQIDNo. 12所示）在所有細菌中均能夠出現(xiàn)擴增曲線。
[0013]而引物和探針Son2-F/Son2-R/Son2-P(即由SEQIDNo. 4 和SEQIDNo. 5 組成的 引物對；探針的核苷酸序列為SEQIDNo.6所示）、Son3-F/Son3-R/Son3-P(即由SEQID No. 7和SEQIDNo. 8組成的引物對；探針的核苷酸序列為SEQIDNo.9所示）以及內(nèi)參照 引物和探針Ctr2-F/Ctr2-R/Ctr2-P(即由SEQIDNo. 13和SEQIDNo. 14組成的引物對； 探針的核苷酸序列為3￡〇10此.15所示）、(：壯34/(：壯3-1?/(：壯3-?(即由5￡〇10此.16和 SEQIDNo. 17組成的引物對；探針的核苷酸序列為SEQIDNo. 18所示）的實時熒光PCR特 異性不好。
[0014] 因此，本發(fā)明選擇引物和探針Sonl-F/Sonl-R/Sonl-P(即由SEQIDNo. 1和SEQID No. 2組成的引物對；探針的核苷酸序列為SEQIDNo. 3所示）用于鑒定宋內(nèi)氏志賀氏菌，以 引物和探針Ctrl-F/Ctrl-R/Ctrl-P作為內(nèi)參照（即由SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 11組 成的引物對；探針的核苷酸序列為SEQIDNo. 12所示）。
[0015] 本發(fā)明所述引物對及探針能夠應(yīng)用于鑒定宋內(nèi)氏志賀氏菌。
[0016] 本發(fā)明進一步公開了一種針對wbgZ基因鑒定宋內(nèi)氏志賀氏菌的實時熒光PCR方 法，包括以下步驟：（1)提取待檢測樣品的DNA; (2)以提取的DNA為模板，以所述引物對和 探針建立PCR反應(yīng)體系，進行實時熒光PCR擴增；（3)如果實時熒光PCR擴增結(jié)果中出現(xiàn)S 型擴增曲線，則判定待檢測樣品中含有宋內(nèi)氏志賀氏菌；如果實時熒光PCR擴增結(jié)果中沒 有出現(xiàn)S型擴增曲線，則判定待檢測樣品中不含宋內(nèi)氏志賀氏菌。
[0017] 所述PCR反應(yīng)體系的總體積為 25uL，其中，F(xiàn)astStartUniversalProbeMaster 12. 5yL，lOpmol/yL上游引物 1. 0yL，lOpmol/yL下游引物 1. 0yL，lOpmol/yL探針 1. 0yL，20yg/mL的模板DNA2. 0yL，余量為滅菌蒸餾水。
[0018] 其中，所述上游引物的核苷酸序列為SEQIDNo. 1所示，所述下游引物的核苷酸序 列為SEQIDNo. 2所示，所述探針的核苷酸序列SEQIDNo. 3所示。所述探針的5'端標記 有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團；優(yōu)選的，所述熒光報告基團為FAM熒光報告基 團，所述熒光淬滅基團為TAMRA熒光淬滅基團。
[0019] 所述實時熒光？0?擴增的條件為：95°0 31^11;951：變性3〇8,591：退火3〇8,40個循 環(huán)。另外，在擴增樣品的同時，用內(nèi)參照引物和探針進行擴增，內(nèi)參照引物和探針Ctrl-F/Ctrl-R/Ctrl-P(即由SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 11組成的引物對；探針的核苷酸序列 為SEQIDNo. 12所示）的退火溫度為57°C，其余擴增條件及PCR反應(yīng)體系同引物和探針 Sonl-F/Sonl-R/Sonl-P。
[0020] 實時熒光PCR敏感性試驗結(jié)果表明，將宋內(nèi)氏志賀氏菌兩步增菌后經(jīng)PCR檢測， PCR的最低檢出限為1~3cfu/25g(mL)，證明本發(fā)明實時熒光PCR方法具有極高的敏感性。
[0021] 為了提高檢測的靈敏性，本發(fā)明在實時熒光PCR檢測前，采用了增菌步驟，其優(yōu)點 在于：使損傷的細胞得以修復(fù)，使細胞的數(shù)量增加，稀釋樣品中的抑制劑及死細胞，從而避 免出現(xiàn)假陰性或假陽性，增加檢測的靈敏度，提高檢測的可靠性。本發(fā)明結(jié)果表明，經(jīng)過增 菌之后，直接對增菌肉湯進行實時熒光PCR檢測，在其它雜菌污染輕微的食品中，檢測的靈 敏度可達1~3cfu/25g(mL