專利名稱：觀察工具及使用該工具的觀察方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及物體的觀察技術(shù)，特別是涉及細(xì)胞等透明的微小物體 的觀察技術(shù).
背景技術(shù)：
以前，觀察細(xì)胞等微小物體時(shí)，使用透射觀察顯微鏡.而且，為 了以高對(duì)比度觀察無(wú)染色的活細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形態(tài)，需要使用相位 差顯微鏡、無(wú)輸出相位差顯微鏡、微分干涉顯微鏡、偏振光顯微鏡等， 這些顯微鏡具備有相位差環(huán)的特殊聚光器或微分干涉棱鏡等，并具有 特殊透鏡.
具體的，作為顯微鏡觀察培養(yǎng)液中的細(xì)胞等透明的微小物體的方 法，廣泛采用以相位差法、偏斜照明法、微分干涉法等為代表的特殊
觀察法(參閱特開(kāi)平7 - 225341號(hào)公報(bào)等).特殊觀察法的光學(xué)系統(tǒng)的 結(jié)構(gòu)如圖16所示， 一般的透射清晰視場(chǎng)觀察的結(jié)構(gòu)由以下構(gòu)成光源 713，用于產(chǎn)生照明光；瞄準(zhǔn)透鏡741，用于使由光源713發(fā)出的照明 光的方向一致；反射鏡742，用于使前進(jìn)方向一致的照明光的前進(jìn)方向 偏向垂直方向；窗口透鏡743，用于集聚照明光線；聚光鏡頭744，用 于對(duì)含有觀察物體的樣本708照射已聚集的照明光；物鏡706，用于擴(kuò) 大投影樣本708;成像透鏡746，用于將樣本708的像成像于成像面745 上；栽物臺(tái)717，用于調(diào)整樣本708的觀察位置.對(duì)于該結(jié)構(gòu)，在聚光 透鏡744的入射孔位置添加照明調(diào)制元件747，在物鏡706的射出孔位 置添加成像調(diào)制元件748.在照明調(diào)制元件747上使用環(huán)形隙縫、在成 像調(diào)制元件748上使用相位板的是相位差法，在照明調(diào)制元件上使用 偏心孔徑的是偏斜照射法，在照明調(diào)制元件747和成像照明元件748 上使用偏光板和微分干涉棱鏡的是微分干涉法.通過(guò)使用特殊觀察法， 如果和周?chē)拿劫|(zhì)的折射率不同，即使是透明物體也能以明暗的對(duì)比 度進(jìn)行觀察，這樣特殊的觀察方法，對(duì)本來(lái)透明的、以原來(lái)狀態(tài)難以 看見(jiàn)的生物體組織以良好的對(duì)比度進(jìn)行觀察中特別有效。
但是，在這些特殊的觀察方法中，必須在上述的聚光透鏡744或者物鏡706的孔位置配置特殊的調(diào)制元件.這些特殊的調(diào)制元件價(jià)格 非常高，并且產(chǎn)生例如物鏡706的倍率改變時(shí)該調(diào)制元件也需要改變 的問(wèn)題等，在使用上有很多不便.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于上述情況進(jìn)行的，本發(fā)明的目的在于提供一種技術(shù)， 不使用觀察透明微小物體時(shí)的特殊觀察法需要的特殊調(diào)制元件，并且 能夠簡(jiǎn)單地進(jìn)行觀察.
本發(fā)明的觀察工具是具備有反射面的觀察目標(biāo)收存部的觀察工 具.另外，該觀察工具是通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由落射照明光照明、 對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的觀察方法中使用的觀察目標(biāo)收存用的觀察工 具，設(shè)置了觀察時(shí)反射上述落射照明光的反射面.
上述反射面可以設(shè)置在觀察時(shí)與上述物鏡對(duì)置的面，也可以設(shè)置 在與上述物鏡對(duì)置的面的相反面.
另外，也可以形成上述觀察目標(biāo)經(jīng)過(guò)的流徑，另外，收存上述觀 察目標(biāo)的收存部也可以具備注入含有觀察目標(biāo)的口和使其流出的口 .
另外，本發(fā)明的觀察方法的特征在于它是通過(guò)具有物鏡的光學(xué) 系統(tǒng)由落射照明光照明對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的方法，在收存上迷觀察 目標(biāo)的觀察工具中設(shè)置觀察時(shí)反射上述落射照明光的反射面，在上述 觀察工具中收存觀察目標(biāo)，并對(duì)上述觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察.
上述反射面可以設(shè)置在觀察時(shí)與上述物鏡對(duì)置的面上，也可以設(shè) 置在與上述物鏡對(duì)置的面的相反面上.
另外，上述觀察目標(biāo)也可以是微小透明體，
另外，上述觀察工具具有能夠保持液體的容器，上述容器也可以 同時(shí)收存含有觀察對(duì)象的液體.在此，上述觀察目標(biāo)也可以是細(xì)胞， 上述液體也可以是培養(yǎng)液.
另外，也可以在上述觀察工具中收存上述觀察目標(biāo)，以使上述觀 察目標(biāo)和上述反射面的距離為上述光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)深度的一半以下.
具體的，也可以在上述觀察工具中收存上述觀察目標(biāo)，以使上述 觀察目標(biāo)和上述反射面的距離d滿足以下公式(l),dSW/ (2NA2) …(1)
(式中d表示觀察目標(biāo)和反射面的距離，W表示所用光的波長(zhǎng)， NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑.)
進(jìn)而，也可以在上述的觀察工具中收納上述觀察目標(biāo)，以使與上 述觀察目標(biāo)相對(duì)的照明光的數(shù)值孔徑比物鏡的數(shù)值孔徑小.
具體的，也可以在上述觀察工具中收納上述觀察目標(biāo)，以使上述 觀察目標(biāo)和上述反射面之間的距離d滿足以下公式(2).
d>F/ (4 t a n (si n"NA)) …(2)
(式中d表示觀察目標(biāo)和反射面之間的距離，F(xiàn)表示光學(xué)系統(tǒng)的視
場(chǎng)直徑，NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑.)
若按照本發(fā)明，不用特殊的光學(xué)單元就能夠以良好的對(duì)比度觀察
細(xì)胞等透明的微小物體，
即，使用本發(fā)明的細(xì)胞觀察工具，利用普通的光學(xué)顯微鏡或者使 用普通的透鏡和CCD攝像機(jī)的監(jiān)控器，能夠?qū)?xì)胞、例如嗜中性白血 球、嗜酸性白血球、嗜堿性白血球、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴球等 血液細(xì)胞或其它的動(dòng)物細(xì)胞，或者植物的原生質(zhì)體等甚至含有的顆粒 成分的清晰的像，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，不需要使用現(xiàn)有技術(shù)的如相 位差顯微鏡的特殊的裝置.


圖1(A) - (C)是涉及笫一實(shí)施方式的觀察工具的剖面圖， 圖2(A) (B)是具有包含反射面的結(jié)構(gòu)體40的觀察工具的剖面圖。 圖3(A1) ~ (C)是具有覆蓋收存部的蓋的觀察工具的剖面圖. 圖4是涉及第一實(shí)施方式的觀察工具的其它使用的例，(A)是在 復(fù)蓋玻璃上承栽結(jié)構(gòu)體1時(shí)的剖面圖.(B)是顯示設(shè)置能讓液體通過(guò) 的孔時(shí)的概略圖的剖面圖.(C)是(B)的觀察工具的斜視圖. 圖5是在收存部刻上刻度的觀察工具的一例的上視圖. 圖6(A)是整體作成管型的觀察工具的剖面圖.(B)是(A)的虛 線AB方向的剖面圖，困7是顯示笫二實(shí)施方式的觀察裝置的結(jié)構(gòu)的圖形，
困8是顯示本發(fā)明的觀察法的光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)的圖形.
圖9是顯示培養(yǎng)皿和培養(yǎng)細(xì)胞的圖形.
圖IO是顯示本發(fā)明的物體的對(duì)比度獲取方法的困形.
圖ll(a)是顯示在第二實(shí)施方式中的成像模擬的計(jì)算模型的圖形. 圖11 (b)及(c)是表示成像模擬的計(jì)算結(jié)果的圖形，
圖12(a)是表示笫二實(shí)施方式中的成像模擬計(jì)算模型的困形.圖 12(b) - (f)是顯示細(xì)胞302和反射鏡涂層307的距離為1. Oym、 1.2pm、 1. 4ym、 1. 6 i m以及1. 8 pm時(shí)成像模擬的計(jì)算結(jié)果的困形.
圖13是顯示反射面引起的照明光的數(shù)值孔徑的降低的困形.
圖14(a)是顯示用于照明光的數(shù)值孔徑比物鏡的數(shù)值孔徑小時(shí)的 物體像的模擬例的計(jì)算模型的圖形.圖14 (b) ~ (f)時(shí)顯示照明光 的數(shù)值孔徑為物鏡鏡頭的數(shù)值孔徑的100%、 80%、 60%、 40%以及 20%時(shí)的成像模擬的計(jì)算結(jié)果的圖形.
圖15是表示笫三實(shí)施方式的微小流徑觀察裝置的結(jié)構(gòu)的圖形.
閨16是顯示現(xiàn)有的特殊觀察法的光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)的圖形.
圖17是顯示現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡的物體的對(duì)比度的獲取方法的 圖形.
圖18是使用圖3 (A2)所示的觀察工具觀察嗜酸性白血球時(shí)所照 的照片.
具體實(shí)施例方式
下面，參照附困說(shuō)明本發(fā)明的一實(shí)施方式.首先，說(shuō)明涉及應(yīng)用 本發(fā)明的第一實(shí)施方式的觀察工具.
本發(fā)明的觀察工具是用于使用顯微鏡以反射光觀察乃至檢測(cè)細(xì)胞 等的工具，具有收存細(xì)胞等的部分，即觀察目標(biāo)收存部.并且，至少 具有反射該觀察工具進(jìn)行觀察的波長(zhǎng)區(qū)域的光的面，即形成反射面的 面。
圖1 ~圖6中顯示涉及本發(fā)明的觀察工具結(jié)構(gòu)的一例.并且，在圖 中，箭頭X表示通過(guò)物鏡由X方向?qū)τ^察目標(biāo)進(jìn)行觀察.
圖1 (A)所示的觀察工具中，1是由玻璃、合成樹(shù)脂、金屬、硅 等構(gòu)成的結(jié)構(gòu)體，2是收存細(xì)胞等的觀察目標(biāo)的槽.在收存部2的底面3設(shè)置反射觀察的波長(zhǎng)區(qū)域的光的反射鏡.作為構(gòu)成反射面的反射鏡，
或者粘結(jié)金屬箔而形成反射鏡面.另外，例i有金屬、硅晶片等的、 其自身可以加工成鏡面的物質(zhì)來(lái)構(gòu)成結(jié)構(gòu)體1、在設(shè)置槽的加工時(shí)，底 面就直接形成反射鏡、設(shè)置槽后，對(duì)槽的底面進(jìn)行反射鏡加工等.在 此，如果至少底面3是反射鏡就可以，結(jié)構(gòu)體的表面全部都是反射鏡 也可以.
以硅晶片構(gòu)成圖1 (A)的結(jié)構(gòu)體1時(shí)，例如通過(guò)機(jī)械研磨、化學(xué) 飪刻等常用方法加工硅晶片，可以通過(guò)形成收存細(xì)胞的槽進(jìn)行制作. 例如，圖1 (A)的情況，反射鏡3通過(guò)使硅晶片的底面呈鏡面狀態(tài)而 形成，進(jìn)而，通過(guò)上述槽的形成工序不能充分呈現(xiàn)鏡面狀態(tài)時(shí)，根據(jù) 需要，也可以進(jìn)一步進(jìn)行使槽的底面形成鏡面的加工.
尺寸的大小為在普通的顯微鏡上能使用的尺寸就可以.例如為詳 細(xì)觀察細(xì)胞的潁粒結(jié)構(gòu)，收存部的深度，最好是細(xì)胞大致排列一層的 深度.例如，收存部深度為l~100Mm、圃形的情況下直徑為l~5mm 就足夠，但是并不限于此，可以按照需要選擇適宜的尺寸.
另外，作為結(jié)構(gòu)體1的材質(zhì)，其自身通過(guò)可能的鏡面(反射面) 加工、電鍍等也可以形成反射面.可以使用例如，玻璃、石英等無(wú) 機(jī)化合物；聚苯乙烯、合成樹(shù)脂、聚丙烯、聚乙烯、氯乙烯、聚苯基 醚、聚苯撐硫等塑膠；不銹鋼、鋁、青銅等金屬或合金；陶瓷等非金 屬無(wú)機(jī)材料.
圖1 (B)所示的觀察工具以例如玻璃、塑膠等構(gòu)成結(jié)構(gòu)體1、設(shè) 置收存部2.進(jìn)而，在收存部2的底部4形成表面平滑并且高反射率的 材料的反射層，例如，粘結(jié)硅晶片的箔或膜、鍍銀等，
圖1 (C)所示的觀察工具的特征在于在與物鏡對(duì)置的面的相反 面41上設(shè)置反射面.結(jié)構(gòu)體l由透過(guò)觀察的波長(zhǎng)區(qū)域的光的材質(zhì)構(gòu)成， 例如，由玻璃、石英等無(wú)機(jī)化合物、聚苯乙烯、合成樹(shù)脂、聚丙烯、 聚乙烯、氯乙烯、聚苯基瞇、聚苯撐疏等塑膠等構(gòu)成.按照該觀察工 具，即使在清洗收存部時(shí)等也不能損傷到反射面，反射面的維護(hù)容易.
結(jié)合結(jié)構(gòu)體l的材質(zhì)，通過(guò)進(jìn)行電鍍加工可以形成反射面41.電
鍍例如是可使表面平滑并且反射率高的材料、如銀等金屬的電鍍.
圖2 ( A )所示的觀察工具在透過(guò)光的結(jié)構(gòu)體1和結(jié)構(gòu)體40之間設(shè)置反射面，該觀察工具通過(guò)在結(jié)構(gòu)體1的收存部2的相反面粘上形成 反射面的結(jié)構(gòu)體40來(lái)制作.該觀察工具制作容易，因?yàn)槭欠謩e對(duì)結(jié)構(gòu) 體1和結(jié)構(gòu)體40進(jìn)行加工、最后使其結(jié)合制作的.結(jié)構(gòu)體l和結(jié)構(gòu)體 40也可以用例如香脂、光硬化型合成樹(shù)脂粘結(jié)刑等的光學(xué)粘結(jié)刑粘結(jié)， 另外，不使用粘結(jié)劑等，觀察時(shí)也可以將結(jié)構(gòu)體1和結(jié)構(gòu)體40重疊起 來(lái)使用.重疊起來(lái)使用時(shí)，將結(jié)構(gòu)體1和結(jié)構(gòu)體40重疊起來(lái)、用夾子 等固定工具扶持固定來(lái)使用.
圖2 (B)所示的觀察工具與圖2(A)所示的觀察工具類似，但在 以下點(diǎn)上不同透過(guò)光的結(jié)構(gòu)體40的、與物鏡對(duì)置的面的相反面43 上設(shè)置反射面.結(jié)構(gòu)體1由透過(guò)光的材質(zhì)構(gòu)成.根據(jù)該觀察工具，通 過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)體40的厚度，能夠容易地對(duì)觀察目標(biāo)的位置與反射面的距 離進(jìn)行調(diào)節(jié).
為將本實(shí)施方式的觀察工具用于細(xì)胞的觀察，將培養(yǎng)液與細(xì)胞一 同放入收存部，如圖3 (Al)所示，以復(fù)蓋玻璃(困3的5)覆蓋，在 物鏡中使用導(dǎo)入可見(jiàn)光的照明裝置，以普通的顯微鏡觀察乃至檢測(cè)， 或者使用與物鏡結(jié)合的CCD攝像機(jī)進(jìn)行監(jiān)測(cè).作為導(dǎo)入光的照明裝置， 可以使用例如作為一般照明裝置的市場(chǎng)上出售的日本光學(xué)制造"尼康 EPI-U"等，
另外，圖3(Al)中示出在結(jié)構(gòu)體l的上部設(shè)置覆蓋玻璃5的情況， 但是，如圖3(A2)所示，也可以使用使整體上下順序相反、由下方進(jìn) 行觀察的的使用方法。
另外，也可以是如圖3 (B) (C)的觀察工具.圖3 (B)的觀察工 具如以下構(gòu)成將觀察目標(biāo)放入收存部2的槽中后，以結(jié)構(gòu)體40復(fù)蓋 收存部2，結(jié)構(gòu)體40在與物鏡對(duì)置的面44上具有反射面，
另外，圖3(C)的細(xì)胞觀察工具在透過(guò)光的結(jié)構(gòu)體40的、與物鏡 對(duì)置的面的相反面45上設(shè)置反射面，按照該觀察工具，通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu) 體40的厚度，能夠容易地改變觀察目標(biāo)的位置與反射面的距離.
另外，本實(shí)施方式的觀察工具，如困4 (A)所示，可以設(shè)置注入 觀察目標(biāo)的注入口 6、在覆蓋玻璃5上承栽結(jié)構(gòu)體1來(lái)使用.此時(shí)由下 方進(jìn)行觀察.例如，能夠由注入口 6同時(shí)注入細(xì)胞和培養(yǎng)液，觀察操 作簡(jiǎn)便.
另外，使用本實(shí)施方式的觀察工具進(jìn)行觀察時(shí)，觀察目標(biāo)、例如細(xì)胞，不需要與玻璃面粘結(jié)，也能夠觀察浮游狀態(tài)、例如在液體中處
于流動(dòng)狀態(tài)的細(xì)胞.即，如圖4 (B)(C)所示，為使液體能夠通過(guò)到 結(jié)構(gòu)體1，設(shè)置孔7、 8，由一個(gè)孔流入含有細(xì)胞的液體，也能夠觀察 流動(dòng)中的細(xì)胞的狀態(tài).為此目的，如困6所示，也可以在具有細(xì)胞收 存部9的透明的管12的內(nèi)壁11上形成反射面.
上述說(shuō)明的觀察工具根據(jù)需要，如圖5所示，在收存部上刻上刻 度，能夠進(jìn)行細(xì)胞等的計(jì)算.即使此種情況，根據(jù)本實(shí)施方式的觀察 工具能夠以好的對(duì)比度觀察微小透明物體，所以計(jì)算容易，
使用本實(shí)施方式的細(xì)胞觀察工具時(shí)，使用普通的光學(xué)顯微鏡通過(guò) 肉眼進(jìn)行觀察時(shí)、或者通過(guò)使用普通的透鏡和CCD攝像機(jī)的監(jiān)控器進(jìn) 行觀察時(shí)，能夠?qū)?xì)胞、例如嗜中性白血球、嗜酸性白血球、嗜堿性 白血球、單核細(xì)胞、巨謹(jǐn)細(xì)胞、淋巴球等血液細(xì)胞或其它的動(dòng)物細(xì)胞， 或者植物的原生質(zhì)體等甚至含有的顆粒成分的清晰的像，從而對(duì)細(xì)胞 進(jìn)行觀察，不需要使用現(xiàn)有技術(shù)的如相位差顯微鏡的特殊的裝置.
其次，作為應(yīng)用本發(fā)明的第二實(shí)施方式，對(duì)使用了上述中說(shuō)明的 細(xì)胞觀察工具的觀察方法進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明.
本發(fā)明的觀察方法的特征在于能夠以良好的對(duì)比度對(duì)細(xì)胞等微 小透明物體進(jìn)行觀察.在此，說(shuō)明涉及本發(fā)明的觀察方法前，簡(jiǎn)單地 說(shuō)明關(guān)于通過(guò)本發(fā)明的觀察方法能夠以良好的對(duì)比度觀察微小透明物 體的原理.
在現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡中觀察目標(biāo)像的對(duì)比度的獲取方法如圖 17所示.即，照明光入射波陣面103透過(guò)媒質(zhì)101中的觀察目標(biāo)102 時(shí)，由于媒質(zhì)101和物體102的折射率不同，射出觀察目標(biāo)的射出波 陣面104遭受變形.射出波陣面的微小要素105沿垂直于各自波陣面 的方向前進(jìn).因此，遭受變形的射出波陣面的微小要素105沿與入射 波陣面104前進(jìn)方向不同的方向前進(jìn).物鏡106以由數(shù)值孔徑表示的 某一定角度范圍的波陣面形成物體的像.通過(guò)觀察目標(biāo)102的周邊部 分等遭受很強(qiáng)變形的射出波陣面的微小要素105的一部分脫離以物鏡 106的數(shù)值孔徑表示的角度范圍前進(jìn)時(shí)，在像的一部分中產(chǎn)生陰影，觀 察目標(biāo)102隨對(duì)比度而成像，但是，例如培養(yǎng)液中的細(xì)胞等，物體102 和媒質(zhì)101的折射率幾乎沒(méi)有差時(shí)，遭受變形的射出波陣面的微小要 素105也在以物鏡106的數(shù)值孔徑表示的角度范圍內(nèi)前進(jìn)，所以物體像中幾乎沒(méi)有明暗的對(duì)比度.因此，以普通的透射觀察顯微鏡難以觀 察培養(yǎng)液中細(xì)胞的像。
與此相對(duì)，本發(fā)明的觀察方法中，觀察目標(biāo)的像的對(duì)比度的獲取
方法如圖10所示。即，通過(guò)以落射照明觀察貼近反射面207的物體202， 入射波陣面203透過(guò)觀察目標(biāo)202 —次后由反射面207反射，進(jìn)而再 一次透過(guò)觀察目標(biāo)202,通過(guò)入射波陣面203兩次透過(guò)觀察目標(biāo)202而 形成的入射波陣面204遭受到現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡情況下的兩倍的 變形.在現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡中，射出波陣面的微小要素205的一 部分在以物鏡206的數(shù)值孔徑表示的角度范閨內(nèi)前進(jìn)，但是如果按照 本發(fā)明的觀察方法，可以脫離該范圍前進(jìn)，所以在觀察目標(biāo)的像上形 成陰影.因此，與現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡相比容易得到像中明暗的對(duì) 比度，并且，即使是以普通的透射觀察顯微鏡難以觀察的培養(yǎng)液中的 細(xì)胞，也可能以良好的對(duì)比度清晰地進(jìn)行觀察.
以下，參照附圖對(duì)本發(fā)明的第二實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明.
圖7是應(yīng)用本發(fā)明的一實(shí)施方式的觀察裝置的概略圖.如困所示， 本實(shí)施方式的觀察裝置具有落射觀察顯微鏡311和在底面使用了反射 鏡涂層307的培養(yǎng)皿312.
落射觀察顯微鏡311由以下構(gòu)成鏡筒315、栽物臺(tái)317、光源部 313、落射照明管314和物鏡306，以及一起支撐這些的鏡基座316. 載物臺(tái)317能夠在其上面設(shè)置培養(yǎng)亞312.栽物臺(tái)317與鏡基座316相 連接，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)對(duì)焦柄318可以在上下方向上移動(dòng).
圖8中，示出落射觀察顯微鏡311的光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu).如圖8所 示，光學(xué)系統(tǒng)由以下構(gòu)成光源813，用于產(chǎn)生照明光；校準(zhǔn)透鏡841, 用于使由光源813發(fā)出的照明光的前進(jìn)方向一致；半透鏡842,用于使 前進(jìn)方向一致了的照明光的前進(jìn)方向偏向垂直方向；物鏡806，用于將 照明光聚集在含有觀察物體的標(biāo)本808上，同時(shí)擴(kuò)大投影標(biāo)本808;成 像透鏡846，用于使標(biāo)本808,的像成在在成像板上；反射鏡849，具有 反射面807，該反射面反射透過(guò)標(biāo)本808—次的照明光使其返回.
成像透鏡846放置在鏡筒315中。光源813放置在光源部313中， 校準(zhǔn)透鏡841及半透鏡842放置在落射照明管314中.
使用如以上構(gòu)成的觀察裝置觀察目標(biāo)時(shí)，如以下所示.
如圖9所示，將培養(yǎng)液301與觀察目標(biāo)(例如細(xì)胞302 )同時(shí)放入觀察工具的收存部.將培養(yǎng)皿設(shè)置于栽物臺(tái)317上面.適當(dāng)調(diào)節(jié)來(lái)自 光源313的照明光的亮度.通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)對(duì)焦柄318在上下方向上移動(dòng)栽 物臺(tái)317，對(duì)焦并進(jìn)行觀察.
在本實(shí)施方式的觀察方法中，觀察目標(biāo)和上述反射面的距離d最 好滿足下述公式(1).
"W/ (2NA2) …(1)
(式中d表示觀察目標(biāo)和反射面的距離，W表示觀察中所用光的波 長(zhǎng)，NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑.)
觀察目標(biāo)和反射面的距離d能夠通過(guò)調(diào)節(jié)媒質(zhì)的密度來(lái)調(diào)整.例 如，如果觀察目標(biāo)比媒質(zhì)密度高，觀察目標(biāo)通過(guò)重力作用自動(dòng)地沉淀 于培養(yǎng)皿312的底部，接近在此處的反射面.
進(jìn)而，通過(guò)滿足上述公式，對(duì)能夠以良好的對(duì)比度進(jìn)行觀察的的 原理作如下說(shuō)明.滿足上述公式時(shí)，在觀察的光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)深度的 約一半以內(nèi)的距離、接近反射面設(shè)置觀察目標(biāo).并且，透過(guò)觀察目標(biāo) 一次的入射波陣面，大致不變形，再一次通過(guò)觀察目標(biāo).由此，特別 在觀察目標(biāo)的一端射出波陣面清晰地彎折.因此，能夠以良好地對(duì)比 度對(duì)觀察目標(biāo)的像進(jìn)行觀察.下面，以模型進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明.
圖11示出使用以下計(jì)算模型時(shí)的進(jìn)行成像模擬的結(jié)果該計(jì)算模 型將細(xì)胞302作為直徑4pm、高度2pm的旋轉(zhuǎn)橢圓體，將細(xì)胞302的 折射率定為1.4,培養(yǎng)液301的折射率定為1. 33.另外，圖ll是成像 的略圖.在此，521是中心線，522是中心線上的強(qiáng)度分布，5"是細(xì) 胞302的成像.觀察中使用的光的波長(zhǎng)為550n n.在本模擬中，落射照 明光往復(fù)兩次透過(guò)細(xì)胞302，因此，能夠按照?qǐng)D11 (b)所示，以明暗 清晰的對(duì)比度觀察細(xì)胞302的輪廓.另一方面，通過(guò)現(xiàn)有的透過(guò)觀察 方法對(duì)相同條件的細(xì)胞302進(jìn)行觀察時(shí)，進(jìn)行成像模擬的結(jié)果如圖11 (c)所示，細(xì)胞302的輪廊不清晰.
但是，細(xì)胞302和反射鏡涂層307的距離拉大時(shí)，細(xì)胞像的對(duì)比 度下降，在本實(shí)施例中的觀察光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)深度A由以下的公式求 得.厶-W/N A2 - 0. 55/imZO. 452 = 2.
(式中W表示使用光的波長(zhǎng)，NA表示反射觀察顯微鏡311中安裝的 物鏡306的數(shù)值孔徑.)
即，焦點(diǎn)深度厶的一半^為1.4Mm.圖12 (b) ~ (f)中示出使 用以下計(jì)算模型的成像模擬的結(jié)果該計(jì)算模型如困12 (a)所示，改 變細(xì)胞302和反射鏡涂層307之間的距離.距離d分別為(b) lpm、 (c)1.2pm、 (d)1.4Mm、 (e)1.6Mm、 (f)1.8nm,如圖所示，隨 著距離d由lpm開(kāi)始增加，細(xì)胞302的輪廊的對(duì)比度降低，距離d超 過(guò)1.4Mm時(shí)幾乎就不能看見(jiàn).
由上述可知細(xì)胞302與反射鏡涂層307的間隔最好為焦點(diǎn)深度A 的約一半以下.
另外，在本實(shí)施方式的一例中，觀察目標(biāo)與反射面的距離d最好 滿足以下的公式(2).
d>F/ (4 t a n (s i n"NA)) …(2)
(式中d表示觀察目標(biāo)與反射面的距離，F(xiàn)表示對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀 察的光學(xué)系統(tǒng)的視場(chǎng)直徑，NA表示對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的光學(xué)系統(tǒng)的 數(shù)值孔徑，)
使用圖3 (A2)所示的觀察工具時(shí)，由于重力觀察目標(biāo)位于覆蓋玻 璃5上，因此通過(guò)加工調(diào)節(jié)收存部2的槽的深度a，能夠調(diào)節(jié)觀察目標(biāo) 和反射面的距離d.
另外，圖1 (c)的觀察工具等情況，通過(guò)加工調(diào)節(jié)收存部槽的深 度，從而調(diào)節(jié)槽的底面與反射面的距離，所以能夠調(diào)節(jié)觀察目標(biāo)與反 射面的距離，圖2 (B)的觀察工具等的情況，通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)體40的厚
度能夠調(diào)節(jié)觀察目標(biāo)和反射面的距離，
另外，觀察目標(biāo)和反射面的距離d可以通過(guò)調(diào)節(jié)媒質(zhì)的密度進(jìn)行 調(diào)整.例如，如果觀察目標(biāo)比媒質(zhì)密度小，觀察目標(biāo)自動(dòng)地由培養(yǎng)皿 312的底部離開(kāi)，與在該處的反射面相距一定的距離.
另外，由于滿足上述計(jì)算公式2，對(duì)能夠以良好的對(duì)比度進(jìn)行觀察 的原理進(jìn)行如下說(shuō)明.滿足上述計(jì)算公式2時(shí)，反射面在某種程度上遠(yuǎn)離觀察目標(biāo).實(shí)際上照明光的數(shù)值孔徑降低.所以，能夠以良好的 對(duì)比度觀察物體.
更具體的，考慮以下情況如圖13所示，在物鏡1006的焦點(diǎn)位 置處配置物體1002，與物體1002相距d的位置上配置具有反射面1007 的反射鏡1049,以落射照明觀察物體1002.由物鏡1006直接照射物 體1002附近的照射區(qū)域1009通過(guò)物鏡1006或者含由物鏡的光學(xué)系統(tǒng) 的規(guī)格被直徑F限制.由物鏡1006射出、透過(guò)物體1002近旁一次、 由反射面1007反射，再次照射物體的照明光通過(guò)反射面1007的鏡像 作用，猶如照射區(qū)域1009的鏡像1009'成為光源面對(duì)物體1002進(jìn)行 照射.此時(shí)，由物體1002來(lái)看的照射光的最大角度6 i-max由下式給
tan 6 i一max - F/ (4d)…(3 ) 因此，對(duì)于物體1002實(shí)質(zhì)的照射光的數(shù)值孔徑sin 6 i-max由公式
sin6 i_max = sin(tan—!F/(4d)) …(4) 給出.這如果是比物鏡1006的數(shù)值孔徑NA小的條件
NA>sin6i-max…算式5
即
d>F/ (4tan (sin'NA)) …(2) ，實(shí)質(zhì)照明光的數(shù)值孔徑就比物鏡的數(shù)值孔徑小，物體1002的觀察像 的對(duì)比度得到提高.
照明光的數(shù)值孔徑比物鏡的數(shù)值孔徑小時(shí)，通過(guò)圖14對(duì)計(jì)算物體 的觀察像對(duì)比度提高的狀況的模擬例進(jìn)行說(shuō)明.圖14(a)示出在培養(yǎng) 液1101中的細(xì)胞1102的計(jì)算模型，細(xì)胞1102作為直徑5pm、厚度2 Hm的旋轉(zhuǎn)橢圃體。細(xì)胞的折射率定為1.4,培養(yǎng)液的折射率定為1.33. 照明光的波長(zhǎng)定為550nm,物鏡的數(shù)值孔徑定為0. 45,圖14 ( b ) ~ ( f ) 示出以下計(jì)算例照明光的數(shù)值孔徑為物鏡的數(shù)值孔徑的(b) IOOX、 (c) 80%、 (d) 60%、 (e) 40%、 (f ) 20%.可知隨著照明光的數(shù)值孔徑變得比物鏡的數(shù)值孔徑小，物體像的對(duì)比度提高.
其次說(shuō)明作為應(yīng)用本發(fā)明的第三實(shí)施方式的微小流徑觀察裝置. 第三實(shí)施方式的微小流徑觀察裝置以觀察目標(biāo)收存部為特征，適用于
細(xì)胞的移動(dòng)的觀察.
觀察目標(biāo)收存部如困15所示，具有微小流徑612.微小流徑612 構(gòu)建在硅襯底631上.在本實(shí)施方式中，通過(guò)未圖示的倒立型落射照 明顯微鏡由下方對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察.困15中的606表示物鏡.
微小流徑612中設(shè)置一個(gè)入口 632、 3個(gè)出口 633.入口 632和出 口 633在微小流徑612內(nèi)部相連接.微小流徑612以如下方法制造 使用半導(dǎo)體制造技術(shù)，在硅襯底上進(jìn)行由氣化硅634的圖形的形成， 以玻璃板635作為蓋子來(lái)復(fù)蓋該模型.
另外，氧化硅634的膜厚形成與細(xì)胞602大致相同的厚度.因此， 細(xì)胞602通過(guò)微小流徑612時(shí)，細(xì)胞602處于幾乎與硅襯底表面607 相接觸的狀態(tài)，所以能以良好的對(duì)比度觀察細(xì)胞602的輪廊.
進(jìn)而，形成與該微小流徑612的入口 632連接、細(xì)胞滯留的部分， 可以使微小流徑612中流動(dòng)的細(xì)胞602作暫時(shí)停留。此時(shí)，細(xì)胞滯留 部分的硅襯底開(kāi)一個(gè)深孔，由此，以該部分作為反射面進(jìn)行作用的硅 襯底的表面遠(yuǎn)離玻璃板635,如上所作，在該細(xì)胞滯留部分中，實(shí)質(zhì)的 照明光的數(shù)值孔徑降低，所以能夠以良好的對(duì)比度觀察位于細(xì)胞滯留 部分中的細(xì)胞602.
另外，如圖所示，微小流徑612中安裝由電壓控制裝置650、可變 電壓發(fā)生裝置660以及兩個(gè)電極665構(gòu)成的電場(chǎng)發(fā)生裝置.兩個(gè)電極 665安裝在微小流徑612的側(cè)面，對(duì)微小流徑612側(cè)面施加電連接的可 變電壓裝置660產(chǎn)生的電壓，因此使微小流徑內(nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng).可變電 壓發(fā)生裝置660與電壓控制裝置電連接，基于利用未招示的倒立型落 射顯微鏡的細(xì)胞602的觀察方法，控制可變電壓發(fā)生裝置660產(chǎn)生的 電壓，來(lái)分配細(xì)胞602的前進(jìn)方向向三個(gè)出口 663中的哪一個(gè)方向去. 多個(gè)細(xì)胞602由入口 632順次流入微小流徑612內(nèi)，通過(guò)物鏡606進(jìn) 行反射觀察。硅襯底的表面607作為反射面而使用，能夠以良好的對(duì) 比度觀察微小流徑612內(nèi)的細(xì)胞602.基于該觀察的信息，電場(chǎng)發(fā)生裝 置變換微小流徑612內(nèi)的電場(chǎng)強(qiáng)度.由內(nèi)部的電場(chǎng)強(qiáng)度控制前進(jìn)方向， 使微小流徑612內(nèi)的細(xì)胞602區(qū)分三個(gè)出口 633放出.這樣，如果使用本實(shí)施方式的微小流徑觀察裝置，作為細(xì)胞602 的觀察單元使用了落射照明顯微鏡，能夠在硅襯底631上構(gòu)建微小流 徑612.硅襯底631上的微小流徑由于能夠嵌用半導(dǎo)體制造技術(shù)，所以 與現(xiàn)有的玻璃襯底上構(gòu)建微小流徑的情況相比，能夠以低價(jià)大重地生 產(chǎn).進(jìn)而，與現(xiàn)有的使用特殊顯微鏡的觀察方法相比，不需透射照明 裝置，使保持微小流徑612的栽物臺(tái)簡(jiǎn)化等，使觀察裝置整體小型化，
同時(shí)低價(jià)構(gòu)建成為可能，
另外，在上述第三實(shí)施方式中，同第二實(shí)施方式中說(shuō)明的一樣， 觀察目標(biāo)和反射面(鏡面)的距離滿足公式(1)及公式(2)為好.
以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行了說(shuō)明.
在上述實(shí)施方式中，能夠以良好的對(duì)比度對(duì)現(xiàn)有的非常難以觀察 的微小透明物體進(jìn)行觀察.
另外，若按照上述實(shí)施方式，因?yàn)椴恍枰糜谕干湔彰鞯墓鈱W(xué)系 統(tǒng)，所以具有可能謀求觀察裝置整體的小型化的優(yōu)點(diǎn).另外，具有以 下優(yōu)點(diǎn)即使物體移動(dòng)困難的情況，通過(guò)觀察裝置整體的移動(dòng)，能夠 容易地調(diào)整物體觀察部位. 若按照上述實(shí)施方式，通過(guò)在容器內(nèi)設(shè)置反射面，能夠容易地實(shí) 現(xiàn)物體接近反射面的狀態(tài).另外，在玻璃器皿的底面設(shè)置反射鏡，在 該玻璃器皿中注入含有觀察的物體的媒質(zhì)時(shí)，物質(zhì)如果比媒質(zhì)密度大，
由于重力作用物質(zhì)自動(dòng)地沉淀到玻璃器皿地底部，接近于在該處的反 射面，
另外，本發(fā)明并不限定于上述的實(shí)施方式，在該要點(diǎn)的范閨內(nèi)的 各種變形都是可能的，
(實(shí)施例)
圖18示出使用圖3 (2A)所示的觀察工具、由下方觀察攝影細(xì)胞 情況的照片，使用的觀察工具為結(jié)構(gòu)體l由硅晶片構(gòu)成，復(fù)蓋玻璃5 和反射面的距離a為5 im.另外，攝影條件如下.
攝影機(jī)器CCD數(shù)字影像攝像機(jī)CL-211H (Watec America Co.， Las Vegas, Nev )
照射裝置EPI-U(Nikon Kawasaki, Japan) 物鏡x20培養(yǎng)液使用RPMI1640緩沖液中加入20mMHEPES以及0. 1%牛血清蛋
白質(zhì)的培養(yǎng)液. 細(xì)胞嗜酸性白血球
對(duì)于人血液中的顆粒白血球劃分，使用通過(guò)由抗CD16抗體結(jié)合的
磁性塊的陰極選擇精選的嗜酸性白血球，另外，磁性塊中使用動(dòng)力學(xué)
磁性粒子集中器(Dynal A. S, ， Oslo, Norway),按照產(chǎn)品所附的使
用方法搮作.
如圖18所示可知，能夠以良好的對(duì)比度對(duì)微小透明物體、即酸性 白血球以及細(xì)胞內(nèi)的顆粒進(jìn)行觀察.
權(quán)利要求
1. 一種觀察工具，該觀察工具使用于通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由落射照明光照明，并對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的方法中，該觀察工具是由結(jié)構(gòu)體構(gòu)成的觀察目標(biāo)收存用的觀察工具，其特征在于上述結(jié)構(gòu)體具有用于同時(shí)保持觀察目標(biāo)和溶液的槽，在上述槽的底面上設(shè)置觀察時(shí)反射上述落射照明光的反射面，上述反射面是平面。
2. —種觀察工具，該觀察工具使用于通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由 落射照明光照明，并對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的方法中，該觀察工具是由透 過(guò)上述落射照明光的結(jié)構(gòu)體構(gòu)成的觀察目標(biāo)收存用的觀察工具，其特征 在于上述結(jié)構(gòu)體具有用于同時(shí)保持觀察目標(biāo)和溶液的槽， 在與設(shè)置上述槽的面不同的面上設(shè)置觀察時(shí)反射上述落射照明光 的反射面，上述反射面是平面.
3. —種觀察方法，該觀察方法使用由結(jié)構(gòu)體構(gòu)成的觀察目標(biāo)收存 用的觀察工具，通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由落射照明光照明、并對(duì)觀察 目標(biāo)進(jìn)行觀察的觀察方法，其特征在于上述觀察目標(biāo)是微小透明體，上述結(jié)構(gòu)體具有用于同時(shí)保持觀察目標(biāo)和溶液的槽， 在上述槽的底面設(shè)置觀察時(shí)反射上述落射照明光的反射面， 使用上述觀察工具對(duì)上述微小透明體進(jìn)行觀察，上迷微小透明體設(shè) 置在距上述反射面特定的距離處， 上述反射面是平面.
4. 一種觀察方法，該觀察方法是使用由透過(guò)照明光的結(jié)構(gòu)體構(gòu)成 的觀察目標(biāo)收存用的觀察工具，通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由落射照明光 照明、并對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的觀察方法，其特征在于上述觀察目標(biāo)是微小透明體，上述結(jié)構(gòu)體具有用于同時(shí)保持觀察目標(biāo)和溶液的槽， 在與設(shè)置上述槽的面不同的面上設(shè)置觀察時(shí)反射上述落射照明光 的反射面，使用上述觀察工具對(duì)上述微小透明體進(jìn)行觀察，上述微小透明體設(shè)置在距上述反射面特定的距離處， 上述反射面是平面.
5， 一種觀察方法，該觀察方法使用由結(jié)構(gòu)體構(gòu)成的觀察目標(biāo)收存 用的觀察工具，通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由落射照明光照明、并對(duì)觀察 目標(biāo)進(jìn)行觀察的觀察方法，其特征在于上述觀察目標(biāo)是微小透明體，上述結(jié)構(gòu)體具有用于同時(shí)保持觀察目標(biāo)和溶液的槽， 在上述槽的底面設(shè)置觀察時(shí)反射上述落射照明光的反射面， 使用上述觀察工具，對(duì)直接配置在上述反射面上的上述微小透明體 進(jìn)行觀察，上述反射面是平面.
6. 根據(jù)權(quán)利要求3中的觀察方法，其特征在于 上述微小透明體是細(xì)胞， 上述液體是培養(yǎng)液.
7. 根據(jù)權(quán)利要求3中的觀察方法，其特征在于 在上述觀察工具中收存上述微小透明體，以使上述微小透明體和上述反射面的距離在上述光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)深度的一半以下.
8. 根據(jù)權(quán)利要求3中的觀察方法，其特征在于 在上述觀察工具中收存上述微小透明體，以使上述微小透明體和上述反射面的距離d滿足以下公式(l)，<formula>formula see original document page 3</formula> …(1)其中，式中d表示觀察目標(biāo)與反射面的距離，w表示觀察中使用的光的波長(zhǎng)，NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3中的觀察方法，其特征在于 在上述觀察工具中收存上述微小透明體，以使對(duì)于上述微小透明體的照明光的數(shù)值孔徑比物鏡的數(shù)值孔徑小.
10. 根據(jù)權(quán)利要求3中的觀察方法，其特征在于 在上述觀察工具中收存上述微小透明體，以使上述微小透明體與上述反射面的距離d滿足以下公式(2)，d>F/(4tan (si n-1NA)) …(2)其中，式中d表示觀察目標(biāo)與反射面的距離，F(xiàn)表示光學(xué)系統(tǒng)的視 場(chǎng)直徑，NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑.
全文摘要
本發(fā)明不使用特殊觀察法中需要的特殊調(diào)制元件、并且可以簡(jiǎn)便地對(duì)細(xì)胞等透明的微小物體進(jìn)行觀察。本發(fā)明提供一種通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由落射照明光照明、對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的觀察方法中使用的觀察目標(biāo)收存用的觀察工具，其具有觀察時(shí)對(duì)落射照明光進(jìn)行反射的反射面。反射面設(shè)置在與物鏡對(duì)置的面或者對(duì)置的面的相反面。觀察工具具有保持液體的容器。使用上述觀察工具，同時(shí)觀察細(xì)胞等和培養(yǎng)液。
文檔編號(hào)G02B21/06GK101419334SQ20081014975
公開(kāi)日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2004年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月27日
發(fā)明者林真市, 金崎士朗 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Eci