純化核酸、特別是來(lái)自固定組織的核酸的方法
【專利說(shuō)明】純化核酸、特別是來(lái)自固定組織的核酸的方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00980149742. 8的中國(guó)專利申請(qǐng)（國(guó)際申請(qǐng)日：2009年11月 20日，國(guó)際【申請(qǐng)?zhí)枴縋CT/EP2009/065534,發(fā)明名稱：純化核酸、特別是來(lái)自固定組織的核酸 的方法）的分案申請(qǐng)。
[0002] 本發(fā)明涉及純化核酸的方法、實(shí)施本發(fā)明方法的系統(tǒng)以及用于純化生物試樣的試 樣容器夾持器。
[0003] 近來(lái)，分子診斷學(xué)的重要性日益增加。分子診斷學(xué)已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于臨床診斷疾病 (其中包括檢測(cè)感染病原體，檢測(cè)基因變異，發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞和鑒別疾病遺傳因素的風(fēng)險(xiǎn) 因子等）。但是，分子診斷學(xué)的方法同時(shí)也應(yīng)用于獸用藥、環(huán)境分析和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)測(cè)試中。另 一應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)樵诓±韺W(xué)/細(xì)胞學(xué)研究所的研究或者在法醫(yī)詢查范圍內(nèi)的研究。同時(shí)在保健 領(lǐng)域（例如研究庫(kù)存血的感染病原體-自由度（Infektionserreger-Freiheit))也使用基 因診斷學(xué)，立法者計(jì)劃在將來(lái)用法律規(guī)范這些測(cè)試。在臨床分子診斷學(xué)中應(yīng)用的方法（如 雜交或擴(kuò)增技術(shù)如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增），LCR(連接酶鏈反應(yīng)）、 bDNA(分支DNA)或NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增）-技術(shù)）在基礎(chǔ)科學(xué)研究工作中也屬于常 規(guī)方法。
[0004] 特別地，核酸分析通過(guò)確定組織中的基因表達(dá)在腫瘤疾病的研究和診斷中開(kāi)啟了 充滿前景的新的可能性。因此，例如，所謂微陣列系統(tǒng)已經(jīng)開(kāi)啟了在單個(gè)反應(yīng)裝置中確定 上百或甚至上千個(gè)基因表達(dá)的可能性。將試樣材料、純化的核酸（如RNA或CDNA)施用至 芯片，該芯片包括相應(yīng)的捕捉寡聚核苷酸，從而該試樣中的核酸可以通過(guò)雜交而被檢測(cè)。此 外，其他在試樣中檢測(cè)核酸的方法，例如擴(kuò)增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，也是普遍使用 的。
[0005] 核酸分析中的基本問(wèn)題是試樣制備。待研究的試樣通常包括含干擾性、部分不可 溶的成分（所謂的碎片（Debris))的細(xì)胞或組織，這些成分會(huì)干擾后續(xù)的分離和分析。這 些不可溶的成分特別出現(xiàn)在從糞便/排泄物、血液、疣、鈣化組織（骨）或其他嚴(yán)重壞死組 織中分離核酸時(shí)。然而，碎片在其最廣泛意義上也包括可溶性成分，例如從紅細(xì)胞釋放的血 紅蛋白，其嚴(yán)重過(guò)量的存在，并且會(huì)在分離核酸期間除去。
[0006] 特別是在腫瘤診斷學(xué)中這些問(wèn)題加劇嚴(yán)重，因?yàn)榇藭r(shí)常常使用甲醛固定的、石蠟 包埋的切片（formalin-fixedparaffin-embedded,FFPE-Schnitte)作為試樣材料。當(dāng)如 在活組織檢查期間從患者取試樣時(shí)，或者在外科手術(shù)中取腫瘤物質(zhì)的試樣時(shí)，組織材料用 甲醛固定，并包埋入石蠟中，從而可以保存該試樣材料。在培育期間，同樣之后在組織塊 (Gewebeblock)中的多年，固定接（Fixantien)造成生物分子的嚴(yán)重交聯(lián)（核酸與蛋白質(zhì)， 蛋白質(zhì)彼此之間，或核酸彼此之間）。這些交聯(lián)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部和外部細(xì)胞有助于生成不溶性碎 片，或不可裂解或難以裂解的碎片。通常從這些包埋在石蠟中的試樣制備切片供病理學(xué)家 評(píng)估；然而，這些切片同樣能夠用作核酸分析中的起始材料。在這種情況中，細(xì)胞碎片和石 蠟必須在裂解后的核酸純化期間被除去。
[0007] 此外，涉及干擾性的、部分不溶性成分（碎片）的問(wèn)題也會(huì)在純化來(lái)自糞便試樣 (排泄物、糞便（Kot))期間發(fā)生。糞便試樣不僅包括食物的難消化成分（粗糧），還包括未 消化的剩余物，如脂肪、淀粉、結(jié)締組織纖維和肌肉纖維和水，它們?cè)诖竽c的上部不被吸收。 存在的內(nèi)源物質(zhì)包括：脫落的腸細(xì)胞、消化酶的剩余物和粘液。此外，少量的膽汁本身、以及 也會(huì)從膽囊排出以保護(hù)腸粘膜的少量的卵磷脂以及少量的其他磷脂會(huì)隨動(dòng)物糞便一起排 出。
[0008] 為了降低成本并保持從試樣制備到測(cè)定分析結(jié)果的時(shí)間盡可能短，重要的目的是 使純化核酸的方法盡可能有效，并且盡可能通過(guò)自動(dòng)化手段實(shí)施該方法。這特別適用于診 斷學(xué)。高度適于自動(dòng)化的方法是那些能夠在盡可能少的不同反應(yīng)容器中進(jìn)行的并可以以標(biāo) 準(zhǔn)化形式（例如，96孔板形式）進(jìn)行的方法，因?yàn)榭梢栽谠摲椒ㄖ惺褂酶咝У囊埔鹤詣?dòng)裝 置。因此，在現(xiàn)有技術(shù)中存在對(duì)簡(jiǎn)單、高效和高度自動(dòng)化的試樣制備方法的需求。
[0009] 常見(jiàn)的核酸純化方法包括在離液序列高的條件下裂解試樣、提取純化、沉降和從 液相例如苯酸 _氯仿提取液純化（參見(jiàn)Sambrook等人，Molecularcloning-alaboratory manual,第三版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress, 2001,IS BN-13:978-0879695774)，或基于柱的純化方法，如在W0 2003040364-A1中記載的。
[0010] 常見(jiàn)的分離核酸的方法已經(jīng)披露于Chomczynski(US5, 346, 994)中，并且包括基 于使用苯酚和離液序列高的化合物異硫氰酸胍從液相分離而從組織材料純化核酸的方法。 該試樣必須在水溶液中被勻漿化，在加入異硫氰酸胍（GTC)和苯酚/氯仿后進(jìn)行離心。蛋白 質(zhì)存在于有機(jī)相中，DNA存在于相間，RNA存在于水相中。RNA可以從水相中沉淀出來(lái)。然 而，該方法不能可靠地從FFPE組織試樣純化RNA。
[0011] 其他已知的DNA或RNA分離方法通常使用離液序列高的鹽或苯酚提取液。
[0012] EP0819696公開(kāi)了一種純化核酸的方法，其基于在離液序列高的條件下將核酸結(jié) 合至氧化硅（Silika)或其他二氧化硅衍生物。該試樣在離液序列高的裂解緩沖液中發(fā)生 裂解，并且核酸結(jié)合至二氧化娃基質(zhì)（Silikamatrix)。
[0013] 現(xiàn)有技術(shù)中已知的由石錯(cuò)切片（Paraffinschnitten)純化核酸的方法首先需要 繁瑣的去石蠟化，其中，石蠟通常通過(guò)二甲苯除去，并且接著繁瑣的用二甲苯/乙醇稀釋序 列進(jìn)行再水化作用（Rehydratisierung)。
[0014] 例如，W0 200146402A1記載了一種從固定的石蠟切片純化RNA的方法，其中首先 將石蠟切片置于Eppendorf反應(yīng)容器中，并用二甲苯去石蠟。接著切片必須用二甲苯/乙 醇稀釋系列（VerdUnnungsreihe)進(jìn)行再水化作用。接著，將試樣在離液序列高的溶液中長(zhǎng) 時(shí)間（5至120分鐘）加熱以純化RNA。盡管該方法實(shí)現(xiàn)了有效的去石蠟化，但是其為繁瑣 的，并且由于需要多次離心步驟，不是非常適用于自動(dòng)化。
[0015] 此外，EP1510577還披露了一種方法，其中在離液序列高的條件下核酸結(jié)合至磁性 顆粒，并且能夠通過(guò)施加磁場(chǎng)從試樣上清液中分離。W0 1990 014 891A1披露了一種磁性試 樣夾持器，其可以用于該目的。然而，在該方法中，不存在在非離液序列高的條件下預(yù)先純 化試樣中的細(xì)胞碎片或去石蠟化。但是，在純化核酸時(shí)，碎片在試樣中的存在具有不利的作 用，在自動(dòng)化方法中是特別不利的，因?yàn)樗槠瑫?huì)堵塞移液管尖、抽吸管等，并且還會(huì)損壞用 于監(jiān)控移液步驟的壓力傳感器。
[0016] 因此，考慮到現(xiàn)有技術(shù)，存在對(duì)改進(jìn)的純化核酸方法的需要，特別是對(duì)適于自動(dòng)化 的方法的需要。
[0017] 定義
[0018] 術(shù)語(yǔ)"生物試樣"是指包含細(xì)胞或細(xì)胞材料的任何試樣，特別是細(xì)胞，凍干 細(xì)胞，固定細(xì)胞，排泄物/奠便，暗黃覆蓋層（buffycoat，血液的白細(xì)胞部分），腹 7K，棉簽（Abstriche)，特別是頰棉簽或咽喉棉簽，但是更優(yōu)選是頸棉簽，痰，器官斑點(diǎn) (Organpunktate)，精子，組織試樣，固定組織試樣，固定或未固定組織試樣的組織切片，特 別是凍干切片和石蠟切片，特別是甲醛固定的石蠟切片，腫瘤材料、活組織檢查試樣、血液 試樣，特別是全血或血液部分，細(xì)胞懸液，以及就最廣義而言所有包含細(xì)胞成分的試樣，其 中所謂細(xì)胞成分應(yīng)當(dāng)指完整細(xì)胞和細(xì)胞成分。
[0019] 此外，術(shù)語(yǔ)"生物試樣"還包括其他含核酸的生物材料，例如血清或血漿，特別是含 病毒的血清或血漿，特別優(yōu)選HIV-和HCV-感染的血清試樣，分泌物，CSF(Liquor)，膽汁，淋 巴液，尿液。類似地，其可以為源自生物化學(xué)或生物技術(shù)方法并且要經(jīng)過(guò)后續(xù)純化的含核酸 生物材料。
[0020] 術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞（的）"是指原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"裂解試樣"包括使試樣中的細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂。其特別包括機(jī)械裂解方法 (如超聲）、熱裂解（如凍融循環(huán)，加熱試樣）和化學(xué)裂解（如使用洗滌劑（Detergentien))。 然而，術(shù)語(yǔ)"裂解試樣"并不局限于細(xì)胞，并且可以表示通過(guò)使用記載的方法從非細(xì)胞生物 結(jié)構(gòu)或復(fù)合物中釋放核酸。
[0022] 術(shù)語(yǔ)"核酸"包括鏈長(zhǎng)大于10個(gè)單體單元的寡聚或多聚核糖核苷酸或2' -脫氧核 糖核苷酸。核酸中的單體單元在鄰接單體單元的3'和5'羥基之間經(jīng)由磷酸二酯鍵連接， 并且雜環(huán)堿（heterocyclischeBase)以糖苷鍵連接至各個(gè)糖類成分的Γ原子。核酸可以 通過(guò)形成分子間氫鍵而形成雙鏈和三鏈。這也表示包括蛋白質(zhì)/核酸復(fù)合物，以及核酸與 合成核苷酸，如嗎啉類（Morpholinos)、LNAs或PNAs。
[0023] 術(shù)語(yǔ)"離液序列高的條件"是指在離液序列高的試劑或化合物存在下的溶劑條 件。離液序列高的試劑或化合物為改變或干擾蛋白質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的二級(jí) 結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的化合物，同時(shí)保持一級(jí)結(jié)構(gòu)是完整的。在溶液中，在離液序 列高的條件下，生物分子，特別是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物和核酸的分子內(nèi)相互作用 被干擾，這是因?yàn)殡x液序列高的化合物干涉了生物分子內(nèi)的穩(wěn)定化分子內(nèi)相互作用，例如 氫鍵、范德華力和疏水性作用。離液序列高的化合物通常具有大體積離子，其由于它們的 尺寸會(huì)干涉分子內(nèi)相互作用并且因此減少溶劑的極性。由此干擾了分子間氫鍵和分子內(nèi) 氫鍵。因此，盡管許多蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但是仍保持雙鏈核酸片段的螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)將離 液序列高的化合物加入細(xì)胞裂解物或細(xì)胞懸液中，蛋白質(zhì)可以被沉淀，同時(shí)核酸保持在 溶液中。在離液序列高的條件下，核酸與基于二氧化硅的基質(zhì)的結(jié)合得到很大程度的支 持。離液序列高的化合物包括，例如，高分子量的脲溶液（例如6至8mol/l脲），胍鹽溶液 (Guanidinium-sa!z丨dsungen)(例如，6mol/l氯化胍），高分子量鋰鹽（例如4. 5mol/l高 氯酸鋰）。離液序列高的陰離子包括以下陰離子：F、P043、S042、CH3C00、C1，特別是Br、I、N03、C104、SCN和Cl3CC00。尚液序列尚的陽(yáng)尚子包括以下陽(yáng)尚子：Li+