一種提高重組蛋白包涵體形成的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種促進(jìn)重組蛋白在基因表 達(dá)時形成包涵體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌的遺傳背景清楚，目的基因表達(dá)水平高，表達(dá)系統(tǒng)成熟完善，易于培養(yǎng) (培養(yǎng)方法簡單、生長快、培養(yǎng)周期短和抗污染能力強(qiáng)）和成本低，已經(jīng)發(fā)展為一種有效基因 工程體系。目前，大量的異源蛋白特別是真核生物的基因在大腸桿菌得到了高效表達(dá)，但由 于宿主菌缺乏此種異源基因相應(yīng)的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以及細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)環(huán)境與其天然環(huán)境差 異(如氧化還原環(huán)境、胞內(nèi)pH、自由水的濃度等)，表達(dá)產(chǎn)物缺少飯以后的修飾(如糖基化、烷 基化、磷酸化、特異性的蛋白水解加工等)，同時高表達(dá)時易折疊錯誤，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物多數(shù)以 無活性的包涵體的形式存在。
[0003] 除了基因的表達(dá)宿主菌和表達(dá)的環(huán)境外，包涵體在一些外界壓力下也可以形成， 如溫度，是影響包涵體形成的主要因素。有些蛋白質(zhì)在高溫的情況下容易形成包涵體，這是 由于這些蛋白質(zhì)在高溫下容易變性而形成聚集體。
[0004] 包涵體是微生物細(xì)胞中密度最大的結(jié)構(gòu)(密度在1. 1~1. 3之間)，對機(jī)械攪拌和超 聲破碎作用不敏感。以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)在下游生產(chǎn)過程中具有一些優(yōu)越性。表現(xiàn) 在： (1) 以包涵體形式表達(dá)重組蛋白質(zhì)，包埋了蛋白酶水解的作用位點(diǎn)，可以最大限度地降 低異源表達(dá)的蛋白質(zhì)被宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)酶降解； (2) 包涵體蛋白通常不具有活性，對機(jī)械攪拌和超聲破碎作用不敏感，細(xì)胞破碎和以后 的純化步驟不用考慮蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)變化引起的失活問題； (3) 使用簡單的離心或者過濾方法就能使以包涵體形式表達(dá)的外源蛋白與宿主細(xì)胞的 其他蛋白成分進(jìn)行有效的分離，與可溶性形式表達(dá)的重組蛋白相比，分離工藝簡便和成本 低； (4) 以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)通常也不具有生物活性，降低了異源蛋白對宿主細(xì)胞 的毒性和致死效應(yīng)，從而可以高效大量地表達(dá)和積累。
[0005] 包涵體的形成的對結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)正確折疊是不利的，但是對于一些對蛋白質(zhì)空 間結(jié)構(gòu)要求不嚴(yán)格的重組蛋白的表達(dá)是非常有利的，如復(fù)性容易的重組蛋白和一些后續(xù)需 要化學(xué)試劑或蛋白酶處理的蛋白。
[0006] 工程菌所表達(dá)的異源蛋白分為可溶性部分和不溶性的包涵體部分，促進(jìn)異源蛋白 以不溶性的包涵體形式表達(dá)的因素，除與異源蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)和所用的宿主菌相關(guān)外， 還跟表達(dá)的調(diào)控條件，表達(dá)的溫度有關(guān)。一般表達(dá)速度越快，表達(dá)量越高越容易形成包涵 體。常用以異丙基-e -D-硫代半乳糖苷（IPTG)作為基因表達(dá)誘導(dǎo)物的PET系列載體，采 取提高IPTG濃度或者提高表達(dá)溫度的方法加速基因的高表達(dá)以促進(jìn)包涵體的形成。前者 由于IPTG對宿主細(xì)胞有毒性能增加的濃度有限，而后者在有些重組蛋白在溫度提高時更 易受到宿主菌蛋白酶的降解，使重組蛋白難以得到積累，造成表達(dá)量少甚至不表達(dá)的情況。 因此這兩種方法在很多重組蛋白包涵體表達(dá)上應(yīng)用受到了限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為克服已有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的提供一種工藝簡單，所需要的溶劑少， 成本低，用于促進(jìn)重組蛋白包涵體形成的方法。
[0008] 本發(fā)明提供的促進(jìn)重組蛋白包涵體形成的方法，按照下述步驟進(jìn)行： (1)菌種活化：取超低溫保藏的重組大腸桿菌，劃線接種于固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16 g/ L，酵母提取物 10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 15 g/L，卡那霉素 50 yg/mL，pH 7.0)上，37°C培 養(yǎng)12~16小時。
[0009] (2)種子液的制備：固體培養(yǎng)基挑取單菌落，接種至液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16 g/L， 酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，卡那霉素50 yg/mL，pH 7. 0)恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。
[0010] (3) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)：將種子液接種于同樣的液體培養(yǎng)基的三角形錐形瓶中，其中 接種量為1% (體積比)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)至〇〇_為0. 8時，添加異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)至終濃度0.5 mM，將三角形錐形至于超聲設(shè)備中進(jìn)行一個低強(qiáng)度短時間的處理。誘 導(dǎo)培養(yǎng)6~12小時，離心收集濕菌體，進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后利用離心法對重組蛋白包涵體的 進(jìn)行提取。
[0011] 進(jìn)一步設(shè)置，采用超聲設(shè)備為掃頻式的超聲設(shè)備（圖1，掃頻式超聲波是指超聲波 的頻率圍繞中心頻率在一個設(shè)定的范圍內(nèi)以一定掃頻周期上下波動，頻率變化如圖2所 示)，處理時間為1~4分鐘，超聲強(qiáng)度為0. 06~0. 12 W/cm3。
[0012] 通過本設(shè)定，在不提高誘導(dǎo)物IPTG濃度的前提下，低強(qiáng)度短時間的超聲處理加速 誘導(dǎo)物滲透至細(xì)胞內(nèi)，縮短了達(dá)到啟動異源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)所需誘導(dǎo)物濃度的時間，即在短 時間內(nèi)增加了誘導(dǎo)物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，促進(jìn)了重組蛋白高表達(dá)時更容易形成包涵體。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：與傳統(tǒng)的增加誘導(dǎo)物濃度促進(jìn)包涵體表達(dá)相比，不僅可以增加 包涵體表達(dá)量，還可以降低誘導(dǎo)物的使用量，降低對宿主細(xì)胞的毒害作用。同增加誘導(dǎo)溫 度的方法相比，可以適用于異源蛋白需要較低的誘導(dǎo)溫度下才能表達(dá)的工程菌。同時低 強(qiáng)度短時間的超聲處理對宿主細(xì)胞傷害少。此方法操作簡便，成本低，可提高包涵體得率 10. 6~27. 2%。下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【附圖說明】
[0014] 圖1掃頻超聲設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖，1為控制電腦，2為超聲波發(fā)生器，3為超聲處理槽， 4為大腸桿菌培養(yǎng)液，5為換能器，6和8為循環(huán)水管，7為恒溫器。
[0015] 圖2掃頻超聲頻率不意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些 實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0017] 在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相 同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0018] 實(shí)施例所用的重組菌種為大腸桿菌BL21-MF3A3(專利申請?zhí)枮椋篊N201010546991， 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為fccAericAai co/i BL21-MF3A3 CCTCC NO: M2010204)和大腸桿菌BL21-M32TO，（專利申請?zhí)枮镃N201010547009,保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏編號為 co/i BL21-M32PD CCTCC NO :M2010205)，重組基因 對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID N01和SEQ ID N02所示。
[0019] 對照方法具體如下實(shí)施： (1) 菌種活化：取超低溫保藏的重組大腸桿菌，劃線接種于固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16 g/ L，酵母提取物 10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 15 g/L，卡那霉素 50 yg/mL，pH 7.0)上，37°C培 養(yǎng)12~16小時。
[0020] (2)種子液的制備：從固體培養(yǎng)基挑取單菌落，接種至液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16 g/ L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，卡那霉素50 yg/mL，pH 7. 0)恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。
[0021] (3) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)：將種子液接種于同樣的液體培養(yǎng)基的三角形錐形瓶中，其中 接種量為1%(體積比)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)至〇〇_為0. 8時，添加異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)至終濃度1 mM，28°C誘導(dǎo)12 h (BL21-MF3A3)或37°C誘導(dǎo)6 h (BL21-M32PD)，5000 rpm離心5 min收集菌體，并進(jìn)行重組蛋白包涵體的提取。
[0022] (4)將收集到的菌體反復(fù)凍融法處理（-20° C/37° C) 5次，重懸浮于緩沖液1 (100禮恥1^04，1011111'1^8 4117.5)，利用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞3111111(3001)，8000 rpm離心5 min取沉淀，在冰浴的燒杯中加入450 ml預(yù)冷的緩沖溶液2 (50 mM Tris，10 禮￡014，100 1111恥(：1，1]\111代3，？117.5)，冰浴，超聲工作10 111111 (400 1)。將混合液于 4°C下8000 rpm離心20 min，收集包涵體沉淀，將沉淀溶于8 M尿素，12000 rpm離心收集 上清，采用BCA試劑盒測定上清液的蛋白含量。 實(shí)施例
[0023] ( 1)菌種活化同對比方法 (2) 種子液的制備同對比方法 (3) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)：將種子液接種于同樣的液體培養(yǎng)基的三角形錐形瓶中，其中接種 量為1%(體積比)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)至006(|(|為0.8時，添加IPTG至終濃度0.5 mM，將三角錐 形瓶置于掃頻式超聲設(shè)備處理槽中，在處理槽中加水，使得錐形瓶內(nèi)外的液面高度一致，打 開超聲波發(fā)生器，對發(fā)酵液進(jìn)行一個低強(qiáng)度短時間的處理(如圖1所示)。28°C誘導(dǎo)12h (BL21-MF3A3)或37°C誘導(dǎo)6h(BL21-M32PD)，離心收集濕菌體，并進(jìn)行重組蛋白包涵體的 提取，提取方法同對比方法。
[0024] 其中掃頻式的超聲設(shè)備工藝參數(shù)如下： 采用超聲設(shè)備為掃頻式的超聲設(shè)備，溫度為37°C，處理時間為1~4分鐘，超聲強(qiáng)度為 0. 06~0. 12 W/cm3。
[0025] 實(shí)施例1~8的超聲處理參數(shù)及結(jié)果如下所示：
【主權(quán)項】
1. 一種提高重組蛋白包涵體形成的方法，其特征在于，包括：工程菌發(fā)酵，重組蛋白的 超聲輔助誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞收集，包涵體純化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高重組蛋白包涵體形成的方法，其特征在于工程菌表達(dá) 的重組蛋白主要以包涵體形式存在。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高重組蛋白包涵體形成的方法，其特征在于工程菌在加 入誘導(dǎo)物后立即進(jìn)行超聲輔助處理。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高重組蛋白包涵體形成的方法，其特征在于采用掃頻超 聲進(jìn)行輔助處理。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高重組蛋白包涵體形成的方法，其特征在于采用離心法 進(jìn)行包涵體純化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高重組蛋白包涵體形成的方法，其特征在于按照下述步 驟進(jìn)行： (1)菌種活化：取超低溫保藏的重組大腸桿菌，劃線接種于固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16 g/ L，酵母提取物10g/L，NaCl5g/L，瓊脂15g/L，卡那霉素50yg/mL，pH7.0)上，37°C培 養(yǎng)12~16小時； (2)種子液的制備：固體培養(yǎng)基挑取單菌落，接種至液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨16 g/L，酵母 提取物10g/L，NaCl5g/L，卡那霉素50yg/mL，pH7.0)恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜； (3) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)：將種子液接種于同樣的液體培養(yǎng)基的三角形錐形瓶中，其中接種 量為1%(體積比)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)至00 6(|(|為0. 8時，添加異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷（IPTG) 至終濃度0.5mM，將三角形錐形至于超聲設(shè)備中進(jìn)行一個低強(qiáng)度短時間的處理； 誘導(dǎo)培養(yǎng)6~12小時，離心收集濕菌體，進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后利用離心法對重組蛋白包 涵體的進(jìn)行提取。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)重組蛋白在基因表達(dá)時形成包涵體的方法。此方法特征在于，在不提高誘導(dǎo)物濃度的前提下，低強(qiáng)度短時間的超聲處理加速誘導(dǎo)物滲透至細(xì)胞內(nèi)，使重組蛋白高表達(dá)時更容易形成包涵體。不僅可以通過降低誘導(dǎo)物的使用量來降低對宿主細(xì)胞的毒害作用，還適用于在較低的誘導(dǎo)溫度下才能表達(dá)重組蛋白的工程菌。此方法操作簡便，成本低。
【IPC分類】C12P21-02, C12R1-19
【公開號】CN104762354
【申請?zhí)枴緾N201510106291
【發(fā)明人】李云亮, 馬海樂, 何華綱, 任曉峰
【申請人】江蘇大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年3月11日