高危型人乳頭瘤病毒hpv16、18熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，本發(fā)明用于對(duì)臨床樣品中高危人乳頭瘤病毒核酸 HPV16和HPV18進(jìn)行檢測(cè)及分型的熒光PCR試劑盒，用于高危人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18 感染的臨床早期診斷。 技術(shù)背景
[0002] 宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，居于第二位，尤其在 發(fā)展中國(guó)家更為普遍。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)每年新病例約為18萬(wàn)，其中子宮頸癌死亡人數(shù)約為10 萬(wàn)，高于發(fā)達(dá)國(guó)家的宮頸癌發(fā)病率及死亡率。在發(fā)達(dá)國(guó)家由于宮頸癌的普查、診斷防治措施 比較完善，從而大大降低了宮頸癌的發(fā)病率及死亡率。因此，要降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡 率，篩查癌前病變及診斷預(yù)后是關(guān)鍵。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分（99. 7%)的宮頸癌患者的病理 樣本中均能找到人乳頭瘤病毒0?皿a/? HPV)，從而印證了 HPV是宮頸癌的 主要原因，也使宮頸癌成為目前人類所有癌癥病變中唯一一個(gè)病因明確的癌癥。所以HPV 的檢測(cè)已逐漸成為預(yù)防和控制宮頸癌發(fā)生的重要手段。
[0003] 目前已知的約有120種HPV病毒，根據(jù)其能否致癌主要分為兩類：①低危型，常見(jiàn) 的低危型HPV有HPV6、11、42、43、44等，低危型HPV主要感染人上皮細(xì)胞及粘膜上皮細(xì)胞， 形成乳頭狀瘤，即疣；②高危型（high-risk，HR)，常見(jiàn)的高危型HPV有HPV16、18、58、59和 68等，高危型HPV的E6、E7基因，能整合到宿主細(xì)胞的基因組中，使抑癌基因 p53及PRb基 因失活，細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，這是高危型HPV感染與宮頸癌發(fā)生的重要分子機(jī) 制，而在高危型的感染亞型中，檢測(cè)中最常見(jiàn)的為HPV16及HPV18,因此本試劑盒將主要檢 測(cè)HPV16及HPV18,協(xié)助宮頸癌的早期檢測(cè)。
[0004] HPV不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，故不能用簡(jiǎn)便的血清血檢測(cè)進(jìn)行HPV的診斷和分型。對(duì)其 的檢測(cè)主要依賴于細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)、組織學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)的檢測(cè)手段。傳統(tǒng)的巴氏涂 片就屬于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法，宮頸上皮細(xì)胞感染HPV后會(huì)產(chǎn)生形態(tài)學(xué)上的改變，例如凹空細(xì) 胞，細(xì)胞角質(zhì)化及多核細(xì)胞等，然后通過(guò)顯微觀察不正常的細(xì)胞作為診斷依據(jù)。但是，這種 診斷方法受取材、涂片質(zhì)量及醫(yī)生的主觀因素等的限制，其重復(fù)性差、敏感性只有50%-60%， 漏診率較高。組織學(xué)檢測(cè)手段與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)手段一樣，準(zhǔn)確率低而且病人痛苦程度大。相 比之下，分子生物學(xué)的檢測(cè)手段則更為靈敏和高效，并且可對(duì)感染的不同HPV進(jìn)行分型，有 利于疾病的預(yù)防診斷及治療，而且HPV感染的初期癥狀并不明顯，潛伏期較長(zhǎng)，分子診斷的 優(yōu)勢(shì)在HPV感染初期更可以體現(xiàn)。
[0005] 近年發(fā)展起來(lái)的PCR方法則具有靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于核酸分 析、遺傳學(xué)檢測(cè)和臨床檢測(cè)領(lǐng)域。尤其是在原普通PCR的基礎(chǔ)上，發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，通過(guò)引入特異性探針和熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)使PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增及分析的全過(guò)程可以 再單管內(nèi)封閉完成，并且可以對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及自動(dòng)分析結(jié)果，避免了 PCR后的處理，是一種先進(jìn)的分子定量檢測(cè)技術(shù)。熒光PCR技術(shù)有多種類型，主要分為熒光 染料嵌入技術(shù)、熒光探針技術(shù)和自身淬滅熒光技術(shù)等。本專利采用的是熒光染料嵌入技術(shù)， 該技術(shù)相對(duì)于熒光探針技術(shù)和自身淬滅熒光技術(shù)來(lái)說(shuō)，成本低，特異性好，由于采用了兩步 法，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，因此更適合臨床使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種高危型人乳頭瘤病毒HPV16、18熒光PCR檢測(cè)試劑盒，是用 于臨床樣本中高危人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18的快速檢測(cè)及分型的試劑盒，可用于高危 人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18感染的輔助診斷。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：一種高危型人乳頭瘤病毒HPV16、 18熒光PCR檢測(cè)試劑盒，試劑盒包含HPV16 PCR、HPV18 PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、HPV16陽(yáng) 性質(zhì)控品、HPV18陽(yáng)性質(zhì)控品、HPV16弱陽(yáng)性質(zhì)控品、HPV18弱陽(yáng)性質(zhì)控品、裂解液及蛋白酶 K溶液，HPV16PCR反應(yīng)液中包含了高危人乳頭瘤病毒HPV16特異性的正向引物、反向引物； HPV16 正向引物的序列為：5' -GTATGGAACAACATCAGAAC-3'， HPV16 反向引物的序列為：5'- ACCCCGTATATTATGGAATCT-3'， HPV18PCR反應(yīng)液中包含了高危人乳頭瘤病毒HPV18特異性的正向引物、反向引物； HPV18 正向引物的序列為：5'- ACAGGAGAGACTCCAACGAC-3'， HPV18 反向引物的序列為：5'- ATTGTGTGACGTTGTGGTTC-3'， 裂解液為：5. OmM Na0H、10.0 mM Tris-HCl (pH8.0)、0.2mM EDTA(pH8.0)、l%(V/V) TritonX-100,0. 5% (V/V)NP40,0. 5%(V/V)Tween20, HPV16 PCR反應(yīng)液還包括熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶，HPV16特異性引物、dATP、dTTP、 dGTP、dCTP四種核苷酸、含有鎂離子的緩沖液， HPV18 PCR反應(yīng)液還包括熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶，熒光染料，HPV18特異性引物、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP四種核苷酸、含有鎂離子的緩沖液， HPV16陽(yáng)性質(zhì)控品為：含插入高危人乳頭瘤病毒核酸HPV16特異性保守序列的質(zhì)粒 pCR2. 1載體，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中增殖后經(jīng)提取純化用分光光度計(jì)測(cè)定 濃度和純度后用無(wú)菌TE緩沖液定量稀釋；其中高危人乳頭瘤病毒核酸HPV16陽(yáng)性質(zhì)控 品的濃度為5. 0X107C〇pieS/ml，高危人乳頭瘤病毒核酸HPV16弱陽(yáng)性質(zhì)控品的濃度為 5. OX 103copies/ml, HPV18陽(yáng)性質(zhì)控品為：含插入高危人乳頭瘤病毒核酸HPV18特異性保守序列的質(zhì)粒 pCR2. 1載體，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中增殖后經(jīng)提取純化用分光光度計(jì)測(cè)定 濃度和純度后用無(wú)菌TE緩沖液定量稀釋，其中高危人乳頭瘤病毒核酸HPV18陽(yáng)性質(zhì)控 品的濃度為5. 0X107C〇pieS/ml，高危人乳頭瘤病毒核酸HPV18弱陽(yáng)性質(zhì)控品的濃度為 5. 0X103copies/ml ;陰性質(zhì)控品為：滅菌去離子水。
[0008] HPV16引物與HPV18引物的衍生序列也為本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述衍生序列包括 引物序列的互補(bǔ)鏈序列，同時(shí)還可以向5'端和3'方向延伸一至數(shù)個(gè)堿基或刪減一至數(shù)個(gè) 喊基得到的序列。
[0009] 本試劑盒保存于-20°C以下，盡量減少反復(fù)凍融。本發(fā)明采用的是熒光染料嵌入技 術(shù)，該技術(shù)相對(duì)于熒光探針技術(shù)和自身淬滅熒光技術(shù)來(lái)說(shuō)，成本較低，特異性好，由于采用 了兩步法，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，因此更適合臨床使用。本發(fā)明的PCR熒光定量檢測(cè)試劑盒 針對(duì)高危人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18特異性基因保守序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，能特異 性擴(kuò)增靶DNA序列從而達(dá)到臨床診斷目的。本發(fā)明與其它檢測(cè)技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、 相對(duì)于常規(guī)PCR技術(shù)，本產(chǎn)品具有操作簡(jiǎn)便，結(jié)果明了等特點(diǎn)，產(chǎn)物不用凝膠電泳檢 測(cè)，完全閉管操作，有效的減低了 PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)， 2、 檢測(cè)速度快，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作僅需約2小時(shí)， 總之本發(fā)明的試劑盒具有成本低、靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、快速明了等優(yōu)點(diǎn)，是 一種適用于臨床樣本中高危人乳頭瘤病毒核酸HPV16和HPV18的快速檢測(cè)的試劑盒。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1是高危人乳頭瘤病毒HPV16檢測(cè)的線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表 示擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，S1-S5分別表示濃度為5. OX 10sC〇pieS/ml、 5.0X107copies/ml、5.0X10 6copies/ml、5.0X105copies/ml、5.0X104copies/ml 的陽(yáng)性 質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，各3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)，NK為陰性質(zhì)控品； 圖2是根據(jù)線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的HPV16檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，圖中橫坐標(biāo)表示病毒核 酸的拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)表示Ct值； 圖3是高危人乳頭瘤病毒HPV16檢測(cè)的線性實(shí)驗(yàn)溶解曲線圖，橫坐標(biāo)代表溶解溫度，縱 坐標(biāo)代表突光強(qiáng)度； 圖4是高危人乳頭瘤病毒HPV18檢測(cè)的線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，S1-S6分別表示濃度為5. OX 10s copies/ml、5. OX IO7 copies/ml>5.0XIO6 copies/ml>5.0XIO5 copies/ml>5.0XIO4 copies/ml>5. 0XIO3 copies/ml的陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，各3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)，NK為陰性質(zhì)控品； 圖5是根據(jù)線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的HPV18標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，圖中橫坐標(biāo)表示病毒核酸的 拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)表示Ct值； 圖6是高危人乳頭瘤病毒HPV18檢測(cè)的線性實(shí)驗(yàn)溶解曲線，圖中縱坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度， 橫坐標(biāo)代表溶解溫度； 圖7是高危人乳頭瘤病毒HPV16檢測(cè)的特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò) 增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，A代表HPV16陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，B代表特異性參 考品擴(kuò)增曲線；特異性參考品分別為大腸埃希菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、金 黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌、淋病奈瑟氏菌； 圖8是高危人乳頭瘤病毒HPV16檢測(cè)的特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的溶解曲線圖，圖中橫坐標(biāo)代 表溶解溫度，縱坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度； 圖9是高危人乳頭瘤病毒HPV18檢測(cè)的特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò) 增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，A代表HPV18陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，B代表特異性參 考品擴(kuò)增曲線，特異性參考品分別為大腸埃希菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、金 黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌、淋病奈瑟氏菌；這8種特異性參考 品均未有典型的"S"型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該試劑盒特異性良好。
[0011] 圖10是高危人乳頭瘤病毒HPV18檢測(cè)的特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的溶解曲線，圖中橫坐標(biāo) 代表溶解溫度，縱坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度的變化； 圖11是高危人乳頭瘤病毒HPV16檢測(cè)的陰性實(shí)驗(yàn)數(shù)