在原核系統(tǒng)中分離純化包涵體形式hiv-1蛋白酶的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了在原核系統(tǒng)中分離純化包涵體形式HIV-1蛋白酶的方法，該方法中聯(lián)合使用較低濃度的去垢劑和超聲波破碎將雜蛋白與目的蛋白分離，并且操作過(guò)程中應(yīng)用Amicon攪拌式超濾裝置，有效縮短了包涵體蛋白的純化時(shí)間。此外，該方法中蛋白復(fù)性采用了透析復(fù)性，透析過(guò)程溫和，復(fù)性后蛋白酶活性和純度較高，經(jīng)簡(jiǎn)單的超濾濃縮即可進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶生長(zhǎng)和酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定，用于晶體學(xué)和酶學(xué)研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】在原核系統(tǒng)中分離純化包涵體形式HIV-1蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)涉及I型艾滋病病毒蛋白酶的原核表達(dá)純化方法以及獲得的I型艾滋病病毒蛋白酶在晶體學(xué)和酶學(xué)研究中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，是在全球范圍內(nèi)傳播的一種疾病，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。艾滋病是由于人體感染了“人類(lèi)免疫缺陷病毒”(humanimmunodeficiency virus, HIV)所導(dǎo)致的傳染病。HIV攻擊人體免疫系統(tǒng)中最重要的⑶4淋巴細(xì)胞，破壞人的免疫系統(tǒng)造成機(jī)體的抵抗能力嚴(yán)重下降，從而感染其他的疾病導(dǎo)致各種復(fù)合感染而死亡。
[0003]HIV在病毒分類(lèi)學(xué)上屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)慢病毒屬(Ientivirus),目前已發(fā)現(xiàn)兩種HIV，分別為HIV-1和HIV-2，兩者具有相似的病毒結(jié)構(gòu)和傳播途徑。HIV-2主要分布于非洲西部，在歐洲和美洲的一些感染者中也被檢測(cè)到，其毒力和傳播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程較慢且較緩和。HIV-1廣泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1為主進(jìn)行的。
[0004]HIV-1病毒結(jié)構(gòu)為球狀的20面體，直徑為lOOnm，外膜有72個(gè)釘狀突起，都是由兩個(gè)主要外膜蛋白組成，即gpl20和gp41 ;核心含兩分子單股正RNA(9.2-9.8kb)、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶和核衣殼蛋白P24、pl7、p9及p7等。HIV-1有三個(gè)主要的基因:gag，pol和env，它們的共同點(diǎn)是編碼的多聚蛋白產(chǎn)物都需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后剪切，加工成HIV病毒的結(jié)構(gòu)基因以及一些重要的有活性的酶類(lèi)。其中，gag和env基因編碼病毒核衣殼和病毒外膜上的糖蛋白；pol基因編碼的三個(gè)重要的酶(逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶和蛋白酶)以及其他蛋白質(zhì)。HIV-1感染人體細(xì)胞主要分為入侵，復(fù)制，整合，轉(zhuǎn)錄，組裝，成熟幾個(gè)階段。首先，HIV-1進(jìn)入人體，利用病毒表面的糖蛋白gp41，gpl20識(shí)別并結(jié)合⑶4細(xì)胞表面的⑶4和CCR5(或CXCR4)受體，然后與細(xì)胞膜融合將HIV-1病毒的遺傳物質(zhì)釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成雙鏈DNA，然后在整合酶的參與下將雙鏈DNA轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核內(nèi)，隨機(jī)整合在宿主細(xì)胞的染色體中，形成原病毒，跟隨宿主進(jìn)行復(fù)制遺傳，轉(zhuǎn)錄形成mRNA，mRNA翻譯形成三種主要的多聚蛋白Env, Gag, Gag-Pol,其中Env在細(xì)胞宿主細(xì)胞的蛋白酶作用下形成外膜蛋白gpl20，gp41，與RNA和其他蛋白組裝完成出芽形成未成熟的病毒顆粒，HIV-1蛋白酶的作用下將Gag，Gag-Pol水解形成有活性的結(jié)構(gòu)蛋白和重要的酶類(lèi)，包括蛋白酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶。至此，HIV-1病毒組裝成成熟的病毒顆粒，再去感染其他的免疫細(xì)胞。由此可知，HIV蛋白酶在病毒的生活周期發(fā)揮不可取代的作用，Gag被切割成基質(zhì)蛋白(pl7，MA)，衣殼蛋白(p24，CA)，核衣殼蛋白(p7，NC)，p6，p2(SPl)，pl(SP2)。Gag-Pol 被切割成 MA，CA，p2，NC，移碼蛋白以及蛋白酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶。HIV-1蛋白酶識(shí)別多肽底物的非對(duì)稱(chēng)形狀，而不是一種特定的氨基酸序列，許多切割位點(diǎn)的氨基酸序列是不一樣。病毒蛋白酶裂解兩個(gè)前體蛋白發(fā)生在病毒顆粒從感染細(xì)胞釋放期間或釋放之后不久，因此，病毒的產(chǎn)生和釋放不需要蛋白酶的活性，但是它在促使病毒成熟形成具有感染能力的病毒顆粒中有著不可或缺的功能。HIV蛋白酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶成為治療和開(kāi)發(fā)新藥的三個(gè)重要靶點(diǎn)。[0005]HIV-1蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族，是由兩個(gè)相同亞基組成具有對(duì)稱(chēng)性的同源二聚體，每個(gè)亞基含有99個(gè)氨基酸。根據(jù)蛋白酶結(jié)構(gòu)和底物的研究，人們?cè)诓粩鄬ふ业鞍酌柑禺惤Y(jié)合的抑制劑，目前經(jīng)FDA批準(zhǔn)的PIs共9種:saquinavir, ritonavir,indinavir, nelfinavir，， amprenavir， lopinavir， atazanavir, tipranavir， darunavir。除了 tipranavir外，另外8種抑制劑都是多肽類(lèi)似物(生物利用率低)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，都含有一個(gè)羥基乙烯中心結(jié)構(gòu)，tipranavir則是一個(gè)二氫吡喃酮環(huán)結(jié)構(gòu)。由于“雞尾酒療法”HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy)的應(yīng)用，這些抑制劑在前期治療過(guò)程中確實(shí)能有效的抑制HIV的傳播，但是由于患者要承擔(dān)高昂的醫(yī)藥費(fèi)用，較高的注射劑量，發(fā)燒，腹瀉，惡心等毒副作用，以及HIV病毒高突變率產(chǎn)生抗藥性，艾滋病一直危害人類(lèi)的健康，雖然全世界眾多醫(yī)學(xué)研究人員付出了巨大的努力，至今尚未研制出根治艾滋病的特效藥物，也沒(méi)有可用于預(yù)防的有效疫苗，這也促使人們?cè)诓粩鄬ふ倚碌目笻IV-1藥物。
[0006]蛋白酶作為一個(gè)重要的靶點(diǎn)，人們?cè)诓粩鄬ふ夷軌蛴行б种频鞍酌傅目共《舅幬?。為了能夠篩選到活性高、特異性強(qiáng)的抗HIV-1蛋白酶抑制劑，需要分離純化大量的蛋白酶，對(duì)其進(jìn)行物理化學(xué)，晶體學(xué)以及酶學(xué)等方面的研究。HUi JO et al (1993)在大腸桿菌中表達(dá)和純化了包涵體形式的HIV-1蛋白酶，具體純化步驟為:取1/6菌體以TB緩沖液(IOmMTris-HCl, ImM EDTA,pH7.4)重懸菌體,高壓破菌。10000rpm/min離心,棄去上清，收集包涵體。用TB緩沖液重懸包涵體，然后離心20分鐘，收集包涵體，-20°C保存。用IOml 50%醋酸溶液溶解包涵體，1000Orpm離心30分鐘。上清進(jìn)行Sephadex G-75 (2.5x95cm)分離純化(圖1)，收集純度較高HIV-1PR，用水稀釋至醋酸濃度為25%，冷凍干燥。15mg冷凍干燥的包涵體，溶解在8mL預(yù)冷的50%醋酸溶液中，保證充分溶解。然后緩慢加入復(fù)性緩沖液(0.1M醋酸鈉，pH5.5，5%乙二醇，10%甘油)，使蛋白復(fù)性。蛋白復(fù)性后進(jìn)行超濾至lmL，然后經(jīng)過(guò)Superdex75(圖2)進(jìn)一步純化得到純度較高的HIV-1蛋白酶。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道10L發(fā)酵液能獲得85mg蛋白。試驗(yàn)測(cè)定蛋白的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax為27 μ mol/mg/min,Kcat為4.4s_l,Km為
2.5mM(HUi JO,Tomasselli AG,Reardon IM,Lull JM,Brunner DP,Tomich CS,HeinriksonRL.Large scale purification and refolding of HIV-1protease from Escherichiacoli inclusion bodies.J Protein Chem.1993Jun ; 12 (3):323-7)。該方法純化流程繁瑣,在包涵體蛋白復(fù)性前后的分離純化中，涉及到高質(zhì)量的蛋白純化儀和各種配套的價(jià)格昂貴的分離層析柱，尤其是在蛋白復(fù)性之前，由于分離純化蛋白所使用的緩沖液中含有大量的變性劑和去垢劑，會(huì)導(dǎo)致昂貴的層析柱過(guò)早惡化，造成層析系統(tǒng)使用壽命縮短，反復(fù)使用分離層析柱使蛋白損失較多。另外，去垢劑(如TritonX-100等)一旦與蛋白質(zhì)結(jié)合在后期的純化過(guò)程中很難去除，質(zhì)量不佳的去垢劑將影響蛋白質(zhì)的結(jié)晶。重組蛋白合成速度太快，沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊容易形成包涵體，因此以包涵體形式存在的蛋白表達(dá)量比較大，但是由于不正確的折疊而缺乏生物學(xué)活性，因此變性非常必要。蛋白質(zhì)稀釋復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過(guò)程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點(diǎn)幾。目前，包涵體蛋白的復(fù)性方式主要有，稀釋復(fù)性，透析復(fù)性，柱上復(fù)性。該技術(shù)中使用了稀釋復(fù)性，直接加入復(fù)性緩沖液，造成體積增大，變性劑的稀釋速度太快，往往造成蛋白質(zhì)復(fù)性中間體的聚集使蛋白無(wú)法形成正確折疊。該方案雖然最終得到的蛋白量較高，10L的發(fā)酵罐每次發(fā)酵得到85mg蛋白酶，但是得到的蛋白酶活性較低，同時(shí)IOL發(fā)酵罐的使用也是一種昂貴的投入。John M.Louis et al (1999)也在大腸桿菌中表達(dá)和純化了包涵體形式的HIV-1蛋白酶，具體步驟為:將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，挑取單克隆，使用2L搖瓶37°C擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度0D600為0.5時(shí)，加入 2mMIPTG，32 度誘導(dǎo) 4 個(gè)小時(shí)后收菌。用緩沖液 A(50mM Tris-HCl，pH8.0，5mM EDTA, 5mMbenzamidine HCl, 5mM DTT)將菌體重懸,采用低溫高壓破菌儀破菌,20000g高速離心45分鐘，得到的沉淀中含有大量的以包涵體形式存在的蛋白酶。將沉淀用含有0.5% Tritonx-100和IM尿素的緩沖液A清洗兩次，最終得到的沉淀溶解在30ml含有50mM Tris-HCl，pH7.5，8M鹽酸胍和5mM DTT的溶液中，40000rpm/min離心I小時(shí)。將上清液濃縮，進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析 Superdex 200 (660em, Amersham Pharmacia Biotech),收集純度較高 HIV-1 蛋白酶，使用緩沖液8(100禮似4(:4冊(cè).0，11111 DTT, ImM EDTA,0.05% Triton X-100)進(jìn)行稀釋復(fù)性，得到有活性的HIV-1蛋白酶，將復(fù)性后的HIV-1蛋白酶超濾濃縮，進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，得到純度較高的HIV-1蛋白酶。此蛋白可以用于晶體學(xué),酶學(xué)的應(yīng)用(John M.Louis,EwaldM.Wondrak, Alan R.Kimmel, Paul Τ.Wingfieldi, and Nashaat Τ.Nashed.ProteolyticProcessing of HIV-1Protease Precursor，Kinetics and Mechanism.THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY.1999August ；Vol (27):423437-23442)。該方法純化流程繁瑣，在包涵體蛋白復(fù)性前后的分離純化中，同樣涉及到高質(zhì)量的蛋白純化儀和各種配套的價(jià)格昂貴的分離層析柱，尤其是在蛋白復(fù)性之前，由于分離純化蛋白所使用的緩沖液中含有大量的變性劑和去垢劑，會(huì)導(dǎo)致昂貴的層析柱過(guò)早惡化，造成層析系統(tǒng)使用壽命縮短，反復(fù)使用分離層析柱使蛋白損失較多。另外，去垢劑(如TritonX-1OO等)一旦與蛋白質(zhì)結(jié)合在后期的純化過(guò)程中很難去除，質(zhì)量不佳的去垢劑將影響蛋白質(zhì)的結(jié)晶。該技術(shù)中同樣使用了稀釋復(fù)性，直接加入復(fù)性緩沖液，造成體積增大，變性劑的稀釋速度太快，往往造成蛋白質(zhì)復(fù)性中間體的聚集使蛋白無(wú)法形成正確折疊，復(fù)性效率較低。
[0007]本發(fā)明中，我們利用基因工程的方法，將HIV-1蛋白酶在大腸桿菌中大量表達(dá)，HIV-1蛋白酶的疏水性大，主要以包涵體的形式存在，需要經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)的變復(fù)性過(guò)程，以往的純化過(guò)程較為復(fù)雜并且收率較低，我們經(jīng)過(guò)技術(shù)上的改進(jìn)，優(yōu)化了 HIV-1蛋白酶原核系統(tǒng)的分離純化方法，并將其應(yīng)用到晶體學(xué)和酶學(xué)的研究中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種在原核系統(tǒng)中快速高效分離純化HIV-1蛋白酶的新方法，純化工藝流程簡(jiǎn)單，科研成本較低，并且HIV-1蛋白酶的活性能大幅度提高，并且能廣泛應(yīng)用于酶學(xué)，晶體學(xué)等基礎(chǔ)研究，以及HIV-1蛋白酶抑制劑高通量篩選中。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0010]一種在原核系統(tǒng)中分離純化包涵體形式HIV-1蛋白酶的方法，包括如下步驟:I)將離心收集的HIV-1蛋白酶表達(dá)菌用溶液A(20mM Tris-HCl, pH8.0,500mM NaCl,2mMEDTA)懸浮，并加入核酸酶DNase I，使用低溫超高壓細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞，將高壓破菌儀調(diào)至1200bar，將菌液反復(fù)高壓3次，然后在菌液中各加入2% TritonX-1OO和2% Tween20,攪拌均勻，使用超聲波處理，然后離心收集沉淀；2)用溶液B(20mMTris-HCl，pH8.0,500mMNaCl,2mM EDTA, 2 % TritonX-100, 2 % Tween20)均勻重懸沉淀，直至成無(wú)塊狀物的包涵體懸濁液，然后將懸濁液超聲處理，然后離心收集沉淀，重復(fù)操作3次；3)用溶液C(20mMTris-HCl,pH8.0,10mM NaCl，8M Urea)徹底溶解包涵體，離心取上清，然后選用截留分子量為30kD超濾膜與Amicon攪拌式超濾裝置配合使用將雜蛋白與HIV-1蛋白酶進(jìn)行分離，收集30kD超濾膜下的蛋白溶液，即得純化的HIV-1蛋白酶溶液。
[0011]其中步驟I)中超聲功率300W，開(kāi)4s，關(guān)6s，超聲20min。步驟2)中超聲處理5min，超聲功率300W，開(kāi)4s，關(guān)6s 。
[0012]所述方法中還包括HIV-1蛋白酶的表達(dá)步驟，具體為:將包含HIV-1蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒的重組菌，先使用SOC培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600為0.5，加入0.1mM的IPTG (異丙基-β-D硫代半乳糖苷)進(jìn)行。其中過(guò)夜培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為大約12小時(shí)，37°C培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選4小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)選6小時(shí)，培養(yǎng)溫度均優(yōu)選37°C。
[0013]其中，截留分子量為30kD超濾膜與Amicon攪拌式超濾裝置配合使用的具體方法:將截留分子量為30kD圓片超濾膜與Amicon Stirred Cell超濾杯組裝,將上清(最大處理量50mL)倒入超濾杯中，加蓋密封，高純氮?dú)饧訅褐?.2MPa，然后將整個(gè)裝置放在磁力攪拌器上，收集超濾膜下蛋白溶液。當(dāng)上清液濃縮至20mL時(shí)，補(bǔ)加溶液C繼續(xù)超濾至20mL，將膜下蛋白溶液合并，以備復(fù)性。
[0014]所述超濾膜優(yōu)選使用前用20%乙醇浸泡處理，然后用雙蒸水將乙醇清洗干凈。
[0015]所述方法中還包括包涵體的透析復(fù)性步驟，所述透析復(fù)性步驟為:用溶液C稀釋至蛋白濃度0.1-0.5mg/mL，然后加到透析袋中，放入4°C預(yù)冷的透析緩沖液A(雙蒸水，10%甘油，0.2% beta-巰基乙醇)中，透析4-5小時(shí)，然后將透析袋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到4°C預(yù)冷的透析緩沖液B(20MmNaAc-HAc，pH5.2，0.2% beta-巰基乙醇)中，透析4_5小時(shí)后取出透析袋中溶液，離心收集上清。
[0016]所述透析復(fù)性后的上清經(jīng)蛋白濃縮、分裝，液氮快速冷凍后放在_80°C冰箱保存。
[0017]本發(fā)明還提供了一種利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)測(cè)定HIV-1蛋白酶動(dòng)力學(xué)的方法，該方法中使用人工多妝底物 MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1 Ie-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp，所述HIV-1蛋白酶是本發(fā)明所述分離純化的HIV-1蛋白酶。
[0018]本發(fā)明還提供了一種利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)測(cè)定針對(duì)HIV-1蛋白酶的抑制劑的活性的方法，該方法中使用人工多肽底物MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1 Ie-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp,以及本發(fā)明所述分離純化的HIV-1蛋白酶。
[0019]本發(fā)明的有益效果包括如下幾個(gè)方面:
[0020]本發(fā)明優(yōu)化了培養(yǎng)基的組合方案,使HIV-1蛋白酶在大腸桿菌中穩(wěn)定表達(dá)。
[0021]本發(fā)明中的HIV-1蛋白酶包涵體的快速高效的分離純化方法，舍棄了常用的色譜純化方法，不再使用價(jià)格昂貴的蛋白純化儀以及各種分離層析柱，取而代之的是較低濃度的去垢劑和超聲波破碎機(jī)的聯(lián)合使用將雜蛋白與目的蛋白分離，以及操作過(guò)程簡(jiǎn)短的Amicon攪拌式超濾裝置，達(dá)到了分離純化蛋白的目的，并有效縮短包涵體蛋白的純化時(shí)間。
[0022]在本發(fā)明中蛋白復(fù)性采用了透析復(fù)性，體積較小，復(fù)性條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化，簡(jiǎn)化了透析液的配方，透析過(guò)程溫和，復(fù)性后蛋白酶活性和純度較高，經(jīng)簡(jiǎn)單的超濾濃縮即可進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶生長(zhǎng)和酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定，用于晶體學(xué)和酶學(xué)研究。
[0023]本發(fā)明中縮略語(yǔ)和關(guān)鍵術(shù)語(yǔ)的定義如下:
[0024]HIV-1PR:人類(lèi)免疫缺陷病毒蛋白酶
[0025]AIDS:獲得性免疫缺陷綜合征[0026]LB: Luria-Bertani 培養(yǎng)基
[0027]SOC:含營(yíng)養(yǎng)較之LB培養(yǎng)基更為豐富一種培養(yǎng)基，可用于電轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞的復(fù)蘇
[0028]IPTG:異丙基硫代-β -D半乳糖苷，一種乳糖類(lèi)似物。
[0029]SDS-PAGE:變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0030]PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0031]FRET:熒光共振能量轉(zhuǎn)移，當(dāng)一個(gè)熒光分子(又稱(chēng)為供體分子)的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子(又稱(chēng)為受體分子)的激發(fā)光譜相重疊時(shí)，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。
[0032]Km:酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時(shí)的底物濃度
[0033]Vmax:最大反應(yīng)速度
[0034]kcat:酶的轉(zhuǎn)化數(shù)，指在單位時(shí)間內(nèi)，一個(gè)酶分子將底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的分子總數(shù)，單位為s-1
[0035]kcat/Km:用來(lái)衡量酶的催化效率。
[0036]IC50:反應(yīng)初速度被抑制一半(剩余活性為50% )時(shí)抑制劑的濃度。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
`[0037]圖1:包涵體溶解后上清進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析(S^hadex G-75)。HIV-1蛋白酶的分子量為10.7kD，凝膠過(guò)濾層析后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，SDS-PAGE結(jié)果顯示第一個(gè)峰為雜蛋白峰，第二個(gè)峰為目的蛋白峰，收集純度較高的目的蛋白。
[0038]圖2 =HIV-1蛋白酶經(jīng)過(guò)復(fù)性后得到有活性的蛋白酶，將蛋白超濾至Iml進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析(Superdex75)。SDS-PAGE檢測(cè)第一個(gè)峰為HIV-1蛋白酶。
[0039]圖3:HIV-1蛋白酶基因PCR電泳結(jié)果。
[0040]圖4:15% SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。1:8M尿素溶解包涵體，高速離心后得到的沉淀，IlkD處并無(wú)條帶；2:8M尿素溶解包涵體，高速離心后得到的上清，膠圖顯示SM尿素可以將HIV-1蛋白酶完全溶解，雜蛋白主要集中在30kD以上；3:8M尿素溶解的上清經(jīng)Amicon攪拌式超濾裝置后30kD以上雜蛋白被除去；4:marker
[0041]圖5:15% SDS-PAGE結(jié)果。復(fù)性后HIV-1蛋白酶具有了水解多肽的功能，將蛋白酶濃縮至5mg/ml，SDS-PAGE檢測(cè)顯示蛋白純度較好但是存在因自酶切而出現(xiàn)的一些彌散的條帶。
[0042]圖6:文獻(xiàn)資料顯示HIV-1蛋白酶具有自剪切功能，并且其自身的氨基酸序列中存在一些自酶切位點(diǎn)。
[0043]圖7 =HIV-1蛋白酶與多肽底物反應(yīng)示意圖。根據(jù)MA/CA中HIV-1蛋白酶的剪切位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)并人工合成熒光底物。
[0044]圖8:反應(yīng)初速度與底物濃度曲線。利用軟件GraphPad Prism 5計(jì)算出Vmax =96.24 μ mol/L/min ；Km = 24.29 ±3.7 μ Μ。
[0045]圖9:HIV-1 protease 晶體。分辨率為 2.0 埃。
[0046]圖10:藥物發(fā)現(xiàn)模型。該圖為反應(yīng)過(guò)程曲線，產(chǎn)物的生成量(即熒光強(qiáng)度)與反應(yīng)時(shí)間的曲線，曲線的斜率表示單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量的變化，即曲線上任何一點(diǎn)的斜率就是該相應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)速率，在底物消耗小于10% (反應(yīng)開(kāi)始很短的時(shí)間內(nèi))范圍內(nèi)，曲線斜率為酶反應(yīng)的初速率(VO)，有不同抑制劑存在時(shí)，酶的反應(yīng)初速率(Vi)會(huì)有不同程度的下降，酶的剩余活性(Vi/V0)低于10%，為陽(yáng)性結(jié)果。
[0047]圖 11:PeptatinAIC50 的測(cè)定。將 PeptatinA 用 100% DMSO 進(jìn)行 1/2 濃度梯度稀釋?zhuān)话銣y(cè)定15個(gè)濃度梯度，然后計(jì)算PeptatinA每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的剩余活性,利用軟件Gr aphPad Pr i sm 5分析,作出剩余活性值與化合物濃度的對(duì)數(shù)值的曲線,計(jì)算出Pep tat i nAIC50 為 55.72 μ Mo
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。
[0049]實(shí)施例1:HIV-1蛋白酶的表達(dá)
[0050]設(shè)計(jì)引物PCR(圖3)將HIV-1蛋白酶編碼片段擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物及pET_lIa載體，用Nde I和BamH I酶切，回收目的片段，將酶切后的片段，與線性化載體進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化E.col1.DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化的克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。
[0051]表1:PCR 過(guò)程
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種在原核系統(tǒng)中分離純化包涵體形式HIV-ι蛋白酶的方法，包括如下步驟:1)將離心收集的 HIV-1 蛋白酶表達(dá)菌用溶液 A(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl,2mM EDTA)懸浮，并加入核酸酶DNase I，使用低溫超高壓細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞，將高壓破菌儀調(diào)至1200bar，將菌液反復(fù)高壓3次，然后在菌液中各加入2% TritonX-1OO和2% Tween20，攪拌均勻，使用超聲波處理，然后離心收集沉淀；2)用溶液B(20mMTris-HCl，pH8.0,500mMNaCl,2mM EDTA, 2 % TritonX-100, 2 % Tween20)均勻重懸沉淀，直至成無(wú)塊狀物的包涵體懸濁液，然后將懸濁液超聲處理，然后離心收集沉淀，重復(fù)操作3次；3)用溶液C(20mMTris-HCl,pH8.0,10mM NaCl，8M Urea)徹底溶解包涵體，離心取上清，然后選用截留分子量為30kD超濾膜與Amicon攪拌式超濾裝置配合使用將雜蛋白與HIV-1蛋白酶進(jìn)行分離，收集30kD超濾膜下的蛋白溶液，即得純化的HIV-1蛋白酶溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟I)中超聲功率300W，開(kāi)4s，關(guān)6s，超聲20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2)中超聲處理5min，超聲功率300W，開(kāi)4s，關(guān)6s。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，截留分子量為30kD超濾膜與Amicon攪拌式超濾裝置配合使用的具體方法:將截留分子量為30kD圓片超濾膜與Amicon Stirred Cell超濾杯組裝，將上清(最大處理量50mL)倒入超濾杯中，加蓋密封，高純氮?dú)饧訅褐?.2MPa，然后將整個(gè)裝置放在磁力攪拌器上，收集超濾膜下蛋白溶液，當(dāng)上清液濃縮至20mL時(shí)，補(bǔ)加溶液C繼續(xù)超濾至20mL，將膜下蛋白溶液合并，以備復(fù)性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述超濾膜優(yōu)選使用前用20%乙醇浸泡處理，然后用雙蒸水將乙醇清洗干凈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法中還包括HIV-1蛋白酶的表達(dá)步驟，具體為:將包含HIV-1蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒的重組菌，先使用SOC培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600為0.5， 加入0.1mM的IPTG(異丙基-β -D硫代半乳糖苷)進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中過(guò)夜培養(yǎng)時(shí)間為12小時(shí)，37°C培養(yǎng)時(shí)間為4小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為6小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中培養(yǎng)溫度均為37°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法中還包括包涵體的透析復(fù)性步驟，具體為:用溶液C稀釋至蛋白濃度0.1-0.5mg/mL，然后加到透析袋中，放入4°C預(yù)冷的透析緩沖液A (雙蒸水，10 %甘油，0.2 % beta-巰基乙醇)中，透析4_5小時(shí)，然后將透析袋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到4°C預(yù)冷的透析緩沖液B(20MmNaAc-HAc，pH5.2,0.2% beta-巰基乙醇)中，透析4_5小時(shí)后取出透析袋中溶液，離心收集上清。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述透析復(fù)性后的上清經(jīng)蛋白濃縮、分裝，液氮快速冷凍后放在_80°C冰箱保存。
11.一種利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)測(cè)定HIV-1蛋白酶動(dòng)力學(xué)的方法，該方法中使用人工多妝底物 MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1Ie-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp,所述HIV-1蛋白酶是經(jīng)權(quán)利要求1-10所述方法分離純化的HIV-1蛋白酶。
12.一種利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)測(cè)定針對(duì)HIV-1蛋白酶的抑制劑的活性的方法，該方法中使用人工多妝底物 MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1 Ie-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp,以及經(jīng)權(quán)利要求1-10所述方法分離純化的HIV-1蛋白酶。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103525794SQ201210234106
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月6日
【發(fā)明者】饒子和, 楊誠(chéng), 郭宇, 周紅剛, 唐延婷, 丁宏蘭, 王文明, 張壇杰, 陳衛(wèi)強(qiáng), 劉慧娟, 李爽 申請(qǐng)人:天津市國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院